（食品科学专业论文）纳豆激酶制剂及活性测定方法的研究.pdf

、 ， ， i 、 ， i l i ii ii iii iii iii i iii il y 18 0 9 5 7 2 关于硕士学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的规定，大连辁 工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和 纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 具) ，保密期至加7 年肚月；f 日为止。 学生签名： 复趟导师签名：型鲤垒 1 年严月仪日 i 摘要 摘要 本论文对纳豆激酶制剂的发酵生产条件及纳豆激酶制剂产品的基本酶学性质进行 了研究，并对纳豆激酶活力测定的多种方法进行了研究。 以9 号纳豆菌为出发菌株，在最佳摇瓶培养条件基础上通过5 l 发酵罐扩大培养， 确定最优发酵培养条件，发酵液采用真空冷冻干燥得到纤溶活性较高的纳豆激酶干粉， 并对纳豆激酶干粉的部分酶学性质进行了研究。 试验结果表明：纳豆菌液体发酵罐产酶的最佳培养条件为，温度3 0 ，装液量2 l 5 l 发酵罐，接种量2 ，搅拌速率4 0 0 r r a i n ，通气速率3 l m i n ，初始p h 7 0 ，发酵培养4 8 h 。 纳豆菌在此条件下培养，发酵液酶活力达1 9 5 1 7 9 i u m l ，较摇瓶培养提高2 4 0 倍。 纳豆激酶千粉基本酶学性质试验结果表明：5 0 时，酶活还比较稳定，可保存8 0 左右的活力，随温度升高，纳豆激酶热稳定性变差，7 0 的情况下2 0 m i n 酶全部失活； p h 为中性时，纳豆激酶活力相对较高且稳定，其中p h 7 时酶活为最大值；c a 2 + 、m 9 2 + 、 f e 3 + 、n a + 、f e 2 + 、b a 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 对纳豆激酶活力起明显抑制作用；m n 2 + 、a 1 3 + 、c 0 2 + 对纳豆激酶活力起较弱抑制作用；低浓度m n 2 + 对纳豆激酶有促进作用。 五种纳豆激酶活力测定方法研究结果表明：c l t 法受样品稀释倍数影响较大，不 同稀释倍数下测得的活力值误差可达4 3 0 1 琼脂糖一纤维蛋白平板法所得数值不同稀释 倍数间差异并不大，误差为6 9 ，较c l t 法稳定、可靠；枯草杆菌蛋白酶活力测定方 法所得数据重现性较好，误差5 7 ，与平板法所得数据线性相关，该测定方法的深入研 究具有很大意义；四肽底物法灵敏度高、精密度好，易于自动化，但检测成本昂贵，不 利于推广使用。纤溶活力测定法被日本保健食品协会指定为纳豆激酶活力测定标准方 法，但其实验操作复杂，测定结果不能单一表达纳豆激酶活力。 卜 关键词；纳豆激酶；真空冷冻干燥；活力测定方法 i a b s tr a c t i nt h i st h e s i s ，t h ep r o d u c i n gc o n d i t i o n so f n a t t o k i n a s ep r e p a r a t i o nf e r m e n t e db yb a c i l l u s s u b t i l i sn a t t ow e r es t u d i e d ，t h e nt h eb a s i cc h a r a c t e r so ft h ep r o d u c tw e r ea l s or e s e a r c h e d m e a n w h i l es e v e r a lm e n s u r a t i o n so f n a t t o k i n a s ea c t i v i t yw e r es t u d i e da n dd i s c u s s e d n a t t o - 9w a ss e l e c t e da st h es o u r c e b a s e do nt h er e s u l t so fs h a k ef l a s ke x p e r i m e n t s ，t h e b a c i l l u sn a t t ow a sc u l t i v a t e dw i t h5 - 1 i t mf e r m e n tj a r t h eb e s tc o n d i t i o n so ff e r m e n tw e r e c o n f i r m e d t h ef i b r i n o l y t i cn a t t o k i n a s ep o w d e rw a sr e c e i v e dv i af r e e z e - d r y i n g h a v i n gb e e no p t i m i z e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，t h et e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n st o p r o d u c en a t t o k i n a s eb yf e r m e n tj a rw e r ed e s i g n e d ：2 lm e d i u mp e r5 lf e r m e n tj a r , t h ev o l u m e o f b a c i l l u ss u b t i l i sn a t t os u s p e n s i o ni n o c u l a t e di n t of e r m e n tj a rw a s2 ，t h es p e e do fs t i r sw a s 4 0 0 r m i n ，t h es p e e do f v e n t i l a t e sw a s3 l m i n , i n i t i a lp h 7 0 ，a f t e rf e r m e n ti n3 0 * ( 2f o r4 8 h , t h e h i g h e s ta c t i v i t yo fn a t t o k i n a s eo b t a i n e dc a nb e 19 51 7 9 i u m 1 t h ea c t i v i t yo fn a t t o k i n a s e w a s2 4 0t i m e st h a nt h a to fs h a k ef l a s ke x p e r i m e n t t h eb a s i cc h a r a c t e r so fn a t t o k i n a s ep o w d e rw e r ec o n f i r m e da s ：n a t t o k i n a s ew a ss t a b l e b e l o w5 0 ，a n d8 0 a c t i v i t yw a ss a v e d i t ss t a b i l i t yd e c r e a s e da st h et e m p e r a t u r ei n c r e a s e d ， a n dd e a c t i v a t e du n d e r7 0 f o r2 0 m i n i tk e p tah i g ha c t i v i t ya tp h6 - 8 n a t t o k i n a s ea c t i v i t y w a so b v i o u s l yi n h i b i t e db yc a + 、m 9 2 + 、f e 3 + 、n a + 、f e 2 + 、b a 2 + 、k + 、c u 2 + 、z n 2 + ，a n ds l i g h t l y i n h i b i t e db y 耐十、a 1 3 + 、c 0 2 + ，b u tw a sp r o m o t e d b ym n 2 + w i t hl o wd e n s i t y s t u d yo nf i v em e t h o d sw h i c hw e r eu s e d ，t h er e s u l t sw e r ek n o w n ：c l tw a se f f e c t e db y d i l u t i o nm u l t i p l e ，a n dt h ee r r o rc a nr e a c ht o4 3 0 9 6 ：t h ee r r o ro ff i b r i np l a t em e t h o dw a s a c c e p t a b l e ，i tr e a c h e dt o6 9 9 6b e t w e e nd i l u t i o nm u l t i p l e s ；t h er e s u l to fb a c i l l u ss u b t i f i s p r o t e i n a s em e n s u r a t i o nw a ss t a b l ea n dr e l a t i v et ot h er e s u l to ff i b r i np l a t em e t h o d ，a n di t s e q l o rw a s5 9 ，f u r t h e rr e s e a r c hw a se x p e c t e dt oe x p r e s st h en ka c t i v i t y ；s u c - a a p f p n a m e t h o dw a ss e n s i t i v ea n de a s yt ob ea u t o m a t i o n , b u th a ds o m eb l o c k so np r o m o t i o nb e c a u s e o fh i g he x p e n s e ；f i b r i nd e g r a d a t i o nm e t h o dw a sa n n o u n c e dt ot h es t a n d a r db yj a p a nh e a l t h f o o da u t h o r i z a t i o n , b u ti tw a sc o m p l i c a t e dt oo p e r a t ea n di t sr e s u l tc a nn o te x p r e s sn k a c t i v i t ye n t i r e t y k e yw o r d s ：n a t t o k in a s e ，f r e e z e d r yin g ，m e n s u r a tio no fa c tivit y 目录 目录 第一章绪论1 1 1 纳豆的起源l 1 2 纳豆激酶简介”2 1 2 1 纳豆激酶的生产方法2 1 2 2 纳豆激酶的生化特性3 1 3 血栓的形成及纳豆激酶溶栓机理3 1 3 1 血栓的形成3 1 3 2 纳豆激酶的溶栓机理4 1 3 3 传统溶栓疗法4 1 4 纳豆激酶与其它溶血栓药物的功效对比4 1 4 1 溶栓剂5 1 4 2 血小板凝结抑制剂6 1 4 3 抗凝血剂“6 1 4 4 天然产品6 1 5 纳豆激酶研究开发现状及应用进展“7 1 6 真空冷冻干燥技术“9 1 7 发酵条件的选择依据l o 1 8 纳豆激酶活力测定方法11 1 9 本课题的研究内容12 第二章实验材料与方法1 3 2 1 实验材料、主要药品及设备13 2 1 1 材料l3 2 1 2 主要药品1 3 2 1 3 设备、仪器及型号l3 2 2 主要试剂1 4 2 2 1t r i s 一明胶缓冲溶液( p h 8 8 ) 1 4 2 2 2 三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液( p h 9 0 ) 1 4 2 2 3 巴比妥一氯化钠缓冲溶液( p h 7 8 ) “1 4 1 i 目录 2 2 4t r is - h c lc a c l 2 缓冲溶液( p h 8 o ) 1 4 2 2 5 纤维蛋白原溶液”1 4 2 2 6 凝血酶溶液1 5 2 2 7 纤维蛋白溶酶原溶液1 5 2 2 8 硼酸一硼砂缓冲溶液( p h 8 5 ) 15 2 3 实验原理及方法1 5 2 3 2 纳豆激酶活性测定原理及方法1 5 2 3 2 1 纤维蛋白凝块溶解时间法”1 5 2 3 2 2 琼脂糖一纤维蛋白平板法1 5 2 3 2 3 枯草杆菌蛋白酶活力测定法”1 6 2 3 2 4 四肽底物法l7 2 3 2 5 纤溶活力测定法1 7 2 3 2 6 微平板法”1 8 2 3 3 纳豆菌产酶条件的研究方法1 8 2 3 3 1 培养基的配制1 8 2 3 3 2 菌体培养与酶液收集1 8 2 3 3 3 发酵罐培养条件的选择1 9 2 3 3 4 菌落计数方法“1 9 2 3 3 5 发酵液中蛋白质含量的测定1 9 2 3 3 6 发酵液中生物量的测定”2 0 2 3 3 7 发酵罐发酵工艺参数的测定2 0 2 3 4 真空冷冻干燥条件2 0 2 3 5 纳豆激酶干粉酶学性质的测定2l 2 3 5 1 纳豆激酶于粉制剂的热稳定性2 l 2 3 5 2 纳豆激酶干粉制剂的p h 稳定性2 1 2 3 5 3 金属离子对纳豆激酶干粉活力的影响2 l 第三章实验结果与讨论2 2 3 1 标准曲线的绘制2 2 3 1 1 纤维蛋白凝块溶解时间法2 2 3 1 2 琼脂糖一纤维蛋白平板法2 4 3 1 3 枯草杆菌蛋白酶活力测定法2 7 目录 3 2 纳豆激酶活性定义及测定结果的比较2 9 3 2 1 纤维蛋白凝块溶解时间法( c l t ) 3 0 3 2 2 琼脂糖一纤维蛋白平板法”3l 3 2 3 枯草杆菌蛋白酶活力测定法“3 l 3 2 4 平板法与枯草杆菌蛋白酶法比较3 2 3 2 5 四肽底物法3 5 3 2 6 纤溶活力测定法3 7 3 2 7 小结3 8 3 3 实验菌株的确定3 8 3 4 发酵罐发酵培养检测指标的确定3 8 3 5 纳豆激酶发酵罐培养条件的确定4 0 3 5 1 搅拌速率对纳豆菌产酶的影响4 0 3 5 2 通气速率对纳豆菌产酶的影响4 0 3 5 3 发酵时间的确定4 2 3 6 纳豆激酶干粉的部分酶学性质实验4 2 3 6 1 温度对纳豆激酶干粉酶活力的影响4 3 3 6 2p h 值对纳豆激酶干粉酶活力的影响4 3 3 6 3 金属离子对纳豆激酶干粉酶活力的影响4 4 第四章结论4 6 参考文献4 7 致谢5l v 第一章绪论 1 1 纳豆的起源 第一章绪论 日本人是现今世界上最长寿的民族而受注目，其可能原因之一是他们长期摄取了微 生物发酵酿造食品，例如：纳豆、味噌、酒酿、米麴及其他淹渍类食品。在这些食品中， 纳豆被认为是维系日本人健康长寿，深具民族特色的饮食文化之一。日本关于纳豆的历 史相当久远，据民间传说，在绳文时代的木期( 约2 3 0 0 年前) ，大豆由中国大陆进入 日本。人们将大豆煮熟后，用稻草包起柬( 称为苞) ，使其保持一定的温度，稻草上生 长的纳豆菌使大豆充分发酵成为带有黏性物质和独特气味的发酵食品纳豆。在日本 有关纳豆的记录是公元1 2 8 6 年藤原明衡在新猿乐记一书中提及纳所( 寺庙厨房的 意思) 之豆，第一次出现了“纳豆的名词，在古代日本豆类是僧侣们的主要蛋白质摄 取来源，而成为一般民众的普及食品则始于公元1 6 0 0 年左右的江户时代【l 】。 纳豆是将蒸煮后的大豆接种纳豆芽孢杆菌发酵制成，纳豆里还含有很多对人体有益 的酶，如过氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶等。其内还含有游离的异黄酮类物质，具 有很丰富的营养价值，纳豆食品主要成分含有纳豆菌、多种蛋白酶、抗菌物质、丰富多 样的维生素( b i 、b 2 、b 1 2 、e 、k l 、k 2 ) f 2 】，黏性蛋白( y p g a ) 、y 谷氨酰基转肽 酶、氨基酸、矿物质p l 。同时也含有较高的活性物质，如纳豆激酶、异黄酮、卵磷脂、 超氧化物歧化酶( s o d ) 、皂甙素、生育酚、吡啶二羧酸掣4 1 。因此纳豆是营养丰富并具 有抑菌功效的发酵食品。科学研究结果表明，纳豆食品目前在日本被认为在肠道调整功 能方面，具有治疗痢疾、感染、肠胃发炎、胀气、消化不良、便秘、残便等功效【5 1 。此 外，在增强心血管能力方面，纳豆食品近年来最受关注的话题是其溶解血栓的功效。自 1 9 8 7 年日本须见洋行博士发现纳豆中的强纤溶物质纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ，n i 【) 【6 】，证 明纳豆具有溶解血栓功效后，纳豆食品倍受世界瞩目。 最近的研究报告指出纳豆食品还具有下列保健功效；纳豆含有天然的血管收缩素转 化酶抑制剂，能阻止血管收缩素被活化，可预防高血压【7 培l ，含有天然抗氧化成分，具 有防止老化、动脉硬化及保护肝脏的功效，含有维生素k 2 ，可预防骨质疏松等功效 9 1 。 第一章绪论 1 2 纳豆激酶简介 1 9 8 0 年须见教授在美国芝加哥大学进行血栓溶解p r o - u k 与u k 的构造分析研究时， 无意间发现纳豆食品中含有高浓度的血栓溶解成分，1 9 8 7 年须见教授进一步研究结果表 明在纳豆食品的发酵过程中，纳豆菌会向胞外分泌的一种易溶于水的碱性丝氨酸蛋白 酶，因与链激酶、尿激酶等溶血栓药物具有同样的溶血栓功能而将之命名为纳豆激酶 ( n a t t o k i n a s e ，简称n k ) 。该酶能显著溶解体内血栓，缩短优球蛋白的溶解时问( 脚) ， 并能刺激静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂( t 蚴【1 0 j 。此后研究人员对纳豆激酶 从不同角度进行了研究，并取得了很大进展。目前，对纳豆激酶的性质、作用机理、分 离纯化方法等方面都已有了一定的了解，基因克隆、转基因技术也被运用到纳豆激酶的 制备当中，并在某些菌株中得到有效表达。纳豆激酶类药品及保健食品的研究工作成为 热点，许多国家现在正相继推出以纳豆激酶为原料的产品【l l 】。 1 2 1 纳豆激酶的生产方法 纳豆激酶最初是从纳豆粘液中发现的，目前生产纳豆激酶仍采用传统的纳豆生产方 式，不过进行了一定的改进。纳豆的基本制作步骤是： 大豆一浸泡过夜一煮熟灭菌一摊凉一接入菌种一发酵纳豆。将制备好的新鲜纳豆， 用无菌生理盐水浸提两次，合并提取液。 此外，另有一种生产纳豆激酶的方法，即流体发酵法，其基本步骤为： 培养基灭菌一冷却一接入菌种一液体发酵一取发酵液离心一收集上清液。 通过液体发酵法得到的纳豆激酶上清液或通过固体发酵法获得的纳豆激酶提取液， 再经过一定浓度的乙醇沉淀，去除粘性物质，其主要成份是果糖和多聚谷氨酸，从而得 到纳豆激酶的粗酶液。粗酶液一般经过滤、离心后再对酶进行提取。低温高速离心去除 纳豆菌细胞及溶液中的不溶性杂质后，用一定饱和度的硫酸铵溶液处理，离心收集沉淀， 经透析除盐即可得到浓缩的粗酶液。在实验室利用各种色谱柱层析还可以进步获得比 较纯的单一酶。 刘宇峰等【1 2 】进行了纳豆激酶生产分离工艺的中试实验，分离提纯并制备纳豆激酶制 剂。纳豆激酶的提取分离工艺为：纳豆一提取一高速离心除杂一浓缩一除菌一醇沉一真 空干燥一粉碎一灌胶囊一装箱一胶囊成品。 2 第一章绪论 1 2 2 纳豆激酶的生化特性 不同测定方法测得的纳豆激酶分子量由2 7 ，3 0 0 d a l 到3 5 ，0 0 0 d a l 不等，但根据其基 因的d n a 序列推测氨基酸的一级序列，可知是由2 7 5 个氨基酸残基组成的单链多肽【1 3 j ， 准确分子量应为2 7 ，7 2 8 d a l 。由于酶分子中没有半胱氨酸残基，因此分子中也没有二硫 键，是一条单链多肽，从纳豆激酶的一级结构、氨基酸序列中发现，其中含有8 个赖氨 酸残基，内肽酶可将其水解成9 个小肽。酶的活性部位在a s p 3 2 ，h i s 6 4 ，和s e t - 2 2 1 处，与底物的结合部位在s e t - 1 2 5 ，l c u 1 2 6 ，g l y 1 2 7 处【1 4 1 。纳豆激酶同其它枯草杆菌 蛋白酶具有很好的同源性，同枯草杆菌蛋白酶c a r l s b e r g 有7 0 2 的同源性；同枯草杆菌 蛋白酶b p n 有8 5 的同源性；氨基酸序列同枯草杆菌蛋白酶e 只有2 个氨基酸不同，由 此可推测纳豆激酶属于枯草杆菌蛋白酶【1 5 】。用s v u n s s o n 柱形电泳法测定该酶等电点为 8 6 + 0 3 ，其最敏感的作用底物也是血浆纤溶酶的作用底物一纤维蛋白，即形成血栓的 主要基质。 1 3 血栓的形成及纳豆激酶溶栓机理 1 3 1 血栓的形成 动脉硬化症的演变过程是多方面的。患者可能仅在心脏冠状动脉中发生局部的血 栓或凝块，从而导致心脏病；或在颈动脉的分枝中形成导致中风；又或在四肢血管中形 成引起肺栓塞。凝块的主要成分是纤维蛋白，就其结构及组成来看，它们是由丝状纤维 蛋白构成，血栓的形成主要是通过纤维蛋白的逐渐堆积和( 或) 是人体不能有效地将丝 状纤维蛋白分解为其产物【l “7 1 。 关于血管堵塞引起的心脏病和中风的成因有几种其它学说，能够被接受的解释是动 脉堵塞变硬，血小板粘性增大，释放血小板衍生物，导致动脉血管壁上的平滑肌细胞增 生扩散。这样增加了平滑肌细胞向血小板和质脂的渗透性，特别是低密度脂蛋白。随着 低密度脂蛋白增加，它进步向动脉血管壁渗透。动脉壁上的血小板形成良性肿瘤( 一 种单克隆突变体) 。纤维蛋白过剩、自由基分子、慢性炎症、胆固醇氧化、低密度脂蛋 白氧化、环境中的碳氢化合物和其它因素加剧了病变。 根据自由基分子假说，脂质过氧化物破坏了动脉血管壁，进一步提高其渗透性，也 逐渐加剧了脂质的氧化，尤其是低密度脂蛋白的氧化。自由基袭击动脉壁、活跃的细胞 第一章绪论 大量增殖，异常的细胞复制。细胞大量增殖导致凝块增长、血栓形成。这一结果带来的 损害是动脉内壁的大量脂肪沉滞斑。血栓来源于变性的平滑肌细胞、低密度脂蛋白和纤 维蛋白【1 8 i 。 自然存在的溶血栓酶产生于血管内的内皮细胞。随着年龄的增长，这些酶的生成速 度减慢，血液趋于凝结，这样导致凝块产生。凝块可以在任何年龄段形成，因而近年来 血栓栓塞症及其治疗方法受到了人们的广泛关注。因此，即使年轻人也可以使用纳豆或 纳豆激酶作为预防血栓药物。 1 3 2 纳豆激酶的溶栓机理 研究表明，纳豆激酶能直接溶解纤维蛋白和作用于血纤维蛋白溶酶间接溶栓【1 9 1 。在 凝块溶解过程中，纳豆激酶催化尿激酶原转变成尿激酶，同时催化了纤维蛋白降解为其 产物，并将血纤维蛋白溶酶原( 血浆酶原) 转化为血纤维蛋白溶酶。纳豆激酶也增加了 血纤维蛋白溶酶组织中的活性物质，进一步促进纤维蛋白的溶解和凝块的缩小，通过减 少血栓的形成降低血小板沉积速度，使动脉硬化有所改善。 1 3 。3 传统溶栓疗法 传统溶栓疗法是针对急性心脏病突发而就诊的的患者通过静脉注射溶栓药物来治 疗的。主要溶栓药物是组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂( t p a s ) 。如变性剂、激活剂 及几种其衍生物，包括尿激酶、链激酶和葡激酶。t - p a 是治疗突发性心脏病的主要药物。 传统的溶血栓或凝块降解的疗法，每年对数以百万计的急性心肌梗塞病人进行治疗，其 将死亡率减少了3 0 5 0 ，这一数字说明只有部分患者从中受益，为其它疗法留有空间。 另两类治疗药物分别是抗血小板凝结药物和抗凝血剂。 1 4 纳豆激酶与其它溶血栓药物的功效对比 纳豆激酶是目前所发现的近2 0 0 种具有口服溶纤作用的物质中最具潜力的溶纤蛋白 酶【2 0 1 。l o o g 湿纳豆中含有的纳豆激酶活性相当于1 6 万单位的尿激酶，可折合价格达2 0 万日元，具有很高的经济价值。在体外试验中可以看到纳豆激酶与纤维蛋白溶酶原共同 作用将纤维蛋白凝块即血栓模型明显的溶解。在以大鼠为对象的动物实验中经过静脉注 射发现纳豆激酶的纤溶能力是血纤维蛋白溶酶( p l a s m i n ) 的4 倍以上f 2 1 1 。纳豆激酶较之 4 第一章绪论 传统纤溶性药物纳豆激酶在几个方面具有优势： 1 纳豆激酶属于口服药，这样就比注射针剂更具有安全性，同时也减轻肾脏的负 担； 2 纳豆激酶分子量远远小于尿激酶、t p a ，是一个单链蛋白，易被人体吸收，且 作用时间长( 大于8 h ) ，因此有可能成为口服性药物f 2 2 1 ； 3 与传统纤溶性药物相比纳豆激酶作用下纤溶蛋白衍生物产生过程可持续8 小 时，一定条件下持续1 2 小时； 4 据相关报道，纳豆能阻止血凝并且促使已经存在的凝块消溶； 5 纳豆激酶属微生物产品，可以通过液体发酵生产，造价低廉。 1 4 1 溶栓剂 血浆酶原活性组织( t i s s u ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r s ，t p a ) 这是当患者突发心 肌梗塞或中风入院治疗时所使用的溶血栓方法。t - p a 在病症开始发作后3 6 小时内有 效【2 3 1 。这种药物的价格相当昂贵，每剂可达2 2 0 0 美元，然而当有不易溶的血栓存在时， 这种紧急救治的有效与否尚无定论，当与肝磷脂联合使用时t p a 比溶栓酶或尿激酶更 加有效。在许多情况下，紧急入院治疗会因时间延误而使治疗无效，而纳豆激酶作为一 种保健食品，起到了日常预防的作用，一定程度上避免了生命无谓的损失。 尿激酶( o r o k i n a s e ，u k ) 在治疗中，尿激酶常被用作溶纤维素丝氨酸蛋白酶，控制 心房室内血液凝块通过导管流出，血栓在心脏、血管或肺部得以消溶。但作为丝氨酸 蛋白酶它会涉及到肿瘤的生长和转移。利用尿激酶抑制剂治疗早期癌症的研究正在展 开。它的优点是无抗原性，无热原性，可连续用药半个月以上，缺点是选择性差，治疗 的同时会降解血纤维蛋白原。每百克纳豆的价格与1 5 0 0 美元的尿激酶相当。尿激酶的 半衰期为4 - - 一2 0 分钟。而纳豆激酶的活性可持续8 1 2 小时【2 4 1 ，从这个意义上讲，纳豆 激酶更加经济。从功效方面看纳豆激酶抑制纤维蛋白的效果较尿激酶或血纤维蛋白溶酶 更好，且相对耐热。 链激酶( s t r e p t o k i n a s e ，s k ) 链激酶常用于急救，作为i v 溶血栓剂。它每次治疗约 为2 0 0 美元的价格更加合理。其药效比t p a 长( 约1 2 小时) 【2 5 l ，据报道较t p a 引起 的出血量少。链激酶被用于治疗早期心机梗塞，特别是在发作6 小时内入院治疗的急性 早期心机梗塞，它也被用来治疗急性肺部血栓和组织动脉血栓f 2 4 】。s k 的优点是有效、 其冠脉开通率为5 0 ，缺点是抗原性强、易引起变态反应，还可能出现低血压，即副作 第一章绪论 用过大、禁忌证多、连续用药不可超过7 d ，对于治疗中风不如t - p a 有效。 蚓激酶( l u m b r o k i n a s e ) 它是采用生化分离技术从特殊蚯蚓中分离的一种丝氨酸蛋 白酶，具有激活人体内的纤维蛋白溶酶原和溶解体内血栓的作用。在兔体内试验，蚓激 酶不仅抑制血栓形成，而且有很好的溶解血栓作用；在大鼠实验性脑缺血中应用，蚓激 酶可溶解血栓，改善脑缺血状况。中科院生物物理研究所和江中制药厂共同研制了新一 代全天然抗血栓药江中博洛克为肠溶衣胶囊，解决了溶栓剂口服无效的问题，进人 胃内后不被破坏，既保证了疗效，又服用方便。但是它的副作用也很明显，容易导致出 血【2 6 】等。 1 4 2 血小板凝结抑制剂 阿斯匹林较其它药物更广泛的被应用于防止周期性中风。阿斯匹林通过减少血小 板凝结和抑制血液凝块来发挥药效。阿斯匹林不可逆地抑制环氧酶，促进凝血嚼烷 a 2 ( t a 2 ) 的产生，t a 2 是血小板凝结和血管收缩的引导物。人体每天摄入3 0 m g 阿斯匹林就 可以完全抑制血小板环氧酶。 其它常规血小板凝结抑制剂有研究逆向测试了单独使用阿斯匹林能否更好的抑制 血小板凝结和心机梗塞，同时研究了阿斯匹林联合其它药物的作用，但结果尚未可知 2 7 1 。 1 4 3 抗凝血剂 香豆素衍生物香豆素衍生物( 杀鼠灵和血液防凝剂) 影响血液凝块形成速度的因 素是、x 和i i ( 凝血素) 。结果发现，p t 和p t t 的转化主要通过抗凝血剂实现， 而不是通过抗血小板凝结药物，服用香豆素衍生物的患者需要通过控制p t 和p t t 来优 化给药量，以防止过量出血。 肝磷脂肝磷脂抑制血栓症是通过使x 失活和抑制凝血素转化为血栓来完成的，x 的 活化阶段是凝血过程的限速步骤。 1 4 4 天然产品 菠萝蛋白酶已有报道证明，菠萝蛋白酶通过刺激血纤维蛋白溶酶原的产生来促进 纤维蛋白溶解【2 引。因为在体外实验中纳豆激酶比血纤维蛋白溶酶更有效的抑制纤维蛋 白，所以纳豆激酶是更有效的纤溶药物。 6 第一章绪论 大蒜油炸蒜和生蒜都能显著增加血清中纤溶物质的活性，并且将纤维蛋白原和血 纤维蛋白肽减少1 0 。被血纤维蛋白溶酶原激活的链激酶和血纤维蛋白肽bb1 5 4 2 也 被增加近1 0 1 2 9 1 ，但是由于大蒜本身的特殊性质，很难处理及保存，所以目前市场上理 想的大蒜产品还少之又少。 人参人参能抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白。据报道，草本植物的作用机理是促 进尿激酶催化作用下的纤维蛋白溶解【3 0 1 。由于人参的草本植物性质决定了产量上的限 制。 1 5 纳豆激酶研究开发现状及应用进展 心脑血管疾病严重的威胁着人类的身体健康，根据w h o ( 世界卫生组织) 公布的统 计数字，全世界现在患有各种血栓性疾病的患者达l ，5 0 0 万之多，其中每年大约有3 0 0 万患者死亡，所需的溶栓剂的潜在市场约2 0 亿美元p 1 1 。随着我国入口老龄化进程的不 断加快，人们生活水平的大幅度提高，纳豆激酶广泛的经济价值和社会效应凸现。 目前临床注射的抗血栓药物普遍存在着稳定性差、药效短、副作用大和成本高等缺 点，因此国内外在治疗血栓病方面正趋向于低价高效、易吸收、体内半衰期长以及可以 口服的药物或保健食品方向发展。纳豆激酶来源于传统发酵食品，生产工艺简单，安全 性高，完全符合治疗血栓病的药品或食品基料的要求，作为一种新型的溶血栓药物，纳 豆激酶有着良好的应用前景。 2 0 世纪9 0 年代，一些研究人员发表了纳豆激酶实验室分离提纯方法，并且记载了 体外实验中它的溶解纤维蛋白活性。1 9 9 0 年，s u m i 等人通过动物试验证明了纳豆激酶 溶血栓能力【3 2 1 。在鼠体内至少有3 种研究论证了纳豆激酶的活性1 3 3 - 3 5 1 。最引人注目的是 1 2 个日本健康志愿者参与的体内试验【3 2 1 。每个受试者每日早餐前食用2 0 0 9 纳豆，然后 进行周期性血液测试，两周后，同样个体每日早餐前食用2 0 0 9 煮熟的大豆，然后收集 血样，食用煮熟大豆的试验组只有微弱变化，相反地，食用纳豆的试验组表现出优球蛋 白溶解时间明显缩短，优球蛋白的纤溶活性提高。这种纤溶活性持续p f o 0 1 ( 1 ，4 ) = 2 1 2 0 ，说明回归方程在c i t = o 0 1 水平上是显著的； 且相关系数r 2 = o 9 9 7 ，更证明了反应时间对数与尿激酶浓度对数之间具有线形相关性。 因此在以后的实验中，可以根据此曲线由反应时间来计算出样品相当于尿激酶酶活力的 数值，即可得纳豆激酶活力。 3 1 2 琼脂糖一纤维蛋白平板法： 尿激酶标准曲线的绘制 第三章实验结果与讨论 将尿激酶稀释一定倍数后，在平板上分别点样，每个孔中加1 0 u l 酶液，置于3 7 。c 恒温箱中保温1 8 h 。用卡尺量取纤溶圈的直径，计算纤溶圈直径乘积，以尿激酶浓度为 横坐标，以纤溶圈直径乘积为纵坐标绘制标准曲线( 见图3 3 ) 。 0 1 0 02 0 03 0 04 0 0 浓度( i w m l ) c o n c e n t r a t i o n ( i u m 1 ) 图3 3 尿激酶标准曲线 f ig3 - 3s t a n d a r do u r v eo fu r o k in a s e a o t i v i t y 将横、纵坐标即尿激酶浓度和反应时间的数值分别取对数，可得呈线性关系的双对 数标准曲线，见图3 - 4 。 缸 u 藿亳 酩 鲁 o 一 j 呈 暑 邑 l1 522 53 尿激酶浓度对数 l o g a r i t h mo fu r o k i n a s ec o n t e n t 图3 4 尿激酶双对数标准曲线 f i 9 3 - 4l o g a ri t h mo u r v eo fu r o k in a s o 标准曲线实验数据与分析见以下各表( 表3 5 、3 - 6 、3 - 7 、3 8 ) 。 2 5 4 3 2 l o novhpo置四州它 铀o p o j o q n8v娶牒堪删 第三章实验结果与讨论 表3 5 琼脂糖一纤维蛋白平板法标准曲线实验数据 t a b i e3 - 5d a t ao ff i b r i np i a t em e t h o d ss t a n d a r dc u r v e 编号12345678 表3 - 6 琼脂糖一纤维蛋白平板法标准曲线实验数据分析表 t a b i e3 6d a t aa n a i y s i 8o ff i b r i np l a t em e t h o d ss t a n d a r dc u r v e 表3 - 7 琼脂糖一纤维蛋白平板法标准曲线实验数据回归分析 t a b i e3 7d a t aa n a i y s i so ff i b r i np l a t em e t h o d ss t a n d a r dc u r v e n = 8 x = i 9 9 l1 2 5y = 0 4 9 5 2 5 y k 名2 0 51 0 8 e x k y k = 8 17 6i ( e y k ) 9 5 6 1 n ( t _ x k ) 工- - 3 1 7 1 7l n ( e x k ) c l y k ) = 7 8 8 8 l y y = 0 0 9 5 0 8 l x x = 0 9 3 2唧= o 2 8 8 1 3 = y j a x = - 0 11 7 1 回归方程：y = 0 3 0 7 5 x o 1 1 7 1x ：尿激酶浓度对数y ：纤溶圈直径乘积对数 第三章实验结果与讨论 表3 - 8 琼脂糖一纤维蛋白平板法标准曲线方差分析 t a b i e 3 8r e s u l ta n a l y s i so ff b r i np l a t em e t h o d ss t a n d a r dc u r v e 经回归分析f = 8 1 4 9 7 f 0 0 l ( 1 ，7 ) = 1 2 2 5 ，说明回归方程在q = o 0 1 水平上是显著的； 且相关系数r 2 = 0 9 9 5 1 ，更证明了纤溶圈直径乘积对数与尿激酶浓度对数之间具有线形 相关性。因此在以后的实验中，可以根据此曲线由纤溶圈直径乘积对数来计算尿激酶酶 活的数值，由此可得纳豆激酶相当于尿激酶活力值。 3 1 3 枯草杆菌蛋白酶活力测定法 向一组试管中分别加入0 ，0 1 0 ，o 2 0 ，o 3 0 ，0 4 0 ，0 5 0 ，0 6 0 ，0 7 0 ，o 8 0 r a l 、10 0 ug m l 浓度的酪氨酸标准溶液，然后分别加去离子水至1 0 0 m l ，再各加5 o o m l0 4 m o l l 碳酸钠溶液，静置1 0 分钟，最后各加入l m l 的f o i l l r 酚乙溶液，摇匀后在4 0 。( 2 下显色 2 0 分钟，在6 8 0 n m 波长下测定吸光度值。然后以酪氨酸的浓度为横坐标，以吸光度值 为纵坐标，绘制标准曲线( 见图3 5 ) 。 趔 毯 采 督 0 2 0 4 0 6 08 01 0 0 酪氨酸浓度( u g a g ) 图3 - 5 酪氨酸标准曲线 f i g 3 5l t y r 3s t a n d a r dc u r v e o o o o o o o o 0 第三章实验结果与讨论 酪氨酸标准曲线的绘制 根据蛋白酶活力的测定方法，首先要作出酪氨酸标准曲线。蛋白酶水解蛋白质，生 成游离的氨基酸和短肽，若酶的活力大，则水解的肽键就越多，生成的氨基酸也愈多， 相应的酪氨酸含量也多。而酪氨酸本身含有苯环，能还原f o l i n 酚乙液成蓝色，从蓝色 的深浅可以求出酪氨酸的浓度，从而确定酶活力的大小。酪氨酸标准曲线实验数据与分 析见以下各表( 表3 - 9 、3 - 1 0 、3 - 1 1 、3 - 1 2 ) 。 表触酪氨酸标准曲线实验数据 t a bie3 9d a t ao fl t y r ss t a n d a r dc u r v e 表3 - 1 0 酪氨酸标准曲线实验数据分析表 t a b i e3 1 0d a t aa n a i y s i so fl - t y r ss t a n d a r dc u r v e 第三章实验结果与讨论 表3 _ 11酪氨酸标准曲线实验数