丙型肝炎病毒实验室检测技术规范.doc

丙型肝炎病毒实验室检测技术规范丙型肝炎病毒实验室检测技术规范 中国疾病预防控制中心中国疾病预防控制中心 二二一一年五月二十日年五月二十日 前前 言言 丙型肝炎已呈全球性流行。据世界卫生组织统计，全球丙型肝炎已呈全球性流行。据世界卫生组织统计，全球 hcvhcv 的感染率约为的感染率约为 3%3%，估计约，估计约 1.71.7 亿人感染亿人感染 hcvhcv，每年新发丙型肝炎病例约，每年新发丙型肝炎病例约 3.53.5 万例。我国病毒性肝炎的发病人数一直位于所有万例。我国病毒性肝炎的发病人数一直位于所有 传染病的前列，而丙型肝炎报告发病率在病毒性肝炎中也呈现上升趋势。丙型肝炎是一种主要传染病的前列，而丙型肝炎报告发病率在病毒性肝炎中也呈现上升趋势。丙型肝炎是一种主要 经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发 展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。 丙型肝炎给人类带来了如此巨大的危害，在目前还没有疫苗的情况下，早期发现、早期治丙型肝炎给人类带来了如此巨大的危害，在目前还没有疫苗的情况下，早期发现、早期治 疗至关重要。然而，大众对于丙型肝炎认知的欠缺、患者缺乏明显症状、在高危人群中早期发疗至关重要。然而，大众对于丙型肝炎认知的欠缺、患者缺乏明显症状、在高危人群中早期发 现丙型肝炎患者的机制的缺乏，都使丙型肝炎防治面临巨大的挑战。现丙型肝炎患者的机制的缺乏，都使丙型肝炎防治面临巨大的挑战。 目前丙型肝炎病毒检测已经在疾病预防控制机构、医疗机构、采供血机构、出入境检验检目前丙型肝炎病毒检测已经在疾病预防控制机构、医疗机构、采供血机构、出入境检验检 疫机构等广泛开展，但是疫机构等广泛开展，但是我国在丙型肝炎病毒实验室检测方面尚存在检测策略不明确、检测程我国在丙型肝炎病毒实验室检测方面尚存在检测策略不明确、检测程 序不标准、检测结果解释不规范等问题。临床实验室检测中存在大量的假阳性、假阴性结果。序不标准、检测结果解释不规范等问题。临床实验室检测中存在大量的假阳性、假阴性结果。 鉴于此，为加强全国丙型肝炎检测工作，提高实验室检测质量，急需制订关于丙型肝炎病毒实鉴于此，为加强全国丙型肝炎检测工作，提高实验室检测质量，急需制订关于丙型肝炎病毒实 验室检测的技术规范。验室检测的技术规范。 受卫生部委托，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心于受卫生部委托，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心于 2008 年年 10 月月 25 日在北日在北 京召开了首次京召开了首次丙型肝炎病毒实验室检测技术规范丙型肝炎病毒实验室检测技术规范 （以下简称（以下简称规范规范 ）编写组工作会议。卫）编写组工作会议。卫 生部及中国疾病预防控制中心的有关领导从全国丙型肝炎防控管理角度，为生部及中国疾病预防控制中心的有关领导从全国丙型肝炎防控管理角度，为规范规范编写内容编写内容 提出了几点要求：提出了几点要求： 1 规范规范内容要考虑为公共卫生服务，要考虑到基层的具体情况。内容要考虑为公共卫生服务，要考虑到基层的具体情况。 规范规范制订的标准要制订的标准要 有实用性及可操作性。有实用性及可操作性。 2 规范规范内容要有发展的眼光，要考虑经济发展和技术进步。内容要有发展的眼光，要考虑经济发展和技术进步。 规范规范内容要有一定的前内容要有一定的前 瞻性，要有较长的使用寿命。瞻性，要有较长的使用寿命。 3 规范规范内容要有大局观念，要考虑有利于各系统的发展。内容要有大局观念，要考虑有利于各系统的发展。 规范规范编写要借鉴国外经验、编写要借鉴国外经验、 立足国内具体情况。立足国内具体情况。 随后，随后，在卫生部和中国疾病预防控制中心有关领导的支持下，中国疾病预防控制中心性病在卫生部和中国疾病预防控制中心有关领导的支持下，中国疾病预防控制中心性病 艾滋病预防控制中心组织国内有关专家，历时近两年，经过反复多次修改，制订完成了我国艾滋病预防控制中心组织国内有关专家，历时近两年，经过反复多次修改，制订完成了我国 丙型肝炎病毒实验室检测技术规范丙型肝炎病毒实验室检测技术规范。规范规范共分九章，包括：丙型肝炎病毒，丙型肝炎共分九章，包括：丙型肝炎病毒，丙型肝炎 病毒抗体检测，丙型肝炎病毒抗原检测，丙型肝炎病毒核酸检测，丙型肝炎病毒检测策略，丙病毒抗体检测，丙型肝炎病毒抗原检测，丙型肝炎病毒核酸检测，丙型肝炎病毒检测策略，丙 型肝炎病毒细胞培养，实验样品的采集、保存、运输，丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控型肝炎病毒细胞培养，实验样品的采集、保存、运输，丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控 制及能力验证和实验室生物安全。制及能力验证和实验室生物安全。 现代医学的发展日新月异，新理论、新观点、新的诊断技术和新的防治策略不断出现，中现代医学的发展日新月异，新理论、新观点、新的诊断技术和新的防治策略不断出现，中 国疾病预防控制中心将根据最新的临床医学证据适时组织专家组对本国疾病预防控制中心将根据最新的临床医学证据适时组织专家组对本规范规范进行修改和更新。进行修改和更新。 本本规范规范主要起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。主要起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。 本本规范规范参加编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国疾参加编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国疾 病预防控制中心病毒病预防控制中心、北京大学医学部、北京人民医院、上海巴斯德研究病预防控制中心病毒病预防控制中心、北京大学医学部、北京人民医院、上海巴斯德研究 所、中国药品生物制品检定所、浙江大学医学院、北京市疾病预防控制中心。所、中国药品生物制品检定所、浙江大学医学院、北京市疾病预防控制中心。 本本规范规范编写组织者：蒋岩。编写组织者：蒋岩。 本本规范规范编写组人员：庄辉、魏来、鲁凤民、钟劲、祁自柏、陈智、周林福、汪宁、编写组人员：庄辉、魏来、鲁凤民、钟劲、祁自柏、陈智、周林福、汪宁、 蒋岩、邢文革、邢玉兰、毕胜利。蒋岩、邢文革、邢玉兰、毕胜利。 本本规范规范编写联系人：邢文革。编写联系人：邢文革。 本本规范规范适用于全国所有的丙型肝炎病毒检测实验室。适用于全国所有的丙型肝炎病毒检测实验室。 本本规范规范解释权属于中国疾病预防控制中心。解释权属于中国疾病预防控制中心。 本本规范规范自发布之日起施行。自发布之日起施行。 丙型肝炎病毒实验室检测技术规范丙型肝炎病毒实验室检测技术规范编写组编写组 20102010年年5 5月月2020日日 于北京于北京 i 目目 录录 第一章第一章 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒.1 1病毒形态和基因组结构.1 2基因型.2 3复制和细胞嗜性.2 4致病性和免疫性.3 第二章第二章 丙型肝炎病毒抗体检测丙型肝炎病毒抗体检测.5 1概述.5 2试剂.5 3检测方法及程序.5 4抗体检测注意事项.10 5抗体检测的意义.11 6结果报告和解释.11 第三章第三章 丙型肝炎病毒抗原检测丙型肝炎病毒抗原检测.13 1概述.13 2试剂.13 3检测方法及程序.14 4抗原检测注意事项.14 5抗原检测的意义.15 6结果报告和解释.15 第四章第四章 丙型肝炎病毒核酸检测丙型肝炎病毒核酸检测.16 1丙型肝炎 rna 定性检测.16 2丙型肝炎病毒 rna 定量检测.17 3丙型肝炎病毒基因型检测.23 第五章第五章 丙型肝炎病毒检测策略丙型肝炎病毒检测策略.26 1疫情监测相关的检测策略.26 2临床诊断相关的检测策略.27 3血液筛查相关的检测策略.30 第六章第六章 丙型肝炎病毒细胞培养丙型肝炎病毒细胞培养.32 1丙型肝炎病毒的细胞培养模型.32 2体外细胞培养技术在丙型肝炎病毒检测中应用的展望.33 第七章第七章 实验样品的采集、保存、运输实验样品的采集、保存、运输.35 1样品采集.35 2样品保存与运输.35 ii 第八章第八章 丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控制及能力验证丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控制及能力验证.37 1室内质量控制.37 2能力验证.41 第九章第九章 实验室生物安全实验室生物安全.46 1丙型肝炎病毒相关检测的生物安全级别.46 2实验室生物安全保障措施.47 3实验室安全操作.48 4职业暴露及其处理.50 参考文献参考文献.52 1 第一章第一章 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒（hcv）于 1989 年被正式命名，在此之前被称为肠道外传播的非甲非 乙型肝炎病毒。1991 年被归为黄病毒科（flaviviridae） 。虽然丙型肝炎作为疾病早已被发 现，但直到 2005 年 hcv 体外细胞培养才获得成功。这对进一步认识 hcv 结构与功能、 深入研究 hcv 的发病机制、研究和开发抗 hcv 药物和疫苗具有重要意义。 1 1病毒形态和基因组结构病毒形态和基因组结构 hcv 是一种有包膜的 rna 病毒。病毒体为直径 4060nm 的球状颗粒，包膜表面有 刺突结构。用有机溶剂提取去除包膜后，可暴露其中心的核衣壳，直径约 33nm。经蔗糖梯 度离心后，血清中的 hcv 颗粒分布于 3 个组分：浮密度为 1.041.06g/ml 者为与血清中脂 蛋白结合的病毒颗粒；1.091.1g/ml 者为游离的病毒颗粒；浮密度为 1.171.24g/ml 的病 毒颗粒与血清中抗体结合以免疫复合物形式存在。 在分类学上hcv属黄病毒科（flaviviridae）丙型肝炎病毒属（hepacivirus） 。hcv是 单股正链rna病毒，基因组总长约9.6kb，编码单一的开放读框（open reading frame，orf） ，可翻译成一个约3000个氨基酸的前体蛋白。在hcv orf两侧分别有一个5 非编码区和3非编码区，均具有复杂的二级结构。5非编码区含有内部核糖体进入位点 （internal ribosome entry site，ires） ，可直接与40s核糖体亚单位结合，启动hcv前体蛋白 的翻译。 翻译启动后首先产生hcv前体蛋白。由宿主细胞的信号蛋白酶和hcv自身编码的蛋白 酶加工成约10个成熟的hcv编码蛋白。hcv结构蛋白位于前体蛋白的氨基末端1/3处，由宿 主细胞的信号蛋白酶加工，包括核心蛋白（core） 、2个包膜糖蛋白（e1、e2）和一个小的 p7蛋白。非结构蛋白（ns）位于前体蛋白的羧基末端2/3处，包括 ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b，其加工由hcv自身编码的蛋白酶介导，其中 ns2-3自身蛋白酶切割ns2和ns3间的连接，而ns3丝氨酸蛋白酶负责下游ns3至ns5b间的 加工成熟（图1） 。 2 图图1 hcv基因组结构及病毒蛋白基因组结构及病毒蛋白 注：阿拉伯数字代表各成熟蛋白的第一位氨基酸残基位置；细箭头所指处由宿主细胞的信号蛋白酶 切割；实心粗箭头所指处由hcv ns2-3自身蛋白酶切割；空心粗箭头所指处由hcv ns3/4a丝氨酸蛋白酶 切割。其中ns3-4a间的连接为顺式切割，而ns4a-ns5b为反式切割。 2 2基因型基因型 依据基因序列的差异，可将 hcv 分为 6 个主要基因型及不同亚型，按照国际通行的 方法，以阿拉伯数字表示 hcv 基因型，以小写的英文字母表示基因亚型（如 1a、2b、3c 等） 。基因 1 型呈全球性分布，占所有 hcv 感染的 70%以上，欧洲、美洲和亚洲的流行株 以 1 型和 2 型为主；4 型主要流行于中东地区；南非以 5 型和 6 型为主。我国以 1b 和 2a 基因型较为常见，但以 1b 型为主；某些地区有 1a、2b、3b 和 6a 型的报道。 3 3复制和细胞嗜性复制和细胞嗜性 hcv主要感染肝细胞。首先，hcv与靶细胞表面的受体结合，进入细胞后脱壳将其基 因组rna释放到细胞浆中。在hcv5非编码区内的ires指导下，hcv基因组rna可作为信 使rna被翻译为一个大的前体蛋白，后者经宿主细胞和hcv自身编码的蛋白酶加工成为成 熟的hcv基因产物，其中ns3到ns5b可组成hcv的复制复合体，以hcv基因组rna为模 板，启动负链hcv rna的合成。新合成的负链hcv rna又可作为模板进行新正链及新负 链hcv rna的合成，其中一些正链hcv rna可包装成为子代病毒，经高尔基体转运系统 释放到细胞外（图2） 。 3 图图 2 hcv 复制周期示意图复制周期示意图 4 4致病性和免疫性致病性和免疫性 丙型肝炎的潜伏期为226周，平均约67周。多数（约80%）hcv感染者无症状或 仅有轻微症状，如疲劳、食欲减退、右上腹部不适、搔痒等，黄疸很少见（20%） 。 50%80%的患者可发展成慢性丙型肝炎。有些患者不出现症状，发病时已呈慢性感染， 慢性丙型肝炎的表现轻重不等。约20%的慢性丙型肝炎患者可在20年内发展为肝硬化，一 旦到肝硬化阶段，每年约有1%7%可进展为原发性肝细胞癌。我国约10%肝癌患者血中存 在抗-hcv。目前丙型肝炎尚无有效疫苗可以预防，切断传播途径尤其是控制血液传播仍是 最主要的预防措施。丙型肝炎的标准治疗方法是-干扰素和利巴韦林联合治疗，有助于尽 早从血液和肝脏中清除hcv，并使患者的血液生化学指标及组织学改变恢复正常。 人感染hcv后，可呈现四种类型的抗-hcv反应：（1）被动输入抗-hcv反应。多见 于输入含高滴度抗-hcv血液者，于输血后抗-hcv即为阳性，5周后阴转，而后感染者自身 产生抗-hcv，并可持续存在。 （2）迟发性抗-hcv持续阳性反应。一般于输血后2022周 或发病后1416周抗-hcv阳转，并迅速达高水平，可持续阳性10年以上。 （3）迟发性抗- hcv短期阳性反应。于输血后1921周或发病后911周抗-hcv阳转，但1年后转阴。 （4）无反应。此种反应多见于一过性hcv感染者或免疫力低下者，抗-hcv始终阴性。目 4 前多认为，hcv感染所致肝脏损伤主要来自机体对hcv的免疫应答。此外，有研究显示， hcv的核心蛋白可通过损伤线粒体功能，引起肝细胞氧化应激，间接导致肝细胞损伤。 hcv感染者大约有25%能自动清除体内病毒。有证据表明，这是机体产生了较强的体 液和细胞免疫应答所致，hcv感染后的转归被认为与细胞免疫关系更为密切。丙型肝炎患 者康复后，仅有较低免疫力，可再次被同种或异种hcv株所感染。也有同一患者感染多种 基因型hcv的报道。 5 第二章第二章 丙型肝炎病毒抗体检测丙型肝炎病毒抗体检测 1 1概述概述 丙型肝炎病毒抗体检测是丙型肝炎诊断的重要依据。自从1989年建立了抗-hcv检测 方法以来，检测技术不断发展。到目前为止，已经在临床广泛应用的丙型肝炎病毒抗体检 测技术包括酶免疫技术、胶体金快速检测技术、化学发光技术、荧光技术等。抗体检测广 泛用于血液筛查、流行病学调查、临床诊断，为早期发现感染者和病人、早期治疗提供可 靠的依据。 2 2试剂试剂 抗-hcv 目前常用的检测试剂包括：酶联免疫吸附试验、胶体金法快速试验、化学发 光试验、免疫荧光试验、免疫印迹试验和蛋白芯片。 使用抗-hcv 试剂，必须是经过国家食品药品监督管理局注册，在有效期内的试剂。 应根据目的和试剂使用范围，选择抗体检测试剂。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性 高的试剂。 3 3检测方法及程序检测方法及程序 3.1 抗体筛查试验 包括酶联免疫试验、胶体金法快速试验、化学发光试验和免疫荧光试验。 3.1.1 抗-hcv 酶联免疫试验 3.1.1.1 试剂和原理 间接酶联免疫法（elisa）是抗-hcv 检测常用的筛查方法。其基本原理是以 hcv 抗 原包被固相载体，用辣根过氧化物酶标记的抗人 igg 与被检样品中的抗-hcv 反应，以邻 苯二胺（opd）或 3，3，5，5四甲基联苯胺（tmb）等底物显色后，利用检测仪器根 据颜色的深浅进行阴阳性结果判断。其主要反应过程如下： （1）试剂中包含重组抗原与固相载体连接形成的固相抗原。 （2）加入经样本稀释液稀释的被检样品，样本中的抗-hcv 与抗原结合，形成固相抗原 抗体复合物。 6 （3）洗涤：固相载体上只留下抗-hcv。其他免疫球蛋白及样品中的杂质由于不能与固 相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （4）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤 后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。 （5）加底物显色：利用分析仪分析结果。 elisa 中通常用聚苯乙烯为固相载体，有微孔板、小管、小珠（beads）、微粒 （microparticle）、磁性微粒等类型，后发展为硝酸纤维素膜、活化滤纸、硅片、尼龙、利 用高分子材料合成的各种固相微粒等。不同形式的固相载体要求不同的洗涤装置，并有其 特殊的自动分析系统。目前临床诊断和采供血机构广泛采用第三代 elisa 试剂，即采用基 因工程制备的重组蛋白做为包被抗原制备的抗-hcv elisa 试剂进行抗体筛查。 3.1.1.2 试验程序 板式 elisa 试剂均采用规格统一的 812 的 96 微孔板，与板式 elisa 试剂配套使用 的洗涤装置（洗板机等）、自动分析仪（酶标仪等）均为开放式的，适用于各家产品。其 主要的试剂组分和试验程序如下： （1） 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照规定倍数稀释。 （2） 稀释：每孔加入规定量样品稀释液。 （3） 加样：分别在相应孔中加入一定量的被检样品或阴、阳性对照，轻轻振荡混匀。 （4） 温育：按照说明书用封板膜封板后置 37温育。 （5） 洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机设置相应洗涤时间和次数，最后一次尽量扣 干。 （6） 加酶：每孔加入规定量的酶标试剂。 （7） 温育：按照说明书用封板膜封板后置 37温育。 （8） 洗涤：操作同 5。 （9） 显色：每孔按照说明书要求加入显色剂，轻轻振荡混匀，37避光显色。 （10） 测定：每孔加入规定量终止液，轻轻振荡混匀，按照说明书设定酶标仪检测波 长测定各孔 od 值。 微孔板以外的固相载体形式，其洗涤装置和自动分析系统均为试剂与仪器配套型的。 自动化程度较高，精密度和重复性等指标也达到较高水平，但检测成本较昂贵。 7 3.1.1.3 判定标准 （1）阴性对照的正常范围：一般情况下，阴性对照孔读数规定值（若有 1 孔阴性对 照读数大于规定值应舍弃，若有两孔或两孔以上阴性对照读数大于规定值，应重复试验）。 （2）阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔读数规定值（若有 1 孔阳性对 照读数小于规定值应舍弃，若两孔阳性对照读数小于规定值，应重复试验）。 （3）根据试剂盒提供方法计算临界值（cutoff）。 （4）阴性判定：样品读数临界值（cutoff）者为抗-hcv 阴性。 （5）阳性判定：样品读数临界值（cutoff）者为抗-hcv 阳性反应。 如试剂有配套的自动分析系统，则系统会自动计算 cutoff 值，并判定结果。 3.1.2 抗-hcv 胶体金法快速试验 3.1.2.1 试剂和原理 近年来胶体金免疫渗滤试验（胶体金法）方法日趋成熟，逐步在临床上得到广泛应用。 该方法利用免疫胶体金技术，以间接法检测样品中的抗-hcv。检测时，样品中的抗-hcv 与固定在硝酸纤维膜上的金标蛋白反应，形成复合物，经层析移动至检测条的检测区，被 固定在硝酸纤维素膜上的 hcv 抗原捕获，形成一条阳性色带。未被结合的金标抗体移动 至检测条的质控区，与包被在此的抗金标蛋白的二抗反应形成另一色带。该试剂具有操作 简单、检测快速、特异性好、灵敏度较高、无需特殊的实验条件及仪器设备，可用于抗- hcv 筛查。此外，一些以纳米磁微粒作为标记物的新型抗-hcv 快速检测试剂也开始投入 使用。 3.1.2.2 试验方法 胶体金试剂一般采用试纸条或检测板： （1）检测板：根据试剂说明书取规定量的待检样品加入检测板的样品孔或样品池中， 再滴加入缓冲液； （2）试纸条：将试剂条箭头所指方向插入样品收集器内，待检样品液面直到标记线为 止，确保浸没时间大于 1015 秒。然后将试剂条从样品收集器中拿出，将之粘贴到测试 卡上，再观察测试结果。不要将试剂条浸没位置超过标记线（具体时间规定按照说明书所 示）。 3.1.2.3 判定标准 （1）阳性反应（+）：两条紫红色条带出现。一条位于测试区（t）内，另一条位于 8 质控区（c）。 （2）阴性（-）：仅质控区（c）出现一条紫红色条带，在测试区（t）内无紫红色条 带出现。 （3）无效：质控区（c）未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂条已变质 损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂条重新测试。如果问题仍然存 在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。 （4）注意事项：测试区（t）内的紫红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规 定观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判为阳性反应。 3.1.3.化学发光试验 3.1.3.1 试剂和原理 化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，clia）是将具有高灵敏度的化 学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、 脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为 两种： （1）化学发光标记免疫分析法：化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析 （clia），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光 物质有吖啶酯类化合物acridiniumester（ae），是有效的发光标记物，通过起动发光试 剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物 用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分 子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量， 从而增加灵敏度。 （2）化学发光酶免疫分析法：从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析 （chemiluminescent enzyme immunoassay，cleia）应属酶免疫分析，只是反应的底物是 发光剂，操作步骤与 elisa 分析完全相同。以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗 体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光， 用发光信号测定仪进行发光测定。该方法又分为如下几类： hrp 标记的 cleia：常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺，是一类重要的 发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧（过氧化阴离 子 o2-，单线态氧 o2，羟自由基 oh-，过氧化氢 h2o2）存在下生成激发态中间体，当其回 到基态时发光，其波长为 425nm。早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体，但标记后发光强度 9 降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为 发光底物， 在过氧化物酶和起动发光试剂（naoh2h2o2）作用下，鲁米诺发光，发光强 度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。 增强发光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassay，eleia） 在发光系统中加入增强发光剂以增强发光信号， 并在较长时间内保持稳定， 便于重 复测量， 从而提高分析灵敏度和准确性。 alp 标记的 cleia 所用底物为环 1，22 二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构 中包含起稳定作用的基团金刚烷基，其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团，在 酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。 3.1.3.2 试验方法 操作步骤与elisa分析类似或完全相同。 3.1.3.3 判定标准 在阴性和阳性对照符合试剂盒质控要求的情况下，以信号值（signal）/临界值 （cutoff）试剂盒注明的s/co判定为抗-hcv阳性反应。根据试剂盒注明的 （signal/cutoff）范围内或对弱阳性反应样本进行复试或补充试验，或判定为阴性。 3.2 抗体补充试验 抗体补充试验包括免疫印迹试验和蛋白芯片检测方法。 3.2.1 抗-hcv 免疫印迹试验 3.2.1.1 试剂和原理 目前获美国fda正式批准的抗-hcv补充试验试剂只有一种，即美国chiron公司的重组 免疫印迹法试剂（riba）。riba hcv 3.0将c100、c22和ns3、ns5四种成分喷涂在硝酸 纤维薄膜条上，并设置了两种不同浓度的人igg对照带和一条hsod对照带，用于内部对照 和结果判断。其诊断hcv感染的敏感性高、特异性强，可检测针对hcv不同编码区抗原的 抗体，且不需要特殊的仪器设备。因此常用来确证elisa检测的结果。 3.2.1.2 试验方法 依照试剂说明书操作。 3.2.1.3 判定标准 依照试剂判定标准判定结果。riba 试剂检测时出现两条以上阳性带，判定为阳性。 其中 igg control和 igg control均显色，且前者颜色深于后者，hsod 带不显色或色带低 10 于 igg control，以上条件成立则试验成立。抗体产生条带的判定依次为 ns4、ns3、core 和 ns5。若两条抗体带显色，判定为抗体阳性；若 1 条抗体带显色，判 为疑似抗体阳性；若所有抗体带均不显色，判为抗体阴性。 3.2.2 蛋白芯片检测技术 3.2.2.1 试剂和原理 蛋白芯片检测技术是一种自动快捷、灵敏特异、高通量的蛋白组学研究方法，是伴随 着基因芯片发展起来的一项新型诊断技术，已成功地运用于自身抗体、肿瘤标志物等的检 测。 用蛋白芯片的方法检测抗-hcv 分片段，主要采用先进的蛋白芯片膜处理技术、点样 技术、洗涤技术、标记技术等检测技术。检测原理基于间接免疫法，采用化学发光的方法。 突破了传统的 hcv 酶联免疫试验（elisa）检测试剂盒一次只能检测抗-hcv 的局限，样 品用量仅为 elisa 的 1/5，能同时检测样品中抗 hcv core、抗 hcv ns3、抗 hcv ns4、 抗 hcv ns5 以及抗 hcv 总抗体 5 项指标，能使临床方便地了解抗-hcv 中， core，ns3，ns4 和 ns5 4 种不同功能区抗体出现的情况及不同的临床意义。如抗-hcv core 滴度持续明显降低反映 hcv rna 可能消失；抗-hcv ns3 可用于早期诊断，下降或 转阴提示治疗有效，是病毒血症水平降低或消失的敏感标志；抗-hcv ns4 与疾病慢性化 有关，反映总抗体水平；抗-hcv ns5 与肝细胞坏死有关，用于急性感染的诊断。 3.2.2.2 试验方法 取出制备好的芯片，加试剂盒规定倍数倍稀释的一定量血清样本以及阴阳性对照， 37 温浴 30 分钟，反应终止后加入洗涤液，按照说明书要求的时间和次数进行洗涤，然 后加入一定量相应标记的抗人 ig g 结合物，37 温浴 30 分钟，再按照说明书要求进行 洗涤，根据试剂盒内二抗的不同标记类型直接进行扫描检测，或者加入底物或显色液进行 检测。 3.2.2.3 判定标准 需要两条阳性带，才可判定为阳性，且抗原反应性1。 4 4抗体检测注意事项抗体检测注意事项 4.1 检测要点 （1）严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改； 11 （2）注意防止交叉污染； （3）严格遵守实验室操作规程。 4.2 检测中常见错误 （1）稀释错误； （2）在加样时刮擦已包被抗原的微孔； （3）不适当的使用滴管，用滴管加试剂时滴管应处于垂直位置且液滴要自由落下； （4）使用不适当的加样器枪头，加样器与枪头一定要匹配，否则会使取样加样不准； （5）不连贯的操作技术，每份样本及质控品要同样对待，同时要同一个技术人员加所 有的样本及质控；使用全自动处理处理系统有助于减少人为因素的影响； （6）使用不适当的设备，设备使用前要保证经过了校准； （7）不适当的温度，试剂使用前要平衡至室温，孵育温度要准确，否则会改变反应的 动力学，产生错误结果； （8）不同批号试剂中的组分混合使用。 5 5抗体检测的意义抗体检测的意义 抗-hcv 检测最初被推荐用于检出 hcv 感染。在临床上，针对大多数患有肝脏疾病的病 人，筛查检测的敏感性和特异性均较高，抗-hcv 假阳性较为少见。然而，在 hcv 感染率低 的人群中（如无偿献血员、现役或退役军人、普通人群、卫生保健从业人员、性病门诊就 诊者），假阳性率较高，阳性预期值较低。 抗-hcv 产生假阳性的主要原因是：（1）高 igg 血症：目前国内外的抗-hcv 试剂均 采用间接酶联免疫检测原理，间接法的一个重要影响因素是血清中所含的高浓度的非特异 性 igg，igg 对聚苯乙烯有较强的吸附力，非特异性 igg 可吸附到固相载体上或包被的抗 原上造成假阳性；（2）类风湿因子的干扰：类风湿性关节炎患者血清或血浆中的类风湿因 子为巨球蛋白 igm，可非特异性地吸附到固相载体上或包被的抗原上造成假阳性；（3）超 氧化物歧化酶（sod）的干扰：如 eia 试剂所含的重组基因片段 c-100 为酵母菌产生的 sod 融合蛋白，样品中 sod 升高会造成抗-hcv 假阳性结果；（4）用于试剂制备的 hcv 抗原不纯。用于生产抗-hcv 的抗原主要有 hcv 核心区、ns3、ns4 及 ns5 区蛋白，均为 基因工程产物，如抗原的纯度太低，可产生非特异性反应。 由于以上原因，不能单独依靠筛查试验阳性反应结果来判断一个人是否感染 hcv。因 12 此，筛查试验阳性反应的样品需应用具有更高特异性的补充试验进行确证分析。免疫印迹 试验是具有高特异性的抗-hcv 补充试验，用来确认筛查实验阳性反应的样品，其结果表示 为“阳性”、“阴性”、“不确定”。免疫印迹试验阳性结果可判定抗-hcv 阳性。确认抗 -hcv 阳性结果提示需要进行有关 hcv 感染的咨询和医学评价，包括进行 hcv rna 和肝脏生 物化学（如 alt）检测。 6 6结果报告和解释结果报告和解释 6.1 根据筛查和补充试验结果进行报告的基本原则 6.1.1 对于筛查试验阴性样品，无需做进一步检测，可报告为“抗-hcv 阴性” 。 6.1.2 对于筛查试验阳性反应样品，可选择“根据其 s/co 比值”的方案或选择“不根据其 s/co”的方案直接进行补充试验。 6.1.2.1 根据其 s/co 比值进行补充试验：对于高 s/co 比值的筛查试验阳性反应样品，可报 告为“抗-hcv 阳性”，无需再做补充试验；对于低 s/co 比值的筛查试验阳性反应样品， 应进一步做补充试验。 6.1.2.2 直接进行补充试验：对所有筛查试验阳性样品，进行免疫印迹试验；或先做核酸放 大检测(nat)，nat 阴性的样品，再进行免疫印迹试验。 6.2 试剂盒规定的 s/co 阈值的说明 6.2.1 高 s/co 比值：当 s/co 比值特定的阈值时，其补充试验结果阳性的预测值 95； 6.2.2 低 s/co 比值：其 s/co 比值0.99） ，斜率（反映扩增的效率）在指定的范围内。但采用外标法定 量的试剂盒标准品扩增良好也不一定意味着样品一定扩增良好，因为还涉及rna提取质量 的问题，因此特别要注意考察阳性质控和阴性质控的结果，阴性结果必须没有扩增曲线， 而阳性质控必须扩增曲线良好，结果落入指定的区间内。 2.3 b-dna 技术 2.3.1 原理 分支 dna（bdna）技术基于其独特的信号放大系统，即 bdna 信号放大系统，这是 一个人工合成的 bdna，bdna 的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以 便进行检测。利用序列特异的寡聚核苷酸探针杂交捕捉 hcv rna，hcv rna 随后与支链 dna（bdna）二级探针杂交，bdna 再与酶联三级探针结合，随后加入酶底物，产生的 化学发光信号强度与靶 rna 的量成正比。 2.3.2 操作程序 首先将血浆样品离心，浓缩其中的病毒颗粒，hcv rna 释放后加入微孔板中，板孔 中包被有可与病毒特异结合的一系列靶探针，另一系列靶探针的一端可标记在游离的病毒 核酸链上，另