（药理学专业论文）dedd与smad3相互作用负性调控tgfβ介导的生物学活性.pdf

d i s s e r t a 丁1 0 no fp h d c h i n e s ea c a d e m vo fm e d i c a ls c i e n c e s p c k i n gu n i o nm c d i c a lc o l l e g e 目录 4 l i i i i 1 1 1 1 1 l i i l l u 啪1 1 1 1 l m i y 17 7 5 8 5 8 摘要 l a b s t r a c t 3 前言 5 材料与方法 7 实验结果 2 6 体外系统验证d e d d 蛋白与s m a d 3 蛋白的结合 2 6 体内系统验证d e d d 蛋白与s m a d 3 蛋白的结合 2 7 d e d d 抑制t g f d s m a d 转录 3 1 d e d d 抑制s m a d 3 的功能 3 5 t g f b 下调d e d d 表达和d e d d 抑制n f k b 的转录 4 l d e d d 抑制t g f 8 介导的细胞迁移能力 4 4 d e d d 抑制t g f d 介导的细胞侵袭能力 4 6 d e d d 不影响t g f p 介导的e m t 能力 4 7 d e d d 诱导细胞凋亡和生成停滞作用 5 0 讨论 5 4 参考文献 5 8 综述一s m a d 3 ：t g f s m a d 信号途径与肿瘤发生发展关系的关键转录因子 6 1 参考文献 6 7 综述二t g f d 1 在细胞内外部凋亡途径过程中的作用 7 0 参考文献 8 1 综述三死亡受体结构域蛋白家族研究进展 8 4 参考文献 9 4 缩略词表( a b b r e v i a t i o n ) 9 8 个人简历 1 0 0 致谢 1 0 1 原创性及知识产权声明 1 0 2 d i s s e r l ：a 1 1 0 no fp h d c h i n e s ea c a d e m yo fm e d l c a ls c l e n c e s & p e h n gu i l i o nm e d i c a lc o l l e g e 摘要 转化生长因子b ( t g f d ) 是一类对细胞增殖、分化、迁移、凋亡以及细胞外基质 形成、血管形成、免疫、发育均发挥调节作用的分泌型细胞因子。该家族调节异常 可以导致各种疾病发生，例如肿瘤、纤维化、自身免疫性疾病以及血管性疾病等。 t g f d 家族发挥其生物学功能主要通过s m a d s 蛋白，s m a d s 是t g _ f - p 家族细胞内信号 传导分子。目前在哺乳动物中已经发现八种s m a d s 蛋白，根据功能不同可分为三类： 受体激活型s m a d s 、通用介质型s m a d s 、抑制型s m a d s 。t g f p 信号在整个传递过程 中均受到不同层面的调节，因此t g f p 家族具有生物功能多样性。细胞内多种蛋白 都可与s m a d s 相互作用，这可以促进t g _ f b 信号与其他信号途径发生“整合”。 死亡受体结构域( d e a t he 虢c t o rd o m a i l l s ，d e d s ) 是蛋白发生相互作用的区域，含 有d e d 的蛋白可以介导由死亡受体触发的程序性细胞死亡或凋亡。d e d 本身没有 酶活性而是作为其他d e d s 的结合区域，因而促进蛋白复合体形成。f a d d 、c a s p a s e 8 以及d e d d 均属于含有d e d 结构域的蛋白。研究表明，d e d d 通过活化c a s p a s e 3 或c a p 2 l s e 6 在c d 9 5 介导的凋亡途径中发挥重要作用。近来发现d e d d 也参与细胞 周期调控并抑制有丝分裂进程。然而，关于d e d d 是否通过与关键的蛋白相互作用 参与其他信号转导途径以及d e d d 本身生物学功能尚未清楚。 我们实验室前期以全长的s m a d 3 蛋白为“钓饵”，通过酵母双杂交系统筛选出 d e d d 与s m a d 3 相互作用。本次研究中，我们应用免疫共沉淀和g s t - p u l ld o w n 方 法均证明d e d d 与s m a d 3 可以发生相互作用，这是首次报道s m a d 3 与含有d e d 结 构域蛋白之间的相互作用。我们发现t g f b 可以下调d e d d 与s m a d 3 的结合，而 且d e d d 与磷酸化的s m a d 3 结合能力减弱。双荧光素酶报告基因实验证明d e d d 通过其d e d 结构域可以抑制t g f d s m a d 3 介导的转录活性，而且s m a d 3 可以协同 增强d e d d 对n f 栅基因的转录。细胞免疫荧光染色和w b s t e mb l o t t i n g 实验证明 d e d d 可以抑制s m a d 3 入核作用。免疫沉淀实验证明d e d d 可以抑制s m a d 3 磷酸 化以及s m a d 3 与s m a d 4 复合体形成作用。w e s t e mb l o t t i n g 和r t - p c r 实验证明d e d d 抑制t g f p 靶基因的转录和翻译，而且t g f b 抑制d e d d 蛋白表达和基因转录。 细胞划痕实验和t r a n s w e l l 实验证明d e d d 抑制t g f d 介导的细胞迁移和侵袭作用， 而且d e d d 本身也具有抑制细胞迁移和侵袭作用。a r u l e x i i lv - f i t c 细胞凋亡检测实 验和m t t 实验证明d e d d 本身可以诱导细胞凋亡和生长阻滞。最后，我们应用临 床结肠癌病人组织标本进行免疫组化分析得到：与正常组织相比，d e d d 蛋白表达 在结肠癌病人组织下降。总之，我们的结果表明通过d e d d 与s m a d 3 的相互作用 d i s s e r t a l l o n0 fp h d c h i n e s ea c a d e m yo fm e d l c a ls c l e n c e s & p e k l n gu n i o nm e d i c a lc o l l e g e 在t g f d 信号途径和c d 9 5 途径之间建立崭新的联系，d e d d 成为t g f p 信号途径 的抑制因素。 关键词：d e d d ：s m a d 3 ；t ( 币p ；相互作用；肿瘤 2 d l s s e r r a n o n o f p h d c h 如e s ea c a d e n l yo f m e d i c a ls c l e n c e s & p e k i n gu l l i o nm e d i c a lc o l l e g e a b s t r a c t t 舳s f o n n i n g 黟o 、汕f a c t o r p ( t g f - p ) f 锄i l ym e m b e r s ，w h i c hi n c l u d et g f - p s ， a c t i v i n s ，n o d a la n db o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ( b m p s ) ，a r es e c r e t e dc ”o k i n e st h a t r e g u l a t eab r o a da 玎a yo fc e l l u l a rr e s p o n s e si i l c l u d i n gp r o l i f e r a t i o n ，d i f r e r e n t i a t i o n ， m i 伊a t i o na n da p o p t o s i s t ( 扦一ps i g n a l i n gp 砌1 w a yi s ak c yp l a y e ri i lm e t a z o a l lb i o l o g y ， a n di t sm i s r e g u i a t i o nc a nr e s u l ti l lt u m o rd e v e l o p m e n ni sw e uk n o w nt h a th o wt g f - p s i g n a l i n ge x e n si t s 矗m c t i o n t h ea c t i v et g f - pd i m e rs i g l l a l sb yb r i n g i n gt o g e t h e r 觚o p a i r so fr e c e p t o rs e r i n e t 1 1 r e o n i n ck i n 2 l s e sk n 0 、 ，n m et ) ，p e ia n dt ) ，p ei ir e c e p t o r s ， r e s p e c t i v e l y 0 nb i n d i n gt g f - p ，m e 锣p e i ir e c e p t o r sp h o s p h o 巧l a t ea n da c t i v a t et h et y p e ir e c e p t o r st 1 1 a tt h e np r o p a g a t em es i 鄂脚b yp h o s p h o 巧l a t i n gs m a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s b a s e do nt 1 1 e i rr m c t i o n ，s m a dp r o t e i n sa r eg e n e r a l l yd i v i d e di n t om r e e 伊o u p s ：m e r e c e p t o r - r e g u l a t e ds m a d s ( r - s m a d s ) ，t h ec o m m o ns m a d s ( c o s m a d s ) ，a n dt h e i 1 1 1 1 i b i t o 秽s m a d s ( i s m a d s ) t h e 够p eir e c e p t o r sp h o s p h o d r l a t er - s m a d s ，w h i c hs h 僦l e t 0m en u c l e u sa n df 0 珊ac o m p l e x 谢t hs m a d 4 ，ab i n d i n gp a n n e rc o m m o nt oa l l r s m a d s t h ea c t i v a t e dh e t e r o m e r i cs m a dc o m p l e x c s 觚l o c a t ci n t o 廿l en u c l e u sa n d c o o p e r a t ew i mo t h e rn u c l e a rc o f a c t o r st or e g u l a t em e 仃a n s c r i p t i o no ft a r g e tg e n e s a l t h o u 曲t g f p s m a d - m e d i a t e ds i 班a l i n g i s c o n c e p t u 2 l l l ys i n l p l e ，a n u l b e ro f s m a d - m e r a c t i n gp r o t e i n sp r o v i d eah i 曲d e 铲e eo fs i g n a l i n gs p e c i f i c 时肌dv e r s a t i l 时 a p o p t o s i ss i g n a l i n gi sr e g u l 锄e da i l de x e c u t e db ys p e c i a l i z e dp r o t e i n st h a to r e nc a r 巧 p r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o nd o m a i n s o n eo ft h e s ed o m a i l l si st h ed e a me f ! e e c t o rd o m a i n ( d e d ) t h a ti sp r e d o m i n a m l yf o u n di nc o m p o n e n t s o f 廿1 ed e a t hr e c e p t o r - i n d u c e d s i g n a l 证gc o m p l e x ，w h i c hf o r m sa tt h em e m b e r so fm ed e a t hr e c e p t o rf 锄i l yf o l l o 、析n g t 1 1 e i r l i g a t i o n d e d - c o n t a i n i n gp r o t e i n sc o m p r i s ef a s - a s s o c i a t e dd e a md o m a i np r o t e i n ( f a d d ) ，c a s p a s e 一8a r l dd e a t he 彘c t o rd o m a i nc o n _ t a i n i n gd n ab i n d i n g ( d e d d ) ，a i l d t h el i k e d e d dp l a y s 锄i l i l p o n a n tr o l ei nc d 9 5 一m e d i a t e da p o p t o s i st h r o u g ha c t i v a t i n g c a s p a s e 3o rc a s p a l s e 6a sas c a f f 0 1 dp r o t e i n r e c e n t l y ，竹l es t u d yf o u l l dt 1 1 a td e d dc a n s u p p r e s st h ea c t i v i 够o fc d k l c y c l i nb 1c o m p l e x e sa r l dk e e ps 6 k 1a c t i v i 锣，s u g g e s t i n g t 胁d e d dp a n i c i p a t emc e uc y c l e 锄di n h i b i tc e l lm i t o s i s h o w e v e r ，i ti su n c l e a r w h e t l l e rd e d di n v o l v e si 1 1o t h e rs i g n a l i n gp a n l w a yv i am e r a c t i n gw 曲k e yp r o t e i n so f m 旬o rs i g n a l 仃a 1 1 s d u c t i o np a 廿嗍a y ，锄dn l ep a t h o p h y s i o l o g i c a lf u r l c t i o i l so fd e d d h a v e n o tb e e n 如l l vc l a r i f i e d d l s s e r t a t l 0 n0 fp hd c h i n c s ea c a d e l n yo fm e d l c a is c l e n c e s & p e k i n g 幽里e d i c a lc o l l e 壁 p r e v i o u s l y ，u s i n gay e a s tt w o - h y b r i ds c r e e nd e s i 印e dt oi d e m 坶s m a d 3 一i n t e r a c t i n g p r o t i e n s ，w ei d e n t i f i e dan o v e li m e r a c t i o nb e 似e e ns m a d 3a n dd e d d h e r c ，w er e p o n t 1 1 a td e d di m e r a c t sw i t hs m a d 3 t h ei n t e r a c t i o nb e t v v e e nd e d d 锄ds m a d 3w a s m e d ia t i 甜b ym ed e dd o m a i l lo fd e d d t ot h eb e s to fo u rk n o 、l e d g e ，m i si st 1 1 ef i r s t r e p o nr e v e a l i n gt h a ts m a d 3 缸e r a c t sw 汕d e d c o m a i n i n gp r o t e i n s f u n h e m o r e ，t g f - p s t i m u l a t i o ni n t e r f e r e dw i t ht h ea s s o c i a t i o na n dm ep h o s p h o 口l a t i o no fs m a d 3d e c r e a s e d t h ed e d d s m a d 3i m e r a c t i o n i n h i b i t i o no fs m a d 3b yd e d dr e s u l t e di nad e c r e a s ei n t g f d s m a d 3 m e d i a t e d 仃a n s c r i p t i o n d e d dr e d u c e ds m a d 3 劬c t i o n sb yp r e v e m i n gi t s p h o s p h o 巧l a t i o n ，b i n d i n gt os m a d 4a n dn u c l e a rt r a n s l o c a t i o nw h i c hl e dt 0t a r g e tg e n e e x p r e s s i o nr e d u c t i o n t g f pm i b i t e dd e d de x p r e s s i 叽趾ds m a d 3s y n e r g i s _ t i c a l l y e n h a n c e dm er e p r e s s i o no fd e d di i l l l i b “e dn f - 国l u cr e p o r t e ra c t i v 哆d e d d i n h i b i t e dt g f 阻m e d i a t e dc e l lm o t i l 时 锄d i n v a s i o n ， b u th a dn oe 仃e c to n t g f d i n d u c e de m t d e d di t s e l fa l s oo b v i o u s l yi n h i b i t e dc e um i 黟a t i o n ，i n v a s i o na n d p r o m o t e da p o p t o s i s f i n a l l y ， d e d ds h o w e dd i 仟e r e n te x p r e s s i o ni nh u m a nc o l o n c a r c i l l o m aa n dn o m a lc o l o nt i s s u e s t h e r e f o r e ，o u rf i n d i n g ss u g g e s tt h a td e d di sa n o v e l i l l h i b i t o ro ft g f ps i 印a j i n gp a t h 啪y 衄o u 曲i m e r a c t i n gw i t hs m a d 3a l l dd e d d s u p p r e s s e si 1 1 v a s i o na n dp r o l i f e r a t i o no ft 唧o rc e l l a sd e d db e l o n g st 0 t h ec d 9 5 s i g n a l i n gp a t h w a y ，o u rr e s u l t sd e m o n s 仃a t e dt h a tap o s s i b l ec r o s s t a l kb e t 、v e e nt g f p a n dc d 9 5 一m e d i a t e ds i g n a l i n gp a t h 、v a y s k e yw o r d s ：d e d d ；s m a d 3 ；t g f p ；i m e r a c t i o n ；c 锄c e r 4 d l s s e r t a t i o n0 fp h d c h i n e s ea c a d e m yo fm e d l c a ls c l e n c e s & p e k l n gu r i i o nm e d i c a lc 叫l 望e 前言 转化生长因子p ( t g f p ) 家族包括t g f p s ，激活素( a c t i v i i l s ) ，骨形态发生蛋白 ( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i i l s ，b m p ) 等，是一类对细胞增殖、分化、迁移、凋亡以及 细胞外基质形成、血管形成、免疫、发育均发挥调节作用的分泌型细胞因子【1 1 。该 家族调节异常可以导致各种疾病发生，例如肿瘤、纤维化、自身免疫性疾病以及血 管性疾病等【2 】ot g f p 家族发挥其生物学功能主要通过s m a d s 蛋白，s m a d s 是t g f - p 家族细胞内信号传导分子。s m a d s 主要通过磷酸化、复合体形成、进入核内等方式 发挥作用。t g f d 家族信号传递过程可概括为：配基与受体结合后，i 型和i i 型丝 氨酸苏氨酸激酶受体形成异二聚体，i i 型受体使i 型受体磷酸化，磷酸化位点位于 i 型受体膜内靠近细胞膜区域的特定丝氨酸苏氨酸残基上。活化的i 型受体通过磷 酸化r - s m a d s 以启动细胞内信号级联反应。t g f d 信号在整个传递过程中均受到不同 层面的调节，因此t g f d 家族具有生物功能多样性。细胞内多种蛋白都可与s m a d s 相互作用，这可以促进t g f d 信号与其他信号途径发生“整合”p j 。 含有可发生蛋白相互作用的区域的某些特定蛋白调控凋亡发生。这些区域包括 死亡受体结构域( d e a t he 虢c t o rd o m a i n ，d e d ) ，d e d 主要在死亡诱导信号复合体( t 1 1 e d e a t h i l l d u c i n gs i 趴a j i n gc o m p l e x ，d i s c ) 的组分中常见，d i s c 的组分可以组成死亡 受体家族成员。含有促进或抑制凋亡的d e d 蛋白已经被鉴别出来，这些蛋白可以 精确地调控凋亡的发生【4 1 。除了在调控凋亡的重要功能外，含有d e d 的蛋白近来也 被证明影响诸如细胞增殖等细胞生物学活动。这些结果说明死亡受体结构域家族具 有多重角色，表明它们可以调控细胞生长和死亡。此外，由于它们可以促进或抑制 凋亡，或可以调控细胞周期，因此它们也可成为肿瘤治疗的靶点。目前已经发现七 种含有d e d 的蛋白：f a d d 、c a s p a s e 8 、c a s p a s e l 0 、c f l i p 、d e d d 、d e d d 2 以及 p e a 1 5 【5 】o 这些蛋白主要参与由肿瘤坏死因子( t n f 0 【) 介导的细胞凋亡和增殖 调控过程。此外，含有d e d 的蛋白也在胚胎发育和维持免疫系统稳态过程中发挥 重要功能。研究表明，d e d d 通过活化c a s p a s e 3 或c a p a s e 6 在c d 9 5 介导的凋亡途 径中发挥重要作用睁引。近来发现d e d d 也参与细胞周期调控并抑制有丝分裂进程 0 1 。然而，关于d e d d 是否通过与关键的蛋白相互作用参与其他信号转导途径以 及d e d d 本身生物学功能尚未清楚。 我们的本次研究发现了d e d d 与s m a d 3 可以相互作用，而且d e d d 通过抑制 s m a d 3 磷酸化、与s m a d 4 复合体的形成以及直接抑制s m a d 3 入核作用发挥抑制s m a d 3 的转录功能，并进而抑制t g f d 介导的细胞迁移和侵袭作用。d e d d 蛋白本身也具 有诱导肿瘤细胞凋亡、生长阻滞、迁移以及侵袭作用。我们的结果表明通过d e d d c h i n e s ea c a d e m yo fm e d l c a ls c i e n c e s & p e k l n gu n i o nm e d i c a lc o l l e g e 与s m a d 3 的相互作用在t g f p 信号途径和c d 9 5 途径之间建立崭新的联系，d e d d 成 为t g f p 信号途径的抑制因素。 6 d l s s e r t 棚o no fp hd 竺! ! 坚苎垒! 坐璺坚! ! 坠鲤l c a ls c l e n c e s p e k j n gu n i o nm e d i c a lc o l l e g e 。_ ：_ _ _ - - = = ：已= ，二二= = 二二= = = ：= 材料与方法 一 a 实验材料 1 菌株 表l 中所列的菌株均由本实验室保存。 菌株 e c o z fd h 5 a e c o h b l 一2l ( d e 3 ) t h b i e1 g e n o t y p e sa n da p p i i c a t i o n so fd i 仃e r e n t 巴c 棚 基因型 用途 f 。( p 8 0 d l a c z m 1 5r e c a le n d a l 用于质粒的扩增与转化 影r a 9 6 伽一lh s d r l 7 ( r k m k + ) s u p e 4 4r e l ald e o r ( 1 a c z y a - 明萨) u 16 9 h s d sg a l ( 九c n s 8 5 7 i n d ls a m 7n i n 5 用于重组蛋白质的表达 i a c u v 5 t 7 1 2 质粒载体 p c d n a 3 1 m y c - h i s ( f i g 1 ) ：真核细胞如姒跏口比，跏口以，跏口以4 ，跏n 彩d ，跏口出 基因表达。 p c d n a 3 ( f 培2 ) ：用于真核细胞中沈砒跏a d 7 基因表达。 p f l a g - c m v 2 ( f i g 3 ) ：用于真核细胞中d 肋d ，c - d e d d 基因表达。 p g e x 4 t - l ( f 唔4 ) ：用于原核细胞中锄棚基因表达。 所用载体的结构简图如下： 7 d i s s e r t a l l o no fp hd c h i n e 辩a c a d e m yo fm e d l c a is c l e n c e s & p e h n gu n i o nm ! 皇! ! 型堡竺! ! ! 曼! c o m m e n 蚀f o rp c d n a 霄3 1 ， 5 5 2 2n u c l e o t j d e s h 砸目i i o n 8 呲 s 睡e 5 g 蝤毫 f i g 1s t r u c t u r ea n dm u l “p l ec i o n i n gs i t e ( m c s ) o fp c d n a 3 1 m y c h i sv e c t o r 1 l f i g 2s t r u c t u r ea n dm u i t i p i ec i o n i n gs i t e ( m c s ) o fp c d n a 3v e c t o r 8 d i s s e r t 棚o n0 fp hd c h i n e s ea c a d e r n vo fm e d l c a is c l e n c e s & p e k m gu i l i o nm e d i c a lc o l l e g e r m d i c i l l i n 一一 p b r 3 2 2 - o r i g i “ 、 s v d o p r o f p r i m e r js t u ii 9 8 4 。i ：x h o i2 0 0 7 i ”一p r o 1 0 t e r 、t 畸1 3 一p u c r e v p r i m e r l a c p r o m o t e r f i g 3s t r u c t l i r ea n dm u i t i p i ec l o n i n gs i t e ( m c s ) o fp f l a g - c m v 2v e c t o r d i s s e r l ：棚o n0 fp hd 曼垒! 里! 兰垒! 型! 里z2 1 丝! ! ! ! 型坠! ! 竺! ! 垒! ! 坠竖竺旦1 2 里坚! ! ! ! 型兰! ! ! ! 壁 l a “一a m 1 3 一p u c f 钿d p r i m e m i 3 m i 3 m 1 3 l a c n a r i4 3 0 8 “。一，7 h p a i4 1 7 4 ，一 e c o r v4 1 i 8 自d a i3 8 7 9 。 l a c i 一 ，t a c p r o m o t e r 卅i 3 一p u c r e v p r i m e r p 8 r 3 2 2 一o r i g i n b s t b i6 5 5 p 6 e x 一5 一p r i 1 1 e r b a m h i9 3 0 e c 0 r i9 3 9 s m a i9 4 6 ，s a l i9 4 9 h o i9 5 4 h o t i9 6 0 e a g i9 6 0 p 6 e 一3 一p r i m e r 日a t i i1 2 4 5 p s t i 1 9 2 2 自m p r p r o m o t e r 觚o i i 儿i n f i g 4s t r 眦t u ma n dm u l t i p l ec i 佃i n gs i t e ( m c s ) o fp g e x - 4 t 1v e c t o r 3 工具酶及d n a 分子量标准 各种限制性内切酶，d n a 聚合酶大片段( k l e n o w 丘a g m e m ) ，t 4d n a 连接酶和 d l 2 0 0 0d n am 砒e r 购自大连宝生物有限公司，l 州a s e a 购自美国s i g m a 公司。 4 试剂盒 b c a 蛋白质测定试剂盒购自普利莱基因技术有限公司公司。e c l 试剂盒购自普利 莱基因技术有限公司公司。d n a 快速纯化回收试剂盒购自博大泰克生物公司。双 d i s s e r o n o f p h d 竺塾垫! 苎垒! ! 坐里! 垡坚! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 坚壁垒里! ! ! 竖竺里1 2 呈坚! ! ! ! 苎! 竺! ! ! ! 壁 荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国p r o m e g a 公司。a n n e x i nv - f i t c 细胞凋亡检 测试剂盒购自美国b i o p e c 公司。 5 抗体 a m i h a p r o b e ( f 7 ，s c 7 3 9 2 ) ，a n t i - s m a d 2 3 ( f l - 4 2 5 ，s c - 8 3 3 2 ) ，a n t i - s m a d 2 3 ( n 一19 ，s c - 6 0 3 2 ) ，a i l t i - p s m a d 2 3 ( s e r4 2 3 4 2 5 ，s c - l l7 6 9 ) ，a n t i - s m a d 4 ( b 一8 ，s c - 7 9 6 6 ) ， a n t i d e d d ( c - 1 8 ，s c 一2 7 0 5 1 ) ，a n t i - p 2 1 ( f 5 ，s c 一6 2 4 6 ) ，a n t i e c a d h e r i n ( h - 1 0 8 ，s c - 7 8 7 0 ) ， a n t i b a c t i n ( c 4 ，s c 4 7 7 7 8 ) ，以上抗体购自s a n t ac r u z 公司；a n t i - d e d d 购自 p r 0 钯i n t e c hg r o u p 公司；a n t i - p h o s p h o s m a d 3 ( s e r 4 2 3 4 2 5 9 5 2 0 ) ，枷i h i s t o n eh 3 ( 撑9 7 1 5 ) a n t i b o d i e s 购自c e us i 印a l i n gt e c l l l l o l o 黟公司；a n t i - f l a gm 2 ( f 3 1 6 5 ) a n t i b o d y 购自s i 舯a 公司；a n t i - m y c t a g ( 5 6 2 - 5 ) 舭t i b o d y 购自li n t e m a t i o 砌公司； a n t i g a p d h ( k c 5 g 4 ) a n t i b o d y 购自上海k 孤g c h e nb i o t e c h 公司：r e c o m b i n 枷 h u m a nt ( 撸d 1 和n 盯q 购自p e p r o t e c h 公司 辣根过氧化物酶偶联羊抗兔i g g 、羊抗小鼠i g g 、兔抗羊i g g 、f i t c 标记羊抗 兔i g g 抗体均购自中山生物工程公司。罗丹明标记羊抗兔i g g 抗体羊抗小鼠i g g 购 自i n v i r o g e n 公司。 p ) f ( 聚偏二氟乙烯) 膜为m i l l i p r o e 公司产品。g l 眈曲i o n es e p h a r o s e4 b 购 自a m e r s h 锄p h a r m a c i ab i o t e c h 。p r o t e i naa g a r o s e 购自s a n 船c r u z 公司。 6 培养基 d m e m ，i m d m 和胎牛血清( f b s ) 购自g i b c o b r l 公司。胰蛋白酶购自s i 鲫a 公司。 7 主要仪器及设备 实验所用主要仪器有：冷冻高速离心机( b e c k m a n ) 、e p p e n d o r f 冷冻离心机、 m i l l i qp l u s 超纯水系统( m i l l i p o r e ) 、电泳仪( 北京六一仪器厂) 、紫外观测仪及照相系 统( u v pi n c ) 、u l t r a s c a n x l 扫描仪( p h a m a c i a ) 、匀浆器( p o l y 仃a n ，s w e d e n ) 、荧光显微 镜及照相系统( n i k o n ) 、激光共聚焦显微镜( l e i c 八t c sn t ) 等。 8 d n a 序列分析软件 核酸蛋白序列分析软件d n a m a n 。 9 引物 d i s s e r 咖o no fp h d c h i n e a c a d e m yo fm e d l c a is c l e n c e s & p e k i n g u t l i o nm e d i c a lc o l l e g e 于构建d e d d 真核表达质粒 f5 g g a a t t c g c c a c c a t g g c g g g c c t a a a g c 3 p r i m e rr5 - c g g g a t c c g g c a a t g c t t g c a g c a t c 3 9 2 用于扩增s m a d 3 的点突变体s m a d 3 a 和s m a d 3 d ( 1 ) s m a d 3 a p r i m e rf5 - g g aa t t c ( x ：c a c c a t g t c g t c c a t c c t g c c l l t c 3 p r i m e rr5 c g g g a t c c g c c a c a g c g g c a c a g c g g a t g 3 ( 2 ) s m a d 3 d p r i m e rf5 g g aa t t c g c c a c c a t g t c g t c c a t c c t g c c t i t c 3 p r i m e rr5 c g g g a t c c g c a t c c a c a t c g t c a c a g c g g a t ( ；c t t g g g g 3 9 3 用于i m p c r 引物 ( 1 ) g a p d h p r i m e rf5 。a a t c c c a t c a c c a t c t t c c a 3 p r i m e rr5 t g g a c t c c a c g a c g t a c t c a 3 ( 2 ) s m a d 7 p r i m e rf5 。c c c c a t c a c c t t a g c c g a c t c t g c 3 p r i m e rr5 。c c c a g g g g c c a g a t a a t t c g t t c c 3 ( 3 ) p 趾- 1 p r i m e rf5 a t t c a a g c a g c t a t g g g a t t c a a 3 p r i m e rr5 c t g g a c g a a g a t c g c g t c t g 3 1 0 实验动物 s p f 级野生型c 3 h h e n 小鼠( w t 小鼠，雌雄各半) 购自北京维通利华实验 动物技术有限公司，动物合格证号s c x k ( 京) 2 0 0 7 o o o l 。t l r 4 突变的c 3 h h e j 小鼠 ，竹h f ( 册4 小鼠，雌雄各半) 购自南京大学模式动物研究所。所有动物饲养于中国医 学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。 b 实验方法 1 载体质粒的构建 如果载体质粒和目的d n a 片段之间有相配的限制性内切酶位点，则将经相同 酶切的载体和目的片段，经琼脂糖凝胶电泳切胶回收，直接进行连接、转化。如果 载体质粒和目的d n a 片段之间没有相配的酶切位点，则需设计引物扩增目的片段， 在引物中引入合适的酶切位点。p c r 产物先与p g e m tv e c t o r 连接，构建一个中间 1 2 d i s s e r t 枷o n0 fp h d c h i n e s ea c a d e m yo fm e d l c a ls c l e n c e s & p e k l