（食品科学专业论文）腐乳发酵机理、品质改进和模式识别研究.pdf

中文摘要 腐乳是营养丰富的中国传统大豆发酵食品，然而，现行的生产工艺使其在日益激烈的市 场竞争中处于不利地位。在此背景下，结合“腐乳品质改进和新型酶法腐乳”课题研究的目 的，论文首次对青方腐乳酿造过程中蛋白质的降解变化和生产菌株雅致放射毛霉蛋白酶进行 较系统研究；首次从青方腐乳中分离出对风味有促进作用的乳酸菌，并进行初步鉴定；同时， 对”种有代表性腐乳进行理化特性分析和模式识别研究，旨在为腐乳品质改进和酶法腐乳 生产工艺及质量指标的建立提供一定理论依据。 对蛋白质水解引起变化的研究表明，腐乳物性的变化主要发生在后酵3 周以前，蛋白质 凝胶结构的破断对物性有显著影响，而胶粒态的解体对物性影响较小：后酵成熟时，青方腐 乳中无胶粒态蛋白质存在，水溶性蛋白质和氨基态氮的含量分别为3 5 3 6g 1 0 0 9 和2 加 g l o o g ( 干基重) ，硬度、坚实性、粘度和粘附性分别为9 6 7g 、4 7 9 2j 、5 6 2g 和4 8 4j 游离氨基酸总量达到9 8 6g l o o g ( 干基重) ，其中，疏水性亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、缬 氨酸和苯丙氨酸的比率上升到7 6 3 0 ，成为主导游离氨基酸；甲硫醇和二甲基二硫醚是主 要挥发性含硫化合物，未检测出硫化氢的存在。以雅致放射毛霉蛋白酶为主要蛋白酶生产酶 法腐乳时，可使无胶粒态蛋白质存在、氨基态氮含量为2 4 0 9 n o o g ( 干基重) ，并结合物性 的变化，作为蛋白质水解终止的衡量指标。 对雅致放射毛霉蛋白酶的研究显示，该蛋白酶包括胞内和胞外蛋白酶系。其中，胞外蛋 白酶松散结合在菌丝上，菌丝破碎后胞内蛋白酶即释放出来，0 3m o l l 的n a c i 溶液是良好 提取剂。胞内和胞外蛋白酶系分子量组成相似，硫酸铵沉淀起始和终止饱和度分别为3 0 和7 0 ，以大豆分离蛋白为作用底物时，主要产生三种小肽或游离氨基酸。可将胞内和胞 外蛋白酶共同提取制备，作为促进腐乳后熟和新型酶法腐乳生产用主要蛋白酶。蛋白酶液态 发酵均匀设计优化培养基组成为豆粕粉3 7 、蔗糖0 2 、硫酸镁o 0 4 、磷酸二氢钾0 4 和氯化钙0 1 ；优化培养条件为发酵3 2h 、接种量4 、初始d h9 0 和装液量9 0m l ( 每 5 0 0 m l 三角瓶) 。该蛋白酶在中性和微碱性环境中较稳定，在4 0 以下热稳定性良好；n a c i 和乙醇浓度分别在4 和2 以下时，对蛋白酶活力影响较小。新型酶法腐乳生产中，可控 制4 n a c l 和2 乙醇，保持中性、4 0 的水解条件，利于蛋白酶自g 作用和产品风味的改进。 从青方腐乳中分离出三株对风味有促进作用的乳酸菌。其中，两株鉴定为植物乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ) 和短小奇异菌( a t o p o b i u mp a r v u l u s ) ；菌株2 的表型和生理生化 特征与片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 相似，1 6 sr r n a 寡核苷酸序列与玫瑰耐盐球菌( s a l i n i c o c c u s r o s e u s ) 有9 8 的阿源性，可改变腐乳中游离氨基酸含量和呈味特点，降低腐乳物性，是潜 在地改进腐乳和新型酶法腐乳风味的协同菌株。 理化特性和模式识别研究表明，腐乳六个理化特性指标可以三个主成分代替： f l - 一0 8 0 1 x l + 0 8 4 5 x 2 + 0 5 5 3 x 3 + 0 8 1 5 x 4 ，f 2 = - 0 9 2 3 x 6 ，f 3 - o 9 3 5 x 5 。其中，总酸c x 2 ) 、氨 基态氮c x 3 ) 和水溶性无盐固形物( ) ( 4 ) 关系密切，与蛋白质水解度相关；水分( x 1 ) 和 盐( x 5 ) 关系密切。2 7 种腐乳聚为四川腐乳和其它腐乳两大类，中心点分别为3 4 7 1 和1 2 1 5 ， 判别方程为d _ - 0 0 8 0 x 1 + 1 7 4 6 x 2 + 0 3 9 6 x 3 + 0 3 4 8 x 4 + 0 1 4 0 x 5 - 0 3 2 2 x 6 - 0 5 8 0 。总判别正确率为 9 6 3 。可依此方程和中心点，控制腐乳品质和建立酶法腐乳的质量指标。 关键词：腐乳，发酵机理，品质改进，雅致放射毛霉蛋白酶，模式识别 a b s t r a c t s u f u 。ak i n do fc h i n e s et r a d i t i o n a lf e r m e n t e ds o y b e a nf o o d ，i sr i c ho fn u t r i t i o n i th a ss o m e d i s a d v a n t a g e si nc o m p e t i t i o na tm o d e mm a r k e td u et oi t st r a d i t i o n a lp r o c e s s i n gm e t h o d s t h i sp a p e ri s a i m e dt o i m p r o v et h et r a d i t i o n a l s u f up r o d u c t i o na n dd e v e l o pan e wk i n d o fs u f ub ye n z y m a t i c t r e a t m e n t t h ec h a n g e sb yp r o t e o l y s i sa n dt e x t u r ep r o f i l e sd u r i n gg r e ys u f uf e r m e n t a t i o n ，t h ep m t e a s e g e n e r a t e db yt h es t a r t e rc u l t u r ea c t i n o m u c o re l e g a n s ( a s3 2 2 7 ) a n dt h el a e t o b a e i l l u ss e p a r a t e df r o m g r e ys u f ua n dt h e i rc o n t r i b u t t i o n st oi t sf l a v o rw e r ef i r s t l yi n v e s t i g a t e d t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a l p r o p e r t i e sa n d m o d e i d e n t i f i c a t i o n o f 2 7 k i n d s o f t y p i c a ls u f u w e r es t u d i e d r e s u l t so fc h a n g e sb yp r o t e o l y s i sa n dt e x t u r ep r o f i l e so fs u f us h o w e dt h a tt h ec h a n g e so ft e x t u r e ， r e s u l t i n gm a i n l yf r o mt h eb r e a k a g eo fg e ls t r u c t u r e ，m a i n l yo c c u r r e dd u i r i n gt h ei n i t i a l3w e e k so f r i p e n i n g n og r a n u l ep r o t e i n sw e r ef o u n di nr i p e n e dg r e ys u f o t h ec o n t e n t so ft o t a lw a t e rs o l u b l e p r o t e i na n da m i n on i t r o g e nr e a c h e d 协3 5 3 6g n 0 0 9a n d2 4 0g l o o g ( d r yb a s e ) t h eh a r d n e s s , f i r m n e s s ， s t i c k n e s sa n da d h e s i v e n e s sw e r e9 6 7 舀4 7 9 2j ，5 6 2 9a n d4 8 4 j ，r e s p e c t i v e l y t h et o t a lc o n t e n to ff r e e a m i n oa c i dr e a c h e dt o9 8 6e d l 0 0 9 ( d r yb a s e ) , i nw h i c hl c u e i n e ，a l a n i n e ，i s o l e u c i n e ，v a l i n ea n d p h e n y l a l a n i n ew e r ed o m i n a n tf r e ea m i n oa c i d sa n dt h er a t ew a s7 6 3 0 m e t h a n e t h i o la n dd i s u l f i d e d i n t h y lw e r em a i nv o l a t i l ec o m p o n e n t sa n dn os u i f u m t e dh y d r o g e n w a sd e t e c t e du n d e rt h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s i tw a ss u g g e s t e dt h a tt h ec o m b i n a t i o no ft h ec h a n g e so ft e x t u r ew i t ht h e d i s a p p e a r a n c eo f g r a n u l ep r o t e i na n dt h ec o n t e n to f a m i n on i t r o g e nb e i n g2 4 0g o o g ( d r yb a s e ) c o u l d b ei n d e xf o re n d i n gp r o t e o l y s i sd u i r i n gt h ep r o d u c t i o no fn e ws u f o t h e r ew e r et w ok i n d so fp r o t e a s es y s t e m sg e n e r a t e db ya c t i n o m u c o re l e g a n s ，i n t r a c e l l u l a ra n d e x t r a c e l l u l a rp r o t e a s es y s t e m t h ei n t r a c e l l u l a rp m t e a s es y s t e mc o u l db er e l e a s e db yc r a s h i n gt h e m y c e l i a la n dt h ee x t r a c e l l u l a rl o o s e l yc l u n go u t s i d eo ft h em y c e l i a l b o t hc o u l db ee x t r a c t e dw e l lb y 0 3m o l ln a c la n ds h o w e ds i m i l a rm o l e c u l a rw e i g h t s ，p r e c i p i t a t i o nc u r v eb y ( n i 屯) 2 s 0 4a n d h y d r o l y s a t e s ，w h i c hi m p l i e dt h a tb o t ht h ei n t r a c e l l u l a ra n de x t r a e e l l u l a rp r o t e a s c sc o u l db ep r e p a r e d s i m u l t a n e o u s l ya n dt 1 1 e yc o u l db eu s e df o rs u f ur i p e n i n ga n dt h ep r o d u c t i o no fn s e t h eo p t i m u m e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so b t a i n e db yu n i f o r md e s i g nf o rp r o d u c t i o no fp m t e a s ew e r e ：t h ec u l t u r e m e d i u mw e r e3 弼p o w d e ro fs o y b e a nc a k e ，0 2 s u c r o s e ，0 0 4 m g s 0 4 、0 4 k h 2 p 0 4a n d0 1 c a c l 2 ；t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw e r e3 2h ，4 i n o c u l a t i o n ，i n i t i a lp h9 0a n d9 0m l c u l t u r em e d i u m p e r5 0 0m l c o n i c a lf l a s k t h ep r o t e a s ep r e p a r a t i o nw a sc o m p a r a t i v e l ys t a b l eu n d e rn e u t r a lc o n d i t i o n 4 0 ，4 n a c ia n d2 e t h a n a o lc o n t e n t ，w h i c hc o u l db eu s e da st h ec o n d i t i o nf o rn e ws b f op r o d u c t i o n t h r e el a c t o b a c f l l u ss t r a i n sw e r es e p a r a t e df r o mg r e ys u f u ，a l lo fw h i c hc o u l di m p r o v et h ef l a v o ro f g r e ys u f u t w oo ft h e mw e r e i d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ma n da t o p o b i u mp a r v u l u s , r e s p e c t i v e l y t h et h i r ds t r a i n s h o w e ds i m i l a rc o l o n y , s h a p e ，m o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e sw i t hp e d i o c o c c u s ，h o w e v e r , 9 8 s i m i l a r i t yw i t hs a f i n i c o c c u sr o s e u sb y1 6 s r r n aa n a l y s i s a f t e rt h es t r a i n 矿w a sa d d e dt op r o d u c eg r e ys u f o ，t h ec o n t e n to ff r e ea m i n oa c i d ， s e n s o r yp r o p e r t ya n dt e x t u r eo fs u f uc h a n g e d w h i c hs u g g e s t e dt h es t r a i nr w a sap o t e n t i a ln o n 。s t a r t e r l a c t o b a c i l l u st h a tc o u l di m p r o v et h ef l a v o ro fs u f ua n dt h en e we n z y m a t i c a l l yt r e a t e ds u f u r e s u l t so fp h y s i c a la n dc h e m i c a lp m p e a i e sa n dm o d ei d e n t i f i c a t i o no fs u f us u g g e s t e dt h a tt h es i x p h y s i c a la n dc h e m i c a li n d e xc o u l d b er e p l a c e db yt h r e e p r j n c i p a lc o m p o n e n t s t h em o d e l s w e r e f 1 = - 0 8 0 1 x l + 0 8 4 5 x z + 0 5 5 3 x 3 + o 8 1 5 x 4 ，f 2 - 0 9 2 3 x 6 ，f 3 = o 9 3 5 x 5 t o t a la c i d , a m i n on i t r o g e na n d w a t e rs o l u b l es o l i dw e r er e l a t e dt op r o t e o l y s i sa n dt h e yh a dah i g hr e l a t i v ec o e f f i c i e n c y t h e r ew a sa c l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm o i s t u r ec o n t e n ta n dc o n c e n t r a t i o no fn a c i t h et y p i c a l2 7t y p e so fc h i n e s e s u f uw e r ec l a s s i f i e di n t ot w og r o u p s 。i nw h i c ht h ec e n t e rs c o r e sw e r e3 4 7 1a n d 一1 _ 2 1 5 ，r e s p e c t i v d y 9 6 3 o fo f i g m a lc a s e sw e r ec o r r e c t l yc l a s s i f i e da c c o r d i n gt ot h ee q u a t i o n 。t h ed i s c r i m i n a n te q u a t i o n w a sd ；0 0 8 0 x 1 + 1 7 4 6 x 2 + o 3 9 6 x 3 + 0 3 4 8 x 4 + 0 1 4 0 x 5 - 0 3 2 2 x 6 - 0 5 8 0 。i tw a ss u g g e s t e dt h a tt h e e q u a t i o na n dc e n t e rs c o r ec o u l db eu s e f u l t o o l sf o rm o n i t o r i n gt h eq u a l i t yo fs u f ua n dt h en e w e n z y m a t i c a l l yt r e a t e ds u f u k e yw o r d s ：s u f u ，f e r m e n t a t i o nm e c h a n i s m ，i m p r o v e m e n to fq u a l i t y ，p r o t e a s eo f a c t i n o m u c o re l e g a n s ， m o d ei d e n t i f i c a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 奚呔 牡 j 时间：嬲年6 月尸日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究一：车砷 导师签名： j 嬲 时间：嬲年占月p 日 1 1 研究背景 1 1 1 开发大豆蛋白资源的意义 第一章绪论 中国是大豆的故乡，j o h n s o n 在美国大百科全1 s 中写到，“大豆是中国文明基础的五谷之 一。远在商代时，中国就有了种植大豆的记载，汉代以后，种植面积不断增加，遍及全国。公 元前2 0 0 年左右，大豆由中国华北传至朝鲜，经朝鲜传入日本，1 8 世纪后逐渐传播至欧美各国， 现成为世界性的粮油作物，是人类不可缺少的食物资源f 李里特等，2 0 0 2 ) 。 当今，人口膨胀使人类面临着资源短缺的严重挑战。根据f a o 统计，发展中国家有2 0 的 居民热量不足。6 0 的居民食物中蛋白质不足( 王薇，1 9 9 7 ) ，蛋白质资源不足成为亟待解决的问 题之一。 大豆蛋白是重要的植物蛋白资源社会经济成本极为低廉，具有数量优势、质量优势和不同 方式利用的经济价值优势( 陆恒，1 9 9 7 ) 。食品和农业科学家的研究证明，若以同样的成本和能 茸发展动物食品原料或发展豆类及其它植物性食品原料，其回收率前者仅为5 2 0 ，而后者为 前者的5 1 0 倍。按每生产1k g 蛋r 的社会平均耗能( m g k g ) 计算，大豆蛋白3 0 ，小麦蛋白5 0 ， 大米蛋白1 5 5 ，鸡蛋蛋白2 8 5 ，鸡肉蛋白3 3 0 ，鱼蛋白5 3 0 ，牛奶蛋白5 8 5 ，猪肉蛋r5 9 0 ，牛肉 蛋白1 3 0 0 。即生产1k g 牛肉消耗的能量可生产4 0k g 多大豆蛋白，平均生产lk g 动物性蛋白需 要消耗4 k g 的植物性蛋白；1 公顷土地可生产动物性蛋白4 8 k g ，如生产大豆蛋白则可获得6 7 2 k g 。 可见大豆蛋白具有很高的转换率( 刘国志和孙敏。1 9 9 5 ) 。 大豆蛋白不仅社会经济成本低廉，还具有优良的营养品质。研究表明，动物性食品进食过多 是导致心血管病、脑血管病、肥胖症、糖尿病等所谓“文明病”增加的原因之一。大豆蛋自中必 需氨基酸齐全，氨基酸配比好( 见表1 1 ) ，蛋白质消化率修正后的氨基酸评分值( p d c a a s ) 为1 0 ( y o u n g ，1 9 9 1 ) ，与肉、蛋、奶相近似，是植物中唯一类似于动物蛋白的完全蛋白质，且 没有动物性蛋白质的副作用，如引发肥胖症、心血管病和高胆固醇症等。大豆蛋白本身还具有降 低血液中的低密度脂蛋白( h a m c h a p m a n 。1 9 9 3 ) 、减少身体内钙的损失( h u i t b e r gc ta 1 。1 9 9 3 ) 等重要生理功能。特别是随着大豆低聚糖、大豆异黄酮、大豆磷脂、大豆皂甙、大豆多肽和大豆 膳食纤维等活性物质功能性的明朗，大豆成为功能性因子的宝库。大豆功能性食品也日益受到人 们的关注。因此，营养学家告诫人们，在膳食结构中应增加植物性蛋白质，尤其要增加大豆食品。 大豆食品在我国已有两千多年的生产历史，在我国人民的膳食结构中历来占有重要地位，对 中华民族的繁衍生存、强身健体发挥了极其重要的作用。在日本，大豆食品也有三百多年的生产 + 蛋白质消化率修正后的氨基酸评分值( p d c a a s ) ：以1 9 8 5 年f a o w h o 对2 5 岁儿童的推荐模式为标准蛋 白计算出待测蛋白的各种必需氨基陵得分，必需氨基酸的最低得分与待测蛋白消化率的乘积，就是待测蛋白的 p d c a a s 。 中凰农业大学博士学位论文第一章绪论 历史，在一些欧美国家，大豆食品以每年4 0 的速度增长。自2 0 世纪6 0 年代以来，国内外学者 一直着手传统大豆食品的研究与开发范围涉及中国的豆腐、腐乳、豆豉、腐竹，印度尼两亚的 天培( t e m p e h ) ，日本的味噌( m i s o ) 和纳豆( n a t t o ) 等，传统大豆食品成为引人注目的研究课 题。美国食品和药物管理局在1 9 9 9 年底做出决定，准许食品生产商为脂肪含量低、同时至少含 有6 2 5 克大豆的产品添加“健康食品”的标志，为大豆食品迅速走向市场大开绿灯。与此同时 美国心脏学会也建议美国人多吃大豆，向人们进行食用大豆的健康教育。美国大豆协会预测，到 2 0 2 0 年，世界大豆产量的一半将被加工成食品。美国经济展望杂志撰文指出，“未来十年， 最成功、最有市场的并非汽车、电视机或电子产品，乃是中国的豆腐”( 李里特。2 0 0 3 ) 。这里所 言的“豆腐”，确切地说，是各种大豆食品的总称。 表1 - 1 一些食物中必需氟基酸组成的比较+ t a b l e1 - 1 c o m p a r i s o no f c o m p o s i t i o no f e s s e n t i a l a m i n o a c i di ns o m ef o o d s - ：此袁日i 白李理( 1 9 9 9 a ) 我国大豆产量位居世界第四，年总产量超过1 5 0 0 万吨，然而，大部分仅作为原材料进入国 际市场，惊人的利润拱手让给别人。全国营养调查结栗表明，由于我国人民当前的膳食结构以植 物性为主，优质蛋白质、维生素a 、b2 、d 以及微量元素钙、铁、锌摄入不足；同时，在城市部 分人群中，动物性食物摄取量过高出现某些营养素过剩，造成部分人群中出现了某些营养性疾病， 影响了一代人或两代人的健康。只有提倡合理的平衡膳食才能摆脱这种困扰。营养专家认为利 用大豆蛋白是解决优质蛋白和其它营养素不足的主要途径( 殷泰安，2 0 0 0 ) 。因此，多层次、多 途径的开发利用大豆蛋白资源，对调整我国人民的食物结构、解决目前膳食结构中优质蛋白质数 量不足的问题、促进功能性食品在我国的开发生产具有十分重要的意义( 李婉涛和吴祖兴，1 9 9 6 ) 。 1 1 1 2 中国传统太豆发酵食品腐乳 腐乳古称乳腐，又称乳豆腐、霉豆腐、酱豆腐、臭豆腐或长毛豆腐，英文译名有s u f u ，t o s u f ， f u - s u ，f u y u 等十几种( w a n g h e s s e l t i n e ，1 9 7 0 ) ：在日本，腐乳叫做t o f u y o ，n y u - f u 或f u - n y u ： 在越南，叫做c h a o ；菲律宾人称腐乳为t a - h u r i ，泰国人则称之为t a o h u y i ( h a ne ta 1 2 0 0 l a ) 。腐， 有变质意，引中为发酵和酿造；乳，有汁液意，既可称乳汁， 又可特指豆浆。发酵成熟的腐乳具有营养丰富、质构细腻柔滑、滋味鲜美和诱人食欲的特点，是 人们喜爱的开胃佐餐食品和调味品，在众多的豆制品中占有十分重要的位置。在欧美，腐乳因质 构类似软千酪而被称为c h i n e s e - c h e e s e ( s u ，1 9 8 6 ：s t e i n k r a u s ，1 9 9 6 ) 。 2 中国农业大学博士学位论文第一章绪论 腐乳是在豆腐生产基础上发展起来的发酵型大豆食品，是继豆腐之后，我国劳动人民在大豆 食品方面的又一发明创造。腐乳有着悠久的酿造历史，在1 5 0 0 多年前北魏末年的古籍中，即有 腌制型腐乳的记载，“干豆腐加盐成熟后为腐乳”。到了明代，已有详细记载发霉腐乳制作法的文 献，如王士桢食宪鸿秘中记载，“豆腐( 指腐乳) 如法，豆腐压极干或绵纸裹，入灰收干。 切方块，排列蒸笼内”；李日华蓬拢夜话中记载了“黟县人喜于夏秋间醢腐，另变色生 毛，随试之，俟稍干”。在清代，有关腐乳的史料大增，除涉及腐乳的制作方法，也提到腐 乳的食用及营养特点，如赵学敏本草纲目拾遗中记载，“以豆腐腌过酒糟或酱制者，味甘咸， 性平，养胃调中”；王士雄饮食谱中记载，“腐干而再造者为腐乳，陈久愈佳，最宜病人”； 袁牧的随园食单中提到了“广西白腐乳昧甚佳”；李石亭的醒园录中记载了两种“酱豆 腐乳法”；汪日桢的湖雅中描述“豆腐腌霉为腐乳坯，出黑镇酱肆，取坯制成腐乳”。足见腐 乳生产与食用之广泛。明代时，腐乳传入朝鲜，品种主要是辣腐乳，称为“蛮辣酱”；1 8 世纪， 腐乳制作技术飘扬过海，传到日本及东南亚各国( 洪光住，1 9 8 4 ，1 9 8 5 ：刘庆玮，1 9 8 8 ：杨淑嫒 等，1 9 8 9 ；王瑞芝，1 9 9 8 b ：张平真，2 0 0 2 ；p r a j a p a t i n a i r ，2 0 0 3 ) 。 在中国，腐乳的产地遍及全国，其中以北京、江苏的苏州、无锡，浙江的绍兴。以及广东、 广西、四川、湖南等地区生产的腐乳晟为有名。由于各地气候、风土、饮食习惯及口味嗜好等的 客观影响，腐乳的制作方法各有特点，逐渐形成了各具特色的传统产品和地方名特产品，但都是 以大豆为原料，经过相似的物理化学和生物化学过程实现的。中国传统腐乳的分类见图1 - 1 ( 李 幼筠，1 9 9 7 ) 。 飙厂型 i 三毛 | 腐乳t 产品类型，薹差圣 。细菌型 围1 - 1中国传统腐乳的分类 f i g 1 - 1 c l a s s i f i c a t i o no f c h i n e s et r a d i t i o n a ls u f u 目前，腐乳生产中使用最普遍的是毛霉型纯种发酵，生产过程见图1 - 2 。 园一浸泡一磨浆团呻加热一凝固一匡圈一接种一培养一图 一腌制一圜一配料一装瓶一后酵一圆 圈1 - 2 毛霉型纯种发酵腐乳生产流程图 f i g 1 - 2 f l o ws h e e to ff e r m e n t e ds u f ub ym u i r 3 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 图1 - 2 表明，腐乳的生产过程可以分为物理化学过程和生物化学过程。其中，物理化学过程 是白坯的制作过程，包括大豆浸泡、磨豆、滤浆、煮浆、点浆、上榨、压榨和划块成型等工序； 生物化学过程包括前期培菌( 前酵) 和后期发酵( 后酵) 。前期培菌时，毛霉在豆腐向坯上生& ， 生成的菌丝体使坯体包裹成型，分泌的酶类使蛋白质等大分子物质部分降解：后酵过程则是坯体 中蛋白质等大分子物质降解、以及生成的产物与辅料中的化学物质的协同作用酯化成香的过程 ( 余若黔等，2 0 0 1 a ，2 0 0 1 b ) 。经过发酵后熟，腐乳形成了特有的色、香、味、体，细嫩柔糯、 富有营养。 1 1 3 传统腐乳生产中存在的问题 虽然腐乳的生产经历了数千年的发展，但现行的工艺中仍然存在着许多的问题。 首先，在传统的观念中，腐乳的形态是块状的。我国国家行业标准腐乳质量标准和检验方 法( s b ，r1 0 1 7 0 9 3 ) 中，明确规定了腐乳的组织形态是“块形整齐、厚薄均匀、质地细腻”。然 而，在食品科学和技术迅速发展的今天，尤其是在注重特色产品的市场经济中，腐乳这一中国传 统特色食晶，却长期处于落后的状态，其块状形态的概念在一定程度上影响了腐乳行业的发展。 为了追求完美的块形，人们只能沿用手工操作进行摆笼、搓毛、腌制和装瓶等，无法机械化生产， 难以提高生产效率，严重制约了大生产的发展。同时，块状产品的包装也较粗糙低劣，难以吸引 消费欲望；方块的腐乳必须加封面汁液，否则，露空的腐乳会出现褐变发黑，很不雅观；取食时， 人们要小心翼翼的挑取下层的腐乳，而不食用那些汁液，因此，对腐乳的不均匀性有着很深的戒 备心理，这些都影响着腐乳市场的发展( 林中煌，2 0 0 0 ) 。 其次，腐乳生产中应用的微生物主要是毛霉，如五通桥毛霉( 肛w u t u n g k i a o ，a s3 2 5 ) 、腐 乳毛霉( m u c o r5 h 向) 和雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o re l e g a n s ，a s3 2 2 7 ) 等。与其它霉菌相比， 毛霉不易产生孢子，且孢子量少，在制各菌种时工艺较复杂，菌种选育的繁杂带来一系列的问题， 使腐乳生产周期冗长、含盐量高；同时，毛霉的耐温性较差，最适台生长温度在2 5 左右，3 0 以上生长困难，3 5 c 以上不生长甚至死亡，所以，夏季时腐乳难以生产；再者，在游离氧分子的 存在下，毛霉分泌的儿茶酚氧化酶能催化酚类物质氧化成醌，羟醌聚合最终形成黑色素，造成腐 乳产生褐斑，严重影响产品质量( 李理，1 9 9 9 a ) 。 第三，腐乳的后酵是一个漫长而复杂的过程，是蛋白质降解、形成腐乳特有风味的主要阶段。 腐乳后熟期一般为2 至6 个月，甚至更欧，因此，半成品占用空问大，给扩大生产规模带来困难。 第四，为了后酵过程中防腐的需要，传统腐乳的含盐量非常高。这与现代人对低盐化食品的 需求相抵阻；同时，由于腐乳是粗放式的生产过程，卫生条件相对较差，产品质量难以统一，严 重影响了腐乳产品走向国际化市场。 上述诸多问题都严重地制约了腐乳生产的工业化和规模化，限制了企业的发展。 1 1 4 开发新型酶法腐乳的意义 4 腐乳以其品种多样、风味独特、滋味鲜美、营养丰富和价格低廉的特点，越来越受到国内外 中国农业大学博士学位论文 第一章绪论 研究者和消费者的关注和喜爱。早在2 0 世纪7 0 年代，日本巯球大学安田正昭研究组在预计现代 人们使用嗜好的转向时，认为腐乳这样的大豆发酵食品必将受到人们的注目。他们立题研究传统 冲绳腐乳的制作，得到了政府的资助，历时十余年，现己转向新型腐乳的技术开发。在日本，腐 乳还是方便复合c o o k d o - 烤肉酱调味料的主要原料之一。尽管美国鲜有其特色腐乳，但他们对腐 乳的兴趣日渐增强。1 9 5 2 年，美国伊利诺斯大学的s t e i n 以高大毛霉( m u c o r m u c e d o ) 的生理学 特征及其在腐乳发酵过程中所起的作用作为其博十论文课题；2 0 世纪6 0 年代，美国农业部资助 w a i 在台湾对中国腐乳进行基础研究，并比较各种工艺的特点；7 0 年代后，美国北部地区研究中 心陆续发表多篇有关腐乳产品介绍及其基础研究的论文( 赵玉莲，1 9 9 7 ) 。目前，我国腐乳已出 口东南亚、日本和美国等国家和地区。 腐乳生产中，大豆蛋白热变性后形成的线形高分子互相接近，在凝固剂中c a “，m 矿+ 、n a + 和矿等离子交联作用下形成网状骨架，水包含在网状骨架内，形成坚实、具有网络结构的蛋白 质凝胶体( 时长春和耿薇，1 9 9 8 ；c h e n g ，2 0 0 4 ) 。发酵过程中，大豆蛋白质水解成为分子量较小 的肽等产物，蛋白质的凝胶结构解体，坯体失去弹性。由于毛霉菌丝体在坯体外形成的致密皮膜 的包裹作用，腐乳不至于散烂，得以保持块状的形态。然而，从字面释义，腐乳并无块状的含义 块状形态成为制约腐乳发展的重要囚素。 传统腐乳生产中，腐乳白坯经前期培菌、瑭花、搓毛后，成为具有致密菌丝皮膜的毛坯，这 些工序的目的，不仅在于使毛霉产生丰富的蛋白酶等酶系，而且对腐乳保持块状的形态具有极其 重要的作用：毛坯腌制后成为盐坯，加盐腌制的主要作用是使腐乳毛坯中部分水分渗透析出，坯 体不松烂。同时赋予腐乳咸味和增鲜作用，在长期的后酵过程中杀菌防腐，保证长期发酵的正常 进行，并抑制蛋白酶的作用，利于腐乳的保形和香气的生成。如果腐乳是膏状而非块状形态， 则工艺中无需制坯、手工摆笼、搓毛、腌坯和装瓶等操作，食盐也只需起赋予产品咸昧和增鲜作 用，在很大程度上，腐乳的生产可简化为以蛋白酶为主的酶解过程和生化反应过程，不仅有利于 腐乳生产的机械化，而且利于产品的低盐化。并可缩短生产周期，大大提高生产效率。同时，膏 状的腐乳可以保持形态的均匀一致，还可以采用多种多样的包装形式，使产品显得高档卫生，增 强人们选购的信心。实际生活中，人们在食用腐乳或用其调味烹饪时，常常是将块状腐乳研烂后 才使用，因此。膏状形态还符合食用的需要，既方便又卫生。现在，美国市场已有一种奶油状涂 抹腐乳产品( 王世平，1 9 8 9 ) 。 大豆蛋白质主要是贮存于子叶砸细胞结构蛋白体中的蛋白质。应用超速离心分离方法对大豆 蛋白质分离分析，按照沉降模式，在0 5 离子强度的介质溶液中，可分为2s 、7s 、1 1s 和1 5s 四个主要的组份，它们的比例分别为9 4 、4 3 、4 3 6 和4 6 。按照分子量由大到小的排列， 1 5s 较大，2s 较小。2 s 组份中古有胰蛋白酶抑制剂，这种蛋白具有生物活性，对大豆蛋白营养 具有重要意义；1 5s 组份蛋白是1 1s 球蛋白的聚合物，分子量很大。然而，在传统腐乳生产中， 这两种组分蛋白往往残留于黄浆水和豆渣中，同时，相当多的大豆低聚糖、大豆异黄酮等具有生 物活性的功能性成分也损失殆尽，大豆资源没有得到很好的利用。 现代社会要求食品具有可食性、嗜好性、营养性、贮藏性、流通性、简便性和商品性七个方 面的性质，还要发挥营养、嗜好、生理和文化四大功能。传统大豆食品是中华食品之瑰宝，生产 5 中国农业大学博上学位论文第一章绪论 技术多为祖传技艺，其中包含了不少可贵的科学技术是几千年劳动人民智慧的结晶。然而，以 现代食品的标准衡量，无论在加工工艺上，还是在产品质量上，都有很多混沌不清、不尽合理的 因素，正是这些因素影响了其完善和发展，在洋式西餐的冲击f 黯然失色，尤其弱在贮藏性、流 通性、简便性和商品性方面，即不符合食品卫生、规格化、标准化和方便化的要求。在日益激烈 的市场竞争中越来越处于不利的地位( 李里特，2 0 0 3 ) 因此，腐乳等中国传统食品急需注入现 代食品加工技术，在保持传统食品风味特色的基础上，采用高新技术，实现产品的根本变革，使 之符合现代社会对食品的要求。在此背景下，对腐乳进行改进，并开发具有腐乳基本风味和功能 性的、新型膏状酶法腐乳势在必行。 腐乳的后酵成熟阶段是坯体中大分子物质降解与酯化成香的主要过程。在此期间，蛋白质的 水解程度被认为是影响腐乳风味、质地的主要因素。毛霉红腐乳蛋白质的s d s p a g e 分析表明， 由于受微生物分泌的蛋白酶的作用，无论在腐乳汤汁中，还是在腐乳表层和腐乳块中，都不存在 完摧的大豆蛋白质，大豆蛋白已经水解为分子量较小的肽类等( h a ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。腐乳发酵成 熟后，小分子短肽( 平均肽链长度 1 0 ) 约占腐乳水溶性部分总氮量的8 6 4 8 8 9 ( w w ) ，与腐乳 的鲜昧有密切关系。因此，腐乳酿造中最根本的变化是由大豆蛋白质水解引发的一系列反应，腐 乳酿造的实质是以蛋白酶作用大豆蛋白质为主的生物化学过程。 传统腐乳生产中，毛霉分泌的蛋白酶活力并不高，其中性蛋白酶活力最高仅为6 5 5 2 u g ( 绝 干基计) ，符合腐乳生产的需要。因为，如果蛋白酶的活力过高，会造成蛋r 质的分解过快，腐 乳在还未形成必要的风味时就已溃散，不利于腐乳良好形态的保持。在后酵汤料中，既要追加红 米、酒醪，又耍补充淀粉、糖、乙醇、脂肪等呈香前体物质和香辛料等多种成分，以弥孙前期培 菌时酶系的不足，促进更多风味物质的形成。也就是说，辅料为腐乳的发酵提供了更多更全的酶 系和风味物质。通过千变万化、巧妙搭配的辅料组合及精湛的操作技艺，最终造就出风味纷呈、 脍炙人口的腐乳佳品( 李幼筠，1 9 9 9 ) 。这一特点为酶法腐乳生产提供了理论依据。 青方腐乳又名青腐乳，因产品外观呈青色或豆青色而得名，是众多的腐乳种类中最独具特色 的一类。通常认为，青方腐乳在发酵过程中因部分蛋白质降解游离出硫氢基和氨基，产生具有硫 臭和氨臭等特殊强烈刺激性气味，因此又被称为臭腐乳，俗称臭豆腐。与其它种类腐乳相比，青 方腐乳中蛋白质分解较彻底，氨基酸含量丰富，特别是含有较多的丙氨酸，使味觉感受到独特的 甜味和酯香味，从而构成其独特的风味，虽然“闻着臭”，却具有“吃着香”的特点( 王晖，钟 冠山，2 0 0 3 ) 。“王致和臭豆腐”是著名的青方腐乳品牌，在现行的纯种发酵生产中，雅致放射毛 霉( a c a d e m i as i n i c aa s3 2 2 7 ) 是唯一接入的生产菌株，汤料中只含有盐、水和少量花椒，没有 大量外源蛋白酶以及淀粉、酒等增加风味的前体物质的引入，因此，毛霉蛋白酶对大豆蛋白质的 降解起着至关重要的作用，蛋白质的水解产物是形成青方腐乳独特鲜美滋味的重要因素。 微生物具有生睦繁殖快、世代时间短、产量高、不受季节和地区限制的特点，且培养简单易 行，生产规模可大可小，采用发酵罐培养技术，可以各种规模生产备种酶制剂。联合国农业粮食 组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 的食品添加剂