（植物学专业论文）蓝猪耳磷脂酶c基因tfplc1和tfplc2的克隆及分析.pdf

摘要 肌醇磷脂信号途径广泛参与生物体内多种细胞信号转导过程。动物方面的研究表明该信号途 径在受精和早期胚胎发育过程中起重要作用。精卵融合活化磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c ( p l c ) ，作 用于磷脂酰肌醇4 ，5 二磷酸( p i p 2 ) ，使其水解产生二酯酰甘油g ) 和三磷酸肌醇( i p 3 ) i p 瓶女发卵细 胞胞内钙库钙释放产生钙波，从而使卵细胞激活。在哺乳动物的精、卵细胞中均发现特异表达的 p l c 异型体，这此- p l c 基因是完成受精和早期胚胎发育所必需的。 肌醇磷脂信号途径在植物方面的研究目前大多集中在植物对逆境信号反应方面。比如：植物 对渗透胁迫、a b a 、光、重力、病原侵染的反碰均涉及肌醇磷雅信号系统，但p l c 在植物有性 生殖方面的研究还很少。本实验选用具有裸露胚囊的玄参科植物蓝猪耳为材料，克隆胚珠表达的 p l c 基因以探索p l c 在植物有性生殖过程中的作用。 利用同源克隆的方法，应用r a c e 和r t - p c r 技术，我们从蓝猪耳胚珠中克隆到2 条磷脂酶 c 基因，分别命名为t j v l c l 和t f p l c 2 。t f p l c i 全长共2 1 7 1 b d ，编码5 8 3 个氨基酸，7 y e l c 2 全陈共2 1 1 0 b p ，编码6 0 1 个氨基酸。t f l l c l 和t f p l c 2 都具有典型的e f 手形区、x 保守区、y 保守区和c 2 结构域。t f p l c l 氨基酸序列与烟草p l c 的同源性最高，为7 4 ，而t f p l c 2 氨基 酸序列则与马铃薯p l c l 同源性最高，为6 3 。t f p l c l 和t f p l c 2 之间氨基酸的同源性为5 6 。 n o r t h e r n 杂交结果显示，t j p l c 在胚珠中优势表达。我们克隆了蓝猪耳t f p l c i 长约为l t 3k b 的启动子，t f p l c lp r o m o t e r ：g u s 转化蓝猪耳实验表明，t f p l c l 主要在胚珠、柱头、以及成熟 的花粉中表达。而且随着柱头发育时期不同，g u s 表达活性也不同，在开花后两天柱头张开时期， 表达量最高。以t f p l c i 特异区段原核表达融合蛋白，用纯化后约1 7 k d 的融合蛋白免疫兔子， 获得了特异识别t f p l c l 蛋白的抗体。利用纯化的抗体进行免疫杂交，结果发现t f p l c l 主要在 柱头授粉面的乳突细胞基部中表达，而在柱头的背面细胞表达量相对较低。推测t f p l c l 可能参 与了胚珠发育以及授粉受精的过程。为了研究t j t o l c l 的功能，我们利用t j p l c l 的特异区段构建 了r n a i 表达载体，得到了转基因植株，为研究t f e l c 在蓝猪耳胚珠发育以及受精过程中的功 能奠定了基础。 n o r t h e r n 杂交结果显示，t f p l c 2 主要在营养器官表达，如叶、茎和根，而在生殖器官中表达 量较低。t f p l c 2 受盐等逆境胁迫以及a b a 的强烈诱导。利用t f p l c 2 的特异区构建了r n a i 表 达载体，得到了转基因植株。半定量p c r 结果表明，转基因植株中r f p r , c 2m r n a 表达量降低。 在干旱条件下，t o 代离体叶片失水率比野生型高。在盐胁迫的情况下，t 1 代幼苗与野生型相比 叶片边缘出现较大面积的白斑，证明t j v l c 2 可能以依赖于a b a 的方式参与逆境胁迫下的信号转 导。 关键词：蓝猪耳磷脂酶c 雌蕊r n a 干扰胁迫 a b s t r a c t p l c i p 3s i g n a lp a t h w a yi sw i d e l yi n v o l v e di nc e i ls i g n a lt m n s d u c f i o n t tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n e a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n ta n df e r t i l i z a t i o ni na n i m a l s s p e r m - e g gf u s i o na c t i v e sp h o s p h o i n o s i t i d e s p e c i f i cp h o s p h o l i p a s ec ( p l c ) w h i c hc a l lh y d r o l y x ep h o s p h a f i d y li n o s i t o l4 ，5 一b i s p h o s p h a t e ( p i p z ) i n t o t w os e c o n d a i r ym e s s e n g e r s ，i n o s i t o l1 ，4 ，5 - t r i p h o s p h a t e ( i p s ) a n dd i a c y l g l y c e r o l ( d g ) 1 p st r i g g e r s r e l e a s eo f c a 2 + f r o m i n t r a c e l l u l a rs t o r e s i n t h ee g g a n d g e n e r a t e s c a 2 + o s c i l l a t i o n ，w h i c ha l e p r e r e q u i s i t e f o re g gd e v e l o t m j e n t d i f f e r e n ti s o f o m k so ff l ca r ef o u n di ns p e c i f i ce x p r e s s i o nm a n n e r si ne g go r s p e r mo f m a m m a l w h i c ha r en e c e s s a r yf u rf e r t i l i z a t i o na n de a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n t s t u d i e sf o rp l c i p 3s i g n a lp a t h w a yi np l a n t si sm a i n l yo np l a n tr e s p o n s et os t r e s ss u c ha s h y p e r o s m o t i cs t r e s s ，a b a ，l i g h t ，g r a v i t ya n dp a t h o g e na t t a c k b u tl i t t l ei sk n o w na b o u tw h e t h e rt h e p h o s p h o l i p a s ect a k ep a r ti ns e x u a lp l a n tr e p r o d u c t i o no f a n g i o s p e r ms of a r w ec l o n e dp l cg e n e sf r o m t h eo v u l eo ft o r e n i a f o u r n i e r it oi n v e s t i g a t et h er o l eo f p l ci ns e x u a lr e p r o d u c t i o no f a n g i o s p e r m t w of u l l - l e n g t hp h o s p h o l i p a s ecg e n e , n a m e dt f p l c la n dt j p l c 2 ，w a sc l o n e db yr t - p c ra n d r a c eu s i n gt h ed e s i g n e dd e g e n e r a t ep r i m e r sf r o mt o r e n i af o u r n i e r io v u l e t h et f p l c ig e l l ei s 2 1 7 1 b p ，i n c l u d i n go n eo p e nr e a d i n gf r a m ee n c o d i n gp o l y p e p d d eo f5 8 3a m i n oa c i d s t h et f p l c 2g e u e i s2 11 0 b p ，i n c l u d i n go n eo p e nr e a d i n gf r a m ee n c o d i n gp o l y p e p t i d eo f6 0 1a m i n oa c i d s t h ea m i n oa c i d s e q u e n c ed e d u c e df r o mt h ee d n as e q u e n c ec o n t a i n st h ec h a r a c t e r i s t i cx ，ya n dc 2d o m a i n s t h e t f p l c ls h o w e d h i g h e s ts i m i l a r i t y ( 7 6 ) t o n i c o t i a n a m s t i c a p l c ，w h i l e t h e t f p l c 2s h o w e d h i g h e s t s i m i l a r i t y ( 6 3 ) t o s o l a n u mt u b e r o s u m p l c t h es i m i l i a r i t y b e t w e e n t f p l c ia n d t f p l c 2 i s5 6 ， t h et f e z c lg e n ew a sp r e d o m i n a n t l ye x p r e s s e di no v u l ea n dw a se x p r e s s e da tv e r yl o wl e v e l si n a l lo t h e r t i s s u e se x a m i n e d w ee m p l o y e da d a p t o r p c r t o i s o l a t e1 3k bs e q u e n c e i n t h e u p s t r e a mo f t h e t j p l c ig e n e t f p l c lp r o m o t e r ：g u st r a n s g e n ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt f p l c li se x p r e s s e ds p e c i f i c a l l y i no v u l e ，s t i g m aa n dm a t u r ep o l l e ng r a i n g u sa c t i v i t yi ns t i g m ai si n c r e a s e dw i t ht h ed e v e l o p m e n to f p i s t i l a n dg u sa c t i v i t yi ns t i g m ah a v eap e a l 【a tt w od a ya f t e rb l o o m t h ef u s i o np r o t e i no f t f p l c i - n i sw a se x p r e s s e di ne c o f ia n dt h ep u r i f i e df u s i o np r o t e i nw a su s e dt oh r u n u n i z en e wz e a l a n d r a b b i t s w e s t e r nb l o tr e s u l ts h o w e dt h es p e c i f i ca n t i b o d ya g a i n s tt f p l c l - no n l yr e c o g n i z et h et f l a l c i i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n a l y s i ss h o w e dt h a tt f p l c li sp r o d o m i n a n t l ye x p r e s s e di nt h ep a p i l l ac e l l so f s t i g m a w ep r e s u m e dt h a tt h et f p t c lm a y b ei n v o l v e di no v u l ed e v e l o p m e n t ，p o l l i n a t i o na n d f e r t i l i z a t i o n i no r d e rt or e v e a lt h ef u n c t i o no ft j p l c l ，w eg a i n e dg e n et r a n s g e n i ct o r e n i a f o u r n i e r ib y r n a it e c h n i q u e t h e s ew o r k sl a yf o u n d a t i o nf u rt h er e s e a r c ho nr e g u l a t i o no ft j p l c le x p r e s s i o na n d i t sf u n c t i o ni no v u l ed e v e l o p m e n ta n df e r t i l i z a t i o n t h et f p l c 2g e n ew a sp r e d o m i n a n t l yi nl e a f s t e ma n dr o o t t h ee x p r e s s i o no ft h et f p l c 2w a s s t r o n g l yi n d u c e du n d e rc o n d i t i o n so fh i g hs a l to ra b a t r e a t m e n t i no r d e rt or e v e a lt h ef u n c t i o no f t f p l c 2 ，w eg a i n e dt r a n s g e n i ct o r e n i a f o u r n i e r ib yr n a it e c h n i q u e q u a n t i t a t i v er t - p c ri n d i c a t et h a t t h em r n ad e c l i n e db yr n a ii nt r a n s g e n i ct o r e n i af o u r n i e r r a t eo fw a t e rl o s so fe x c i s e dl e a fi n t r a n s g e n i cp l a n ti sh i g h e rt h a nw tp l a n t u n d e rs a l ts t r e s sc o n d i t i o n ，b i g g e rw h i t es p o t sa p p e a rt o t h em a r g i no fe o t y l e d o no ft 1s e e d i n gt h a n 、tp l a n t t h er e s u t si n d i c a t et h a tt h er f e l c 2m a y b e t a k ep a r ti nt h es i g n a lt r a n s d u c f i o nt oa d a p tt os t r e s s k e yw o r d s ：t o r e n i a f o u r n i e r i ，p h o s p h o l i p a s ec ，p i s t i l ，p o l l e n ，r n a i ，s t r e s s i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：霹扮岛时间：糊年臼睁日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 时间：年月日 帆1 年叫曰 气 芬 私 第一章文献综述 1 1 植物中的肌醇磷脂信号途径 生物膜由双层磷脂及膜蛋白组成肌醇磷脂( i n o s i t o lp h o s p h o l o p i d , p t d l n s ) 是真核细胞中主 要的磷脂成分，其总量约占膜脂总量的1 0 左右肌醇磷脂是由磷脂酸与肌醇结合的脂质化合物， 分子中含有甘油、脂肪酸、磷酸和肌醇等基团，其肌醇分子六碳环上的羟基被不同数目的磷酸醑 化，主要以三种形式存在于植物质膜中：即磷脂酰肌醇( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l , p i ) 、磷脂酰肌醇4 磷酸( p h o s p h a f i d y l i n o s i t 0 1 4 - p h o s p h a t e , p 伊) 和磷脂酰肌醇4 , 5 - - 磷酸( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 4 , 5 - b i p h o s p h a t e ，p 毋2 ) ( 图1 - 1 ) 。 h5 图i - i 植物中存在的三种肌醇磷脂 ( a ) 磷脂酰肌醇；( b ) 磷脂酰肌醇4 磷酸口 ) ( c ) 磷脂酰肌醇4 ，5 _ 二磷酸妒i p 2 ) 2 0 世纪5 0 年代以前，人们把注意力集中在功能繁多的膜蛋白上，而脂质组分仅被看成是一 种惰性基质。2 0 世纪8 0 年代后期的研究表明，磷酸肌醇不仅是膜结构的成分，而且本身和裂解 产物是细胞与环境进行交流的重要信号分子，质膜中的某些磷脂，在植物细胞内的信号转导过程 中起了重要作用 肌醇磷脂信号途径是以肌醇磷脂代谢循环为基础，在相应磷脂酶的参与下进行的，磷腊酶根 据水解部位不同分别称为磷脂酶a j 、a 2 ，c 、d ( p l a l 、p l a 2 ，p l c ，p l d ) ，其水解部位如图 所示( 图1 - 2 ) 图i - 2 不同磷脂酶水解结构磷脂的部位( w 锄g 2 0 0 4 ) 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 p l a ：专一水解甘油骨架上的酰基链，水解产物为溶血磷脂和脂肪酸，溶血磷脂可以激活蛋 白激酶，从而调节h + - a t p a s c 磷酸化，参与到生长素引起的细胞伸长过程研究表明，在西葫芦 和向日葵的上胚轴，生长素刺激的p l a 2 活力升高可以由g 蛋白激活剂m o s t o p a r a n 部分代替，而 p l a 2 的阻断剂可以阻断生长素刺激的细胞生长( s c h e m e r , 1 9 9 5 。1 9 9 7 ) 另外，p l a 2 也可能参与 到亚麻酸转化为茉莉酸的过程中，从而参与防御反应( 孙大业等，2 0 0 0 p l c ：磷脂酶c 可以催，f t , p i p 2 下分解成三磷酸肌醇( i p 3 ) 和二酰甘油( d g ) 当外界的刺激 发生后。细胞膜上的受体感受外界刺激，激活g 蛋白，之后g 蛋白进一步激活磷脂酶c ，p i p 2 在磷 脂酶c 的催化下分解成口1 和d g ，i p ，和d g 作为两个胞内信使，分别启动两个信号传递途径即 i p 3 c a 2 + 希i d g p k c ( 蛋白激酶c ) 信号通路m 3 通过作用于内质网膜上特异的三磷酸肌醇受体使 胞内c a 2 + 库释放，引起胞内c a 2 + 水平的升高，从而启动胞内c a 2 + 信号系统，即通过依赖c a 2 + 、钙结 合蛋白( 如c a m ) 的酶的活性的变化来调节生理过程；d g 则通过激活p k c ，以磷酸化的形式对 许多蛋白质和酶类进行修饰，从而调控另一系列的生理过程( 图i - 3 ) ( 孙大业等，2 0 0 h 潘延云 等，2 0 0 5 ) p l d ：催化磷脂分子生成磷腊酸( p t d o h ) 和一个自由的磷脂分子头部基团。磷脂酸可以激 活下游的p i p 5 k i n a s e 、p l c ，p l a 2 等磷艏信号途径中的酶，也可能作为直接的信使代谢生成其他 的脂类调控因子，其头部也有调控功能。p l d 广泛参与到种子萌发、感受外界刺激和胁迫反应过 程中( f r a n ke ta l ，2 0 0 0 ；w a n g ，2 0 0 0 ) 一一霰茎 图i 3 植物肌醇磷脂信号系统可能的途径( 参照m u n n i k 矗a 1 1 9 9 8 ) 1 2 磷脂酶c 的结构 1 2 1 动物磷脂酶c 的结构特征 目前，哺乳动物中已确认1 2 种不同类型的p l c 异型体，这1 2 种类型异型体根据其不同的结 2 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 构和调控机制又分为5 大类：p 、t ，6 e 和( 图l - 4 ) 图1 4 动物中不同的磷脂酶c 的结构示意图( 参照s a u n d e r s ，2 0 0 2 ) p l c p 有眈队4 种亚型，p u 珂有t l 和住2 种亚型，p l c 8 有6 i 5 4 4 种亚型。p l c p ，p l c t 、p l c 5 和p l c e 的分子结构均包括4 个基本组分：p h 结构域、e f 手形区、c 2 区和催化区( r h e e , 2 0 0 1 ) ，而 p u ：只有e f 手形区、c 2 区和催化区，没有p h 结构域( s a u n d e r se ta l ，2 0 0 2 ) p h 结构域：含有约1 2 0 个氨基酸残基，位于p l c 的氨基末端，可以使酶与膜靠近，进而酶 可以与其作用底物如p 口2 特异结合( r e b e h ia n dp e n t y a l a ，2 0 0 0 ) 。 e 砰形区：位于p h 区和x 域之间，具有螺旋环一螺旋结构；该区域是c a 2 + 结合区域，将p i , c f l p 3 信号途径和i p 3 c a 2 + 信号途径联系起来e f 手形区域和x 、y 的紧邻表明其不仅起到结合c a 2 + 的作 用，也是酶的催化核心的一部分( r e b e c c h i a n d p e n t y a l a , 2 0 0 0 ) ，因为该区域缺乏可导致哺乳类 p i a 2 - 5 i 活性的丧失( n a k a s h i m ae ta l ，1 9 9 5 ) 在p 【c 中，e f 手型结构域部分缺失导致其对p i p 2 的 水解活性显著降低和c 矿震荡的消失；全部缺失，将导致p l c 活性完全丧失( k o u c h i c ta l , 2 0 0 5 ) 。 催化区：由氨基酸序列保守的x y 域组成，x 域含有大约1 7 0 个氨基酸，y 域含有大约2 6 0 个氮基酸残基同一亚型间同源性高达7 9 n , 4 。当蛋白折叠后，这两个区域靠近形成催化活性中心， 行使酶的催化功能( 孙大业等，2 0 0 1 ) c 2 区：大约有1 2 0 个氨基酸残基的长度，位于y 结构区的羧基末端下游部分在不同的p i a 2 亚型中，该结构域的大小和功能均有所差别( r e b e c c b ia n d p c n t y a a , 2 0 0 0 ) 1 2 2 植物磷脂酶c 的克隆、结构以及表达特征 根据作用底物的不同，植物磷脂酶c 可以分为三类：( 1 ) 水解磷酸肌醇的p l c ；( 2 ) 非特 异性p l c ；( 3 ) 水解锚定蛋白的糖基磷脂酰肌醇特异性p l c 。其中研究最多的是第一类一水解磷 酸肌醇的p l c 植物中存在p l c 多基因家族近年相继获得了一些植物的p l c 的c d n a 克隆1 9 9 5 年，从 受干旱和盐胁迫诱导的拟南芥中筛选到一个类动物p l c 8 的c d n a 克隆a t p l c i ( h i r a y a n me t a l 。1 9 9 5 ) 2 年后，又从拟南芥中克隆到一个在营养组织和花器官中组成型表达的p l c ，命名为 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 一t p l c 2 ( h i r a y a m ae ta l ，1 9 9 7 ) 后来通过测序发现拟南芥基因组中有9 种p l c ( h a r t w e c k ，1 9 9 7 ) m u e l l e r - r o e b e ta n dp i c a l ，2 0 0 2 ，h u n te ta l ，2 0 0 4 ) ，这些结果表明p l c 在植物中与在动物中一 样，具有多个异型体除了从拟南芥中克隆到了多条p l c 基因，也已经陆续从马铃薯( k o p k a e t a l ，1 9 9 8 ) 、烟草( p i c a le ta 1 1 9 9 7 ) 、水稻( s o n ge ta l , 2 0 0 2 ) 、豌豆( k i me ta l , 2 0 0 4 ) ，玉米( z h a i d a t , 2 0 0 5 ) 、百合( p a n e t a l 2 0 0 5 ) 、小立宛藓( m i k a m i e t a l ，2 0 0 4 ) 以及矮牵牛( d o w d e t a l ， 2 0 0 0 克隆到了p i e 基因 序列分析表明，植物p l c 的结构都与动物中的p l c 类相似都具有e f 手型结构域、x 结 构域、y 结构域以及c 2 结构域，但是不含p h 结构域。其中砥y 区和c 2 区与哺乳动物相似 ( s a t m d e r se t a l , 2 0 0 2 ) ，但e f 手形区域却有些不同实验表明，拟南芥一个p l c 异型体a t p l c 2 ， 主要结合在质膜区域，其n 端保守区域可能代表了一个e f 手形区域，该区域若缺乏前3 6 个氨 基酸，则没有活性；而缺乏前2 2 个氮基酸则对活性没有影响这些证据表明这个区域和动物p l c 的e f 手形区域的第2 个环相似( o t t e r h a g e ta l 2 0 0 1 ) p i e 各异型体在植物中的表达具有组织特异性，并且在不同发育阶段，不同环境条件下表达 也各不相同拟南芥a t p l c i a 在正常情况下表达量非常低，在外源激素诱导或环境胁迫时表达量 明显增加( s i r a y a m ae ta l ，1 9 9 5 ) ；a t p l c 2 在各生长阶段及各组织都有表达，为组成型表达( h i r a y a m a c ta l ，1 9 9 7 ) 。马铃薯中3 个p l c 异型体在花、茎、叶柄中都有稳定表达，s t p l c l 在根中的表达 量是叶表面表达量的l o 倍。在受伤或干旱时，s t p l c i 表达量下降，而s t p l c 2 显著增加，而p 工c 3 仅有少量增加( k o p k ae ta l ，1 9 9 8 ) 。说明不同的异型体在植物的生长发育及对外界环境的反应中有 不同的作用，也表明p l c 在植物的生长发育及对环境因子的反应中具有重要的作用。 1 3 植物磷脂酶c 参与的信号途径 p l c 水解产生第二信使的功能以及它与c a 2 + 的相互调节作用表明了它参与到很多的生理过 程信号传导途径中有关其生理功能的研究也很多，开始时大多采用药理学手段，如利用其特异 性抑制剂或者激活荆处理实验材料，研究p i e 途径中组分的变化以及生理现象等近年来，随着 分子生物学的发展，克隆了越来越多的p i e 基因，通过分子生物学的手段来研究p l c 的功能 越来越多的证据表明。p i e 参与到植物的生长发育过程的各个阶段，在生长发育过程中具有重要 的功能 1 3 1 参与尖端生长的调节 花粉管和根毛是具有高度极性和快速顶端生长的细胞研究表明，根毛和花粉管的生长均 需要c a 2 + 的参与m 3 可以启动细胞内的c a 2 + 信号，而m 3 是o p l c 催f f a , n , 2 分解产生，p i p 2 又可以 结合前纤维蛋白。所以肌醇磷脂信号系统参与植物极性生长很多研究是围绕这这个过程展开的 在根毛顶端的钙离子流是控制根毛定向生长机制中的一部分当人为的增加顶端一侧的钙 离子浓度时。根毛将重新开始确定生长的方向。另外微管也控制着根毛生长的方向同样，花粉 管顶端局部区域游离钙浓度的变化引起了不对称钙通道活性，从而控制了花粉管的生长方向，而 钙减少部位有利于花粉管向反方向弯曲( m a l h oe t a t , 1 9 9 4 ；m a l h oe t a l 。1 9 9 8 ，m o n t e i r o ，2 0 0 5 ) d o w de ta l ( 2 0 0 6 ) 发现，p e t p l c i 可以调节p 口2 从而影响a c t i n 的分布，从而从基因水平上证明p l c 4 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 参与植物的极性生长 p 耽可以与许多a c t i n 结合蛋白互作，可能参与到生长的管状结构的细胞骨架的动态变化中 b r a u n c t a l 0 9 9 9 ) 在研究中发现前纤维蛋白的特异性分布与它的配体之一p 口z 的分布相关，均位 于根毛细胞形成根毛的突起部位在体内，信号分子p i p 2 与前纤维蛋白结合后就不能被未活化的 p l c 水解，但p l c 被磷酸化后，它就能克服前纤维蛋白对p i p 2 的保护而使它水解( g o l d s c h m i d t - c l e r m o n t 矗a l ，1 9 9 1 ) 进一步实验发现p l c 专一抑制剂u 7 3 1 2 2 抑制e o f d i n 去磷酸化，使它不能与肌 动蛋白结合，并且不能从胞质转移至细胞膜上表明p l c 可能通过调控c o f i l i n 的磷酸化和定位进 而影响根毛的生长( m a t s u ic ta l ，2 0 0 1 1 在研究花粉管发育过程中发现，百合( l i l i u ml o n g g i f l o r u m ) 花粉笛存在肌醇磷脂依赖的p l c 活性( h e l s p e x e ta l ，1 9 8 7 ) f r a n k l i n - t o n ge ta l ( 1 9 9 6 ) 发现虞美人花粉管上依赖钙离子的磷脂酶c 活性可以被新霉素抑制可诱导i p 3 产生的物质m a s t o p a r a n 同样可诱导钙离子的释放，这个过程 被新霉素抑制这些表明，花粉管中存在、信号利用p l c 的抑制剂u - 7 3 1 2 2 处理百合和蛇莓 ( d u c h e s n e ai n d i c a ) 花粉，发现花粉的萌发受到抑制；用口，受体的专一性抑制剂肝素处理花粉 能明显抑制其萌发和生长( 马力耕等，1 9 9 8 ) 将肌醇磷脂系统中重要组成成分及其抗体显微注 射到花粉管中，结果发现分别显微注射动物来源p l c i b i 3 抗体、动物来源的啦受体i i 、受体 的抗体都显著抑制花粉管的伸长生长，而分别注射p 【q 陋抗体、3 受体i 对花粉管伸长没有影 响；显微注射) 3 可显著促进花粉管的伸长生长( 王昕等，2 0 0 0 ) 上述结果表明三磷酸肌醇信 号系统可能参与到花粉管的生长调节 1 3 2 参与激素信号转导 植物中的五大类激素在植物生挺过程中起到极其重要的作用，它们参与到植物的生长发育的 全部过程中，对于磷脂酶c 与植物激素的关系也引起了人们的关注。 s t a x o nda 1 ( 1 9 9 9 ) 在研究气孔保卫细胁r j a b a 的反应时发现：p l c 抑制剂u - 7 3 1 2 2 可以抑 制a b a s i 起的钙振荡和气孔关闭，从而证明p i c 参与n a b a 信号转导途径中。s a n c h c z 和c h u a 的 研究表明：在表达反x a 垆l c l 基因的转基因拟南芥中，a b a 不能抑制种子萌发和植株生长；但 a t p l c l 过表达不会诱导a b a 调节基因的表达，因此爿p 工a 可能作为a b a 信号的次级信号参与到 种子萌发和植株的生长发育过程中( s a n c h e ze ta l 2 0 0 1 ) h u n t 矗a i ( 2 0 0 3 ) 通过转基因技术使烟 草保卫细胞中p l c 水平下降，结果发现，p l c 低表达的转基因烟草的气孔对a b a 的反应相比野生 型明显不敏感，研究还发现p l c 在a b a 抑制气孔张开的过程中发挥作用，但在_ a b a 诱导的气孔关 闭反应中不起作用 a l e x a n d e r da l ( 2 0 0 4 ) 用同源重组的方法构建了小立宛藓印税a 缺失突变体，研究发现， 它对细胞分裂素的敏感性缺失，配子托不能形成，因此认为它是细胞分裂素信号转导过程中的基 本成分 磷酸肌醇c a 2 + 信号传导途径在禾谷类糊粉层细胞g a 响应事件中起重要作用许多研究指 s g a 3 刺激大麦和水稻糊粉层中、的形成。新霉素在缺乏外源c a 2 + 条件下可明显降低水稻种子 的萌发速度并抑制g a 诱导的a 2 淀粉酶基因的表达，同时减少了糊粉层和盾片组织中形成的 3 而添加了外源c a “后，其对a 2 淀粉酶活性的抑制作用被去除( k a s h e mda l , 2 0 0 0 ) 研究还指出单 s 中国农业大学博士学位论文第一章文献综迹 独使用a b a 不改变、水平，但可阻碍g a 诱导、形成并且糊粉层细胞中膜结合p l c 分子的 表达受g a 的诱导，这种诱导作用也受到g a 的调控。用g a 处理大麦糊粉层细胞可以引起) 3 含量上 升，而用u 7 3 1 2 2 处理后则可以抑制由g a 引起的啦含量上升，由此看见磷脂酶c 可能参与到糊粉 层细胞的g a 信号途径中( v i l l a s u s oe ta 1 2 0 0 3 ) 豌豆- ( p s u ms a t i m t m ) 叶肉原生质体在g a 3 1 均处理 下，体积可以膨大9 0 ，而用u 7 3 1 2 2 处理可以抑制由g 籼引起的体积膨大，这证明磷脂酶c 可以 参与g a 3 ；i 起的原生质体体积膨大的信号途径( k o l l ae ta i , 2 0 0 4 ) 。 由以上研究结果可见，磷脂酶c 广泛参与到植物激素信号转导过程中。i g ne ta l ( 2 0 0 4 ) 用基 因芯片技术研究发现，在生长素的处理下，拟南芥4 t p l c s _ k 调，而此a 和爿兕a 外调；在细 胞分裂素的处理下，a t p l c l 、a t p l a 和4 t p l c tf 调，a t p l c l 4 和a 皿a j 则下调；磷脂酶c 对a b a 的反应也不一样，a t p l c l 和i a t p l c si - 调，而爿t p l c ，下调；在赤霉素的处理下，a t p l c 2 ，a t p l c 3 、 4 护“，和4 t p l c i j 下调。由此我们可以看出，同一种磷脂酶c 对不同激素的反应不同，而不同的 激素也可以引起不同的磷脂酶c 改变。 1 3 3 参与胁迫反应 磷脂酶c 参与植物逆境信号转导过程研究的资料积累得比较多。现在已经发现，磷脂酶c 广泛参与到渗透压改变、冷、干旱、高温、高盐反应过程中 将拟南芥培养细胞进行渗透胁迫处理，发现无论是甘露醇，n a c i 或是脱水都能引起细胞中 3 水平的急速升高，而p l c 抑制剂u - 7 3 1 2 2 处理可以抑制如的增高。p 2 在高渗透压刺激后 也迅速增加，但是上升速率远不如口，结果表明，、的增加是由于胁迫刺激诱导的p l c 活性增 强，而不是来自p 、的增加。这些结果表明p l c 参与了胁迫信号的信号传导( c h a p m a n ，1 9 9 8 ； d m b a k , 2 0 0 0 ；t a k a h a s h ie ta l ，2 0 0 1 ) r u e l l a n d 等( 2 0 0 2 ) 用拟南芥悬浮细胞体系实验表明，p l c 的激活是冷胁迫的信号传递链上 的早期事件，在冷胁迫开始的两分钟内，p l c 的作用产物、达到高峰，在l o 分钟时又回到对照 水平在冷胁迫下，a t p l c 6 转录水平升高，推测a t p l c 6 也参与拟南芥的冷胁迫反应o a ue t a i , 2 0 0 4 ) 基因方面的研究表明，拟南芥4 t p l c i s 正常生长条件下表达量非常低，但是在干旱或盐胁迫下 表达量急剧增加( h i r a y a m ae ta l ，1 9 9 5 ) 利用豌豆叶片研究了p i c 与叶片耐高温性的关系，发现 耐高温性在激活p l c 莽j p i p ：的活性前引发了自由s a 浓度的升高；免疫印迹结果表明一个6 6 _ s k d 的 p l c 参与到豌豆叶片耐高温性的形成过程中；施用p l c 抑制剂新霉素到豌豆叶片上，发现其对高 温的耐受性比对照差结果表明p l c 参与豌豆叶片抗高温胁迫形成高温耐受性的生理过程( l i ue t a l , 2 0 0 6 ) 而马铃薯中存在的三种p l c ，结果发现，s t p l c l 在伤害和干旱处理下，转录水平降低， 而s t p l c 2 在伤害和干旱处理下，转录水平急剧上升，证明其参与到逆境信号过程中( k o p k a 矗a l ， 1 9 9 3 ) 在绿豆中发现v r - p l c 3 在干旱和高盐胁迫下以不依赖于a b a 的方式积累( k i me la l ，2 0 0 4 ) 而玉米z m p l c 则在根中受盐，干旱的诱导( 压a ie ta l ，2 0 0 5 ) ，这些都说明磷脂酶c 广泛参与到逆 境胁迫的信号转导过程中 1 3 4 感受重力刺激 6 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 早期对植物感受重力的研究集中在c a 2 + 方面，而近年对这一过程的研究扩展到了肌醇磷脂系 统研究表明 3 和肌醇磷脂系统参与玉米受重力刺激引发的短期和长期的生理反应在玉米叶 枕的下半部分，重力刺激的1 0 s 内，i p 3 含量上升5 倍，在开始的3 0 m i n 后，在叶枕的上半部和 下半部可以看到、的振荡，因此、作为可扩散的第二信使玉米叶枕的细胞中起着传递和扩大信 号的作用( p e r e r a e t a l ，1 9 9 9 ) 应用离体培养的燕麦叶鞘发现，垂直生长的叶鞘由于重力的作用顶 端会弯曲，表现出向地性这个过程中，叶鞘组织玛浓度会发生变化在重力刺激的1 5 秒内。 叶枕的三磷酸肌醇超出了直立时的3 倍并且在开始几秒后在叶枕半表面上下波动重力刺激 1 0 - 3 0 分钟，叶鞘下半部分的、浓度是上半部分的3 倍而用p l c 抑制剂u - 7 3 1 2 2 后，可以阻 止口，增加，并使叶鞘弯曲度减少了6 5 这一结果表明、参与了植物感知重力刺激的信号传 导过程( p e r e r a e ta l , 2 0 0 1 ) 进一步的研究发现，在重力的刺激下，m ，水平的变化导致i a a 在叶 片的上部和下部分布不均，因此引起生蚝弯曲度不同( y u n c t a l 2 0 0 6 ) a l e x a n d e r da l ( 2 0 0 4 ) 应用小立宛藓p p p l c l 突变体发现，在相同培养条件下，野生型和缺 失突变体对重力的反应不同：野生型垂直生长，突变体却明显的蜿蜒生长；将培养的小立宛藓旋 转9 0 c ，野生型受重力影响生长方向随之改变，表现出向地性，而突变体仍然是随机生长因此 推测小立宛藓的p p p l c i 基因在小立宛藓对重力的感知中发挥重要的作用，这一工作进一步从基 因水平上证明磷脂酶c 参与重力刺激信号过程中 1 3 5 参与光信号 d a s 和s o p o r y 在1 9 8 5 年发现红光诱导的玉米原生质体对”c a 2 + 的吸收受d g 和i p 3 的调节， 以后他们又进一步证实光敏色素可以调