（细胞生物学专业论文）cftr+cl通道和glpf甘油通道调节剂的高通量筛选研究.pdf

中文摘要 本文工作的目 的是探索建立适合于高通量筛选研究的 g 5 5 1 d - c f t r 氯离子通道及大肠杆菌甘油通道 ( g l p f ) 的 细胞模型， 并利用高 通量筛选 技术( h i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i n g , h t s ) 寻找能 够 有效促进g 5 5 1 d - c f t r 氯 离 子通 道开 放 和阻 断g i p f 甘油转运的 小 分子化 合 物。 囊性纤 维化( c y s t i c f i b r o s i s , c f ) 是白 种人中 存在的 一种致死性遗传性 疾 病， 是由 于 囊 性纤 维 化 跨 膜转 运调 节因 子( c y s t i c f ib r o s i s t r a n s m e m b r a n e c o n d u c t a n c e r e g u la t o r ,c f t r ) 基因 突 变引 起的。 c f t r 基因 含 有2 7 个 外 显 子，编码 1 4 8 0 个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白质是一种受c a mp调 节的氯离子通道。 c f t r基因突变包括了突变的所有类型， 并且突变分布 在整个基因序列上。迄今已发现 1 3 0 0 余种c f t r基因突变，其中，大约 6 %左右的 c f患者是由于第 5 5 1位 g ly残基突变为 a s p残基 ( g 5 5 1 d - c f t r ) 引起病变的， 占 所有c f t r突变引起c f 疾病的第三位。 g 5 5 1 d - c f t r突变经过正 确的转录、 翻译及运输， 定位在细胞膜表面， 但 由于突变使这些通道不能打开，失去通道功能。 g 5 5 1 d - c f t r突变的c f 患者的典型症状是胰腺功能不足。有报道，某些小分子化合物能够促进 g 5 5 1 d - c f t r突变的氯离子通道开放。 大 肠杆菌 甘油 通道 ( g lp f ) 是水通 道家族 ( a q p s ) 的 成员 之一， 属 水甘油通道亚系， 对甘油及其类似结构的多元醇、 糖醇等具有选择渗透性， 对水分子通透性较低， 它阻断所有带电离子、 氢氧化物、 水合氢离子的跨 膜运 输。 g i p f是大肠杆 菌膜上专门 转 运甘油的 通道， 在哺乳动物细胞膜 上未 发 现这种 通道。 g ip f在膜上始终 处于开 放状态， 甘油 顺浓度 梯度双 向 转 运。 甘油 通道阻断剂 对于 研究 大肠杆菌 甘油 通道( g l p f ) 的 生 理功能 以及研究哺乳动物水甘油通道甘油转运功能的生理作用具有重要意义。 本研究利用含g 5 5 1 d - c f t r和y f p - h 1 4 8 q / 1 1 5 2 l( 对碘离子高 度敏 感的荧光绿蛋白突变体)的表达质粒共转染中国仓鼠卵巢细胞 ( c h o c e l l s )， 得 到 稳 定 表 达 这 两 种 蛋 白 质 的 细 胞 系 ( c h o / g 5 5 1 d - c f t r / y f p - h 1 4 8 q / 1 1 5 2 l ) ， 该细胞系经过鉴定确定为荧光 法测 定g 5 5 1 d - c f t r氯离子 通道的 细胞模型。 利用 上述细胞 模型对小分 子化合物库 ( 含 1 0万种化合物)进行功能筛选，获得一种能促进碘离子 进入模型细胞并且与 g 5 5 1 d - c f t r具有高度亲和力的化合物二环辛烷， 命名为g 5 5 1 d - c f t r b wo g 5 5 1 d - c f t r b c o 具有特异性强、作用迅速、可 逆、无细胞毒性等特点，其亲和活性较己知的 g 5 5 1 d - c f t r非特异激活 剂染料木黄酮 ( g e n i s t e i n )高5 倍以上。该激活剂将在阐明c f t r活性机 制及开发囊性纤维化治疗药物等方面发挥重要作用。 本研究还首次探索了在哺乳动物细胞中稳定表达具有甘油选择性转 运功能的大肠杆菌甘油通道 ( g 1 p f ) 蛋白。 w e s t e rn b l o t 试验结果证明: 该蛋白 质在c h o c e l l s 中高表达。 然而， 功能测试结果表明: g 1 p f 在c h o c e l l s 膜上的甘油转运功能很低， 原因尚不清楚。目 前， 该细胞系尚 不适合 于g l p f 调 节剂的 筛选， 需 经过 优化后， 有可能 成为 筛 选大 肠杆 菌甘油 通 道抑制剂的细胞模型。 关键词: c f t r氯离子通道 大肠杆菌甘油通道 ( g 1 p f ) 高通量筛 选 abs tract t h e p u r p o s e o f t h i s t h e s i s i s t o d e v e l o p c e l l - b a s e d as s a y m o d e l s o f m u t a n t c f t r c h l o r i d e c h a n n e l s a n d g l y c e r o l - s e l e c t i v e t r a n s p o rt e r s . c y s t i c fi b r o s i s ( c f ) i s o n e o f t h e m o s t c o m m o n l e t h a l a u t o s o m a l r e c e s s i v e g e n e t i c d i s e a s e s c a u s e d b y o v e r 1 , 3 0 0 m u t a t i o n s o f t h e c y s t i c f i b r o s i s t r a n s m e m b r a n e c o n d u c t a n c e r e g u l a t o r ( c f t r ) g e n e , , w h i c h e n c o d e s a c a m p - d e p e n d e n t p h l o r id e c h a n n e l e x p r e s s e d i n v a r i o u s fl u i d - t r a n s p o rt i n g e p i t h e l i a . t h e g l y c i n e t o a s p a r ti c a c i d m i s s e n c e m u t a t i o n a t c o d o n 5 5 1 o f c f t r ( g 5 5 1 d ) i s o n e o f t h e fi v e m o s t fr e q u e n t c f m u t a t i o n s w i t h a fr e q u e n c y o f 6 % a n d i s as s o c i a t e d w i t h s e v e r e c f p h e n o t y p e . t h e g 5 5 1 d - c f t r b e l o n g s t o c l a s s i i i c f m u t a t i o n s i n w h i c h t h e p r o c e s s i n g , m a t u r a t i o n , a n d as s i g n e d a p i c a l l o c a t i o n o f g 5 5 1 d - c f t r a r e n o t a ff e c t e d . h o w e v e r , c h l o r i d e t r a n s p o rt i n c e l l s e x p re s s in g t h e g 5 5 1 d m u t a n t c f t r c a n n o t b e a c t iv a t e d b y c a mp - e l e v a t i n g a g e n t s , r e s u l t i n g i n d e fi c i e n c y o f c f t r f u n c t io n . a lt h o u g h n u m e r o u s a c t i v a t o r s o f w i l d t y p e c f t r h a v e b e e n i d e n t i fi e d , f e w o f t h e m c a n e f fi c i e n t l y a c t i v a t e g 5 5 1 d - c f t r . c o m p o u n d s s u c h a s i s o fl a v o n e g e n i s t e i n a n d b e n z o c q u i n o l i z i n i u m c o m p o u n d m p b - 9 1 c a n a c t i v a t e g 5 5 1 d - c f t r , b u t t h e y a c t a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s , n o n s p e c i f i c a n d s o me t i me s h a v e d u a l e ff e c t s . o n e p u r p o s e o f t h i s s t u d y i s t o d e v e lo p a c e l l - b a s e d fl u o r e s c e n t as s a y o f g 5 5 1 d - c f t r fu n c t i o n u s i n g h a l i d e - s e n s i t i v e y e l l o w fl u o re s c e n t p r o t e i n m u t a n t ( e y f p - h 1 4 8 q - 1 1 5 2 l ) as i n t r a c e l l u la r i n d ic a t o r a n d t o d i s c o v e r b y h i g h t h r o u g h p u t s c r e e n i n g h i g h - a f fi n i t y , s p e c i fi c a n d n o n t o x i c s m a l l m o l e c u l e g 5 5 1 d - c f t r a c t i v a t o r s a s c a n d i d a t e d r u g s t o a m e l i o r a t e t h e c h l o r i d e t r a n s p o rt d e f e c t a s s o c i a t e d w i t h c l a s s i i i c f . a s t a b l y t r a n s f e c t e d c h o c e l l l i n e c o e x p r e s s i n g g 5 5 1 d - c f t r a n d a n i o d i d e - s e n s i t i v e y e l l o w fl u o r e s c e n t p r o t e i n m u t a n t e y f p - h 1 4 8 q - 1 1 5 2 l w as s u c c e s s f u l l y e s t a b l i s h e d as a s s a y mo d e l f o r g5 5 1 d- c f t r c h l o r i d e g e n i s t e i n , a k n o w n l o w a f f i n i t y c h a n n e l fu n c t i o n . i s o fl a v o n e c o m p o u n d g 5 5 1 d - c f t r a c t i v a t o r , s t i m u l a t e d g 5 5 1 d - c f t r - m e d i a t e d c h l o r i d e t r a n s p o rt i n t h e e s t a b l i s h e d c h o / g 5 5 1 d - c f t r / e y f p - h 1 4 8 q - 1 1 5 2 l a s s a y s y s t e m . a h i g h - a f f i n i t y ( k d - 5 u m) b i c y c l o o c t a n e c o m p o u n d ( g 5 5 1 d - c f t r b c o ) w a s id e n t i f i e d t o a c t i v a t e g 5 5 1 d - c f t r c h l o r i d e c h a n n e l b y s c r e e n i n g o f 1 0 0 , 0 0 0 d i v e r s e s m a l l m o l e c u l e c o m p o u n d s . t h e a c t i v i t y o f th e b i c y c l o o c t a n e c o m p o u n d i s g 5 5 1 d - c f t r - s p e c i f i c , r e v e r s i b l e a n d n o n - t o x i c . g 5 5 1 d - c f t r b c o w i l l b e u s e f u l i n s t u d i e s o f s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f g 5 5 1 d - c f t r a n d o f t h e r a p e u t i c c o r r e c t i o n o f c f p h e n o t y p e s c a u s e d b y g 5 5 1 d - c f t r m u t a t io n . t h e s e c o n d p u r p o s e o f t h i s s t u d y i s t o e x p l o r e t h e f e a s i b i l i t y o f f u n c t i o n a l e x p re s s i o n o f e . c o l i g l y c e r o l tr a n s p o rt e r g 1 p f i n m a m m a l i a n c e l l s a n d o f h i g h t h r o u g h p u t s c re e n i n g u s i n g m a m m a l i a n c e l l - b a s e d r a d i o a c t i v e a s s a y t o i d e n t i f y s m a l l m o l e c u l e i n h i b i t o r s o f g l y c e r o l t r a n s p o rt e r s . a s t a b l y t r a n s f e c t e d c h o c e l l li n e w i t h h i g h e x p re s s i o n o f g 1 p f m r n a a n d p r o t e i n w a s o b t a i n e d a n d fu n c t i o n a l l y c h a r a c t e r i z e d . a lt h o u g h g 1 p f p r o t e in w a s s tr o n g l y e x p re s s e d i n c e l l m e m b r a n e , it w a s p o o r ly f u n c t i o n a l in t r a n s p o r tin g 14 c - la b l e d g ly c e r o l . f u r th e r w o r k i s n e e d e d t o o p t i m i z e t h e e x p r e s s i o n a n d a s s a y p r o c e d u r e t o d e v e l o p a m a m m a l ia n c e l l - b a s e d a s s a y s u i t a b l e f o r h i g h t h r o u g h p u t s c r e e n i n g o f s p e c i f i c g l y c e r o l t r a n s p o rt i n h i b i t o r s k e y w o r d s : c y s t i c fi b r o s i s t r a n s m e m b r a n e c o n d u c t a n c e r e g u l a t o r p r o t e i n ( c f t r ) h i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i n g ( h t s ) , g l y c e ro l p r o t e i n f i c i l i t a t o r ( g i p f ) 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 立啤日期: 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即:东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范 大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 :自鱿 日期: p砂. k . 指 导 w fi-irz名 : r ik 日期: . y 芷止 一 石 学位论文作者毕业后去向 工作单位: 通讯地址: 电话: 邮编: 英文缩 写词表 c f t r , c y s t i c f i b r o s i s t r a n s m e m b r a n e c o n d u c t a n c e r e g u l a t o r p r o t e i n c f , c y s t i c f i b r o s i s y f p , y e l l o w fl u o r e s c e n t p r o t e in p b s , p h o s p h a t e - b u ff e r e d s a l i n e h a , h e m a g g l u t i n i n a b c , a t p b i n d i n g c a s s e t t e p k a , p r o t e i n k i n a s e a e n a c , e p i th e l ia l n a + c h a n n e l c p x , 8 - c y c l o p e n ty l - 1 , 3 - d i p r o p y l x a n t h i n e g e n, g e n i s t e i n ms d s , m e m b r a n e - s p a n n i n g d o m a i n s , n b d s , n u c l e o t i d e 一 b i n d i n g d o m a i n s g 1 p f , g ly c e r o l p r o t e i n f a c i l i t a t o r g p c r s , g - p r o t e in - c o u p l e d r e c e p t o r s s p a , s c i n t i l l a t i o n p r o x i m ity a s s a y f p s , fl u o re s c e n c e p o l a r i z a t i o n s p e c t r o s c o p y f c s , fl u o r e s c e n c e c o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y t r f , t i me r e s o l v e d fl u o r e s c e n c e f r e t , fl u o re s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e c a mp , c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e c h o ( c e l l s ) , c h i n e s e h a m s t e r o v a ry ( c e l l s ) 第一部分引言 一、高通量筛选的一般概述 高通量筛选技术是在2 0 世纪8 0 年代后期， 随着生命科学、 现代药理 学和计算机技术、 自 动化技术以及建立在生物物理学基础上的各种新型检 测仪器的出现而形成的一种综合性高新技术， 经过十几年的不断探索与实 践， 该技术体系不断发展、 完善， 成为目 前依据反向 药理学理论寻找、 筛 选新的候选药物的一种重要手段。 高通量筛选技术的特点是微量化、自 动 化、 规模化和高效率 ” 。 ( 一)高通量筛选技术的产生 随着生命科学的快速发展， 特别是分子生物学和细胞生物学在诸如蛋 白 质结构与功能、 核酸的结构与功能、 细胞信号传导过程与途径以 及现代 医学分子生物学在生理、 病理等方面的研究的深入， 为药靶的研究与确定 奠定了 基础2 1 。 生命科学的 快速发展也使在细胞水平和分子水平上进行的 各种操作技术日 趋成熟， 研究手段和方法日 臻完善， 这些成为高通量药物 筛选模型建立的基础，同时也为高通量药物筛选系统的微量化提供了条 件。 另外， 现代控制技术应用于生命科学研究领域， 使高通量药物筛选这 样一种大量的重复性实验过程实现了机械化操作。 新型检测仪器如荧光仪 等的应用和计算机辅助分析技术使信息采集和数据分析、 处理实现了自 动 化， 也使得高通量药物筛选成为可能。 简单地说， 高通量药物筛选就是从 大量样本中找出目的化合物的过程， 计算机、自 动化技术的发展及相应的 软件系统的开发使这个过程实现了自 动化和标准化， 也使短时间内分析大 量数据成为可能 1 l ( 二)高通量筛选的原理 高通量筛选依据现代药理学理论以药物的 基本药理作用为起点， 针对药物作用的分子靶点或细胞上的作用位点进行药物筛选， 在获得比较 满意的活性化合物后， 通过体外细胞实验， 研究药物作用的分子机理， 进 而， 在组织、 器官水平以及疾病相关动物模型上进行药效学研究， 确认为 候选化合物后进入药物开发研究。 应用这种理论， 高通量筛选可以 研究样 品与作用靶点 ( 受体) 、样品与酶、样品与细胞之间的相互作用机理。 ( 三) 高通量筛选的组成 高通量筛选主要有目标明确的药物作用靶点、细胞或分子水平的筛选 模型、备选样品库、模型检测方法、自动化的高通量筛选系统以及筛选结 果评价体系等方面组成： 1 药物作用靶点 药物作用靶点的确定是在生命科学和现代医学基础上进行的，在研究 大量生理及病理现象中，找出与疾病相关的基因和戚生物靶【3 】。迄今为止， 全世界大约已经发现了5 0 0 余种药靶。在已经发现的药靶中约4 5 是细胞 膜受体，特别是g 蛋白偶联的受体( g - p r o t e i n ，c o u p l e dr e c e p t o r s ，g p c r s ) ， 酶约占2 8 ，激素和细胞因子占1 1 ，离子通道占5 ，核受体占2 ， d n a 占2 ，另有7 性质未知的受体【4 l 。药物的发现则是以药靶为对象， 有针对性地寻找、发现能对这些生物靶发挥作用的药物的过程【3 j 。而药靶 和药物之间并不是简单的一一对应。事实上，只有少部分的药靶才有特异 的治疗用药，而且还有很多药物是针对同一药靶发挥作用的。 要确定一个理想的治疗药靶( t h e r a p e u t i ct a r g e t s ) 是很困难的。例如： 人们曾经进行了大量的研究，试图寻找与红细胞生成素( e p o ) 及其受体有 相似作用的二者的替代物，结果确实找到了一段由2 0 个残基组成的环肽， 并对其进行了深入研究，但最终证明该多肽没有应用价值1 7 j 。又如，细胞 因子或生长因子在信号传导、细胞的物质运输和附着过程中发挥作用，因 此，它们具备理想药靶的特征并有希望成为治疗自身免疫疾病、癌症等疾 病的有效药靶，而人们在以蛋白质问相互作用为基础的小分子药物研究， 如以细胞因子或生长因子为药靶的研究中并没有取得很好的效果1 5 】，很多 理想药靶在正常细胞中也发挥极其重要的调控作用，而且很多看似理想的 药靶并不一定处于合适的细胞调控位点上。 但是，在神经肽受体激活剂的研究中，却取得了令人振奋的结果，到 目前为止人们已经发现了十几种小分子神经肽激活剂1 8 ，9 j 。 随着细胞生物学、基因测定技术及生物信息学的发展，更多的信号传 导途径被揭示，更多的新的生物化学调控位点被发现【3 】，而它们有可能会 成为新的药靶。在人类基因组计划特别是功能基因组计划实施的过程中， 也会有更多的新的蛋白质被发现，这些也为新药靶的发现提供了更多的可 能。根据人类基因组研究的结果推测，人体内大约存在有药物开发价值的 2 药物靶点5 0 0 0 1 0 0 0 0 个，因此，药物靶点的研究具有很大的潜力。应用 高通量筛选技术进行针对某一靶点的筛选还应该研究该靶点是否适宜和 如何有效地应用于高通量筛选。 2 筛选模型 用于药物筛选的模型很多，如：分子水平模型、细胞水平模型、组 织和器官水平的筛选模型以及整体动物模型。而目前，在高通量筛选平台 上最常用的和比较适合的模型是分子水平模型和细胞水平模型 9 0 a 在高通量筛选中，最关键的步骤是根据药物作用靶点构建的适合药物 筛选的细胞模型或分子模型，模型对于筛选应该是微量、特异性和易于检 出信号，即通过特定模型的筛选，能灵敏反映样品与模型的相互作用结果。 所谓特异性，既包括药物作用的特异性，也包括疾病相关的特异性。高通 量筛选还要求模型具有稳定性，在重复实验中获得重现的结果。 大多数常规的实验手段目前还无法应用于h t s 。事实上，能应用于 h t s 的分析检测方法，目前还仅限于那些操作步骤简单的方法，如：加入 样品即可测定的反应。在h t s 中采用的检测手段决定于研究的目的及采 用的筛选模型。例如在分子模型( c e l l f r e ea s s a y s ) 分析系统中研究高亲和力 的受体与配体间相互作用，蛋白质与蛋白质间相互作用时一般采用放射分 析的方法【1 0 1 ，而进行酶学研究时则根据酶与底物间亲和力的大小采用比 色、荧光及放射分析等多种方法 1 1 - 1 5 j 。而在细胞模型( c e l l b a s e da s s a y ) 分析系统中，目前比较好的方法是荧光测定法或是根据细胞对筛选样品的 反应、变化所作的筛选。如：采用检测荧光绿蛋白( g f p ) 及其突变体的 荧光变化，筛选c f t r 抑制剂及激活剂，获得了非常明确的结果 1 6 1 8 。 在过去的几年里，针对分子模型分析系统或细胞模型分析系统成功 地建立了很多用于h t s 的分析方法，而无论哪种分析检测方法都要求样 品体积小，步骤简单并能产生足够大的信号，且反应受溶剂及化合物干扰 小。 ( 1 ) 分子水平模型 分子水平模型的最大特点是药物作用靶点明确，应用这种模型可以 直接研究有关药物作用的机理。分子水平模型根据生物分子的结构特性及 生物学特性可以分成受体、酶类、细胞因子、核酸或其他类型。 在分子水平模型筛选中，根据模型的分子类型进行同位素标记、检 测产物和反应底物浓度、特异序列标记等检测靶点。可以采用以下方法进 行检测： 闪烁亲近测定法( s c i m i l l a t i o np r o x i m i t ya s s a y ，s p a ) 该方法是将一个闪烁体与一个受体同时连在一个凝胶颗粒( b e a d s ) 上，当受体与经同位素标记( 一般用3 h 、坦5 i 等低能辐射的同位素) 的 配体间发生相互作用时，由于同位素与闪烁体位置靠近，同位素衰变所产 生的能量传给闪烁体使之发光。闪烁亲近法直接测定两个分子间的相互作 用，它已经被成功地应用于寻找c c r 5 1 9 趋化因子受体抑制剂和激活剂以 及f k 5 0 6 结合蛋白配基 2 0 1 等的筛选过程中。 荧光分析方法 荧光分析方法由于具有灵敏、形式多样等特点，在h t s 中得到了广 泛的应用。在无细胞分析系统中广泛采用的荧光测定方法包括：荧光极化 光谱法( f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o ns p e c t r o s c o p y , f p s ) 、荧光相关光谱法 ( f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y , f c s ) 、时间分辨荧光光谱分析法 ( t i m er e s o l v e df l u o r e s c e n c e ，t r f ) 、荧光共振能量传递分析法( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 等。 i 荧光极化光谱法 荧光极化光谱法可以直接、迅速地给出示踪剂的结合游离率。在 筛选中，该方法可以用于检测酶的作用活性、蛋白质问的相互作用、d n a 间的相互作用、生物膜的流动特性等。在研究低亲和力的蛋白质间的相互 作用时，极化荧光比电泳法更有效。 荧光极化光谱法灵敏度好、操作简单、测定速度快，不受其它化合 物的吸收谱影响，可以在有色或混浊液体、水溶液中钡0 定，而且不改变样 品的结构、性质。因此该方法在h t s 的检测分析中经常使用。 i i 荧光相关光谱法 荧光相关光谱法用于研究分子问的相互作用，也适于在均相中测定 同一种分子不同状态下的荧光变化，如分子的结合态和自由态之间的变 化，完整分子与切割后分子之间的变化，特别是可以测定分子通过小体积 空间时瞬时荧光变化。荧光相关光谱法适于分析受体与配基问的相互作 用，d n a 蛋白质之间的相互作用，核酸杂合体的形成及某些酶反应。 i i i 时间分辨荧光光谱分析法 时间分辨荧光光谱分析法检测的是两个荧光发色团之问的能量传递 过程。最近，该方法已经成功地应用到了酶催化反应检测中。它的优点是 可以在一定程度上避免荧光光谱分析时来自于试剂等的影响。因为在时间 分辨荧光光谱中采用的稀土元素螯合物的荧光寿命一般为毫秒级，而来自 于试剂和反应容器的背景噪音的寿命一般为那秒级，可以用脉冲激发的方 式消除背景噪音的影响。 i v 荧光共振能量传递分析法 荧光共振能量传递分析法也是一种非放射性的受体与供体之间能量 传递的检测方法。该检测方法被成功地应用于丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂 的筛选过程中。 其他常用的方法 主要有比色检测法、放射活性计数法、发光计数法、核磁共振检测 法等。 ( 2 ) 细胞水平模型 在h t s 中依赖于细胞的分析系统越来越受到重视。细胞水平的模型 不能象分子模型那样直接获得有关作用机理方面的信息，但更接近生理条 件，所得到的筛选样品更有可能在生理条件下发挥作用。生物体内的反应 是一个极其复杂的过程，经常涉及多个反应的协同作用，如涉及细胞膜受 体信号传导过程的反应，在无细胞反应系统中是无法实现的，这就要求反 应必须在细胞中进行。荧光绿蛋白及其突变体的发现及应用大大地推动了 全细胞分析系统的发展。 细胞水平筛选模型可以采用正常细胞，也可以采用病理细胞或根据 不同靶点和筛选目的构建的特殊细胞模型。 依赖于细胞的分析系统主要通过以下三方面对细胞的变化进行检 测：第二信使分析法，该方法检测细胞表面受体激活后信号传导过程的变 化；报告基因分析法，该方法研究细胞转录或翻译水平的变化；细胞增殖 分析法，该方法研究在外界因素刺激下细胞增殖速度的变化。 如：g 一蛋白偶联的受体( g p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r ，g p c r s ) 是一 类非常重要的药靶，它组成了一类7 次跨膜的受体蛋白超家族，它们在细 胞自分泌、旁分泌及内分泌信号传导过程中起关键作用，它们通过调节g 一蛋白的功能来传导细胞外激素受体的信号进入细胞内。该方法将目的受 体的c d n a 与报告基因在细胞中稳定转染，基因的表达受受体依赖的信号 传导途径控制，当目的受体被激活时，导致报告基因的表达，可以通过检 测报告基因的表达情况来检测受体被激活情况。g 一蛋白偶联受体检测分 析法已经成为细胞水平模型h t s 分析方法中一种常用的方法。 3 备选样品库 备选样品库的样品可以是通过组合化学方法合成的小分子化合物、也 可以是多肽、多聚核苷酸及来自于植物、动物、微生物的天然化合物。 在高通量筛选方法建立初期，样品库仅注重扩大数量，而目前不仅考 虑样品的数量，更注意考察样品的质量特性。质量特性是指包括化合物的 纯度、分子量、渗透性( 1 0 9 p ) 、结构多样性等的综合指标【2 ”。这些标准 的建立不仅能加快确定先导化合物的速度，并能保证获得的先导化合物具 有较好的吸收特性、较低的毒性等【2 2 - 2 4 1 。s p e n c e rr w 认为，一般情况 下为了获得一个理想的先导化合物，一个化合物库中一般应包括至少 1 2 0 ，0 0 0 种高质量的化合物1 2 5 1 。 随着组合化学技术的发展，有机小分子化学库已经实现了商品化( 比 较著名的公司有c h e m b r i d g ec o 及c h e m d i vc o 等) 。另外，天然来源的化 合物也越来越受到重视。 4 自动化的高通量筛选设备 目前的高通量筛选系统检测及分析一般是在9 6 孔板中进行【2 6 】。因为， 用于高通量筛选的自动化检测及分析系统是以9 6 孔板为标准平台设计 的。虽然也有以3 8 4 孔、8 6 4 孔及1 5 3 6 孔板为反应平台的分析检测系统， 但由于技术上的原因，这样的系统尚未普遍采用 2 7 - 2 9 】。 在h t s 筛选过程中应用什么样的设备与所采用分析方法、所要筛选 的样品形式及所需的通量有关。以细胞为筛选模型的高通量筛选系统主要 由以下几部分组成：条码识别仪、检测器，液体转移系统( 用于样品的加 入及混合) ，c 0 2 培养箱，多功能载物平台，操作机械手，与系统连接的 数据处理计算机，细胞洗涤装置以及9 6 孔板去盖装置，振荡器，封板机 等。现在h t s 系统日益得到完善，有多个生产厂家能够提供适合不同目 的需要的h t s 系统及相应的软件系统。 6 图1 ：高通量筛选系统的基本组成 ( 四) 高通量筛选的一般过程 高通量筛选一般要经过以下过程： 1 初筛和复筛在分子水平或细胞水平模型上筛选样品。初筛过程 中观察样品在一定浓度下对模型的生物活性和亲合力，在获得有生物活性 或高亲和力的筛选样品后进入复筛。复筛在梯度浓度样品作用下观察对同 一模型作用的强度、量效关系等特点。根据复筛结果，确定活性化合物 ( a c t i v es m p l e s ，h i t s ) 。 2 深入筛选( s e c o n d a r ys c r e e n i n g ) ，在上述两轮筛选后，将所得化合物 在与初筛相关的模型上再次筛选，检验该化合物的选择性、细胞毒性以及 其他性质。经过本次筛选，获得比较全面的活性化合物的信息，综合分析 评价后，确定其是否可作为先导化合物( 1 e a dc o m p o u n d ) 。也可以将该化 合物用于动物模型实验，证明其药理作用。 3 确证筛选( c o n f i r m a t o r ys c r e e n i n g ) ，即对先导化合物进行药理作用、 药代动力学、一般毒性等多方面的试验，最终确定为药物候选化合物。 在筛选方式上，目前大多采用四合一、八合一等简单的混合方式，大 的制药公司也有采用十六合一的混合方式进行筛选。混合筛选的方法在缩 短筛选周期的同时，也大大降低了筛选的成本。如果组合方式巧妙还能大 大减少假阳性及假阴性出现的几率【3 。】。而无论是利用单个筛选法还是混合 筛选法都不可避免地会出现假阳性和假阴性的现象。 7 二、关于g 5 5 1 d c f t r 激活剂的高通量筛选 ( 一) c f t r 氯离子通道的概况 1 9 8 9 年，r i o r d a n 和r o m m e n s 等人的研究发现，在白种人中常见的一 种致命性遗传性疾病囊性纤维化( c f ) 与一种依赖于c a m p 调节的上皮细 胞项膜的氯离子通道、即囊性纤维化跨膜电导调节因子( c f t r ) 有关口”， 并且由r i o r d a n ，j r 等人的研究确定了c f t r 的编码基因p ”。此后，关于囊 性纤维化跨膜电导调节因子( c f t r ) 及囊性纤维化( c f ) 的研究在国际 上成为一个研究的热点。迄今为止的研究表明：囊性纤维化是在欧洲和北 美洲白人中常见的一种常染色体隐性遗传疾病，发病率为1 2 0 0 0 ，全世界约 有6 0 0 0 0 人患此疾病【3 ”，而亚洲人和非洲黑人比较少见。到目前，仅有日 本、泰国、以色列、沙特阿拉伯、中国等亚洲国家报道过c f 病例。f 1 本 学者y a m a s h i r o 等总结1 9 5 1 1 9 9 3 年间诊断的1 0 4 例c f 病例，认为1 9 8 0 年以 后在日本每3 5 万出生人口中有一人为c f 患者。1 9 7 4 年以来，我国内地、 台湾地区，美国及加拿大相继报道了1 6 例中国人c f 病例。2 0 0 2 年，北京 大学第一医院报道一例“囊性纤维化”病例”。 囊性纤维化跨膜电导调节因子( c f t r ) 基因位于人第七号染色体长 臂3 l 、3 2 区上( 7 q 3 1 2 ) ，该基因由缺失n 打a 启动予的2 7 个外显子、 大约2 1 5 k b 的4 伽碱基序列组成，编码一个由1 4 8 0 个氨基酸残基组成的 跨膜蛋白o ”。整个基因编码的各部分区域沿直线状排列。如图所示： 图2 c f t r 基因结构示意图。c f t r 基因含有2 7 个外显子，p 为基因的启动子区。p 囊性纤维化跨膜电导调节因子( c y s t i cf i b r o s i s t r a n s m e m b r a n e c o n d u c t a n c er e g u l a t o r , c f t r ) 是a b c ( a t p b i n d i n gc a s s e t t e ) 转运家族 的成员，它是一个氯离子通道。c f t r 由五部分区域组成：两个跨膜区域 ( m e m b r a n e s p a r m i n gd o m a m s ，m s d s ) ，两个核酸结合区域( n u c l e o t i d e b i n d i n gd o m a i n s ，n b d s ) ，一个调节区域( r e g u l a t o r y ( r ) d o m a i n ) 。这五 部分区域组成两个基元，每个基元含有一个通常是六次跨膜( 但并不总是 六次) 的膜跨越区域( m s d ) 部分和一个核酸结合区域( n b d ) 。有人认为， n b d 含有与a t p 相互作用的序列 4 2 o 在c f t r 中，两个m s d - n b d 基元 通过rd o m a i n ( r e g u l a t o r y d o m a i n ) 连接。rd o m a i n 含有多个带电 氨基酸，形成多个磷酸化位点。这几部分整合在一起具有c f t rc 1 一通 道功能。其中，m s d s 决定c l - 选择性孔的形成e 4 3 ，而由n b d s 的a t p 水 解作用控制通道的开闭，rd o m m n 磷酸化控制通道的活性d 4 。 图3 c f t r 蛋白的拓扑结构图。c f t r 含有两个跨膜结构域( m e m b r a n e - s p a n n i n g d o m a i n ，m s d ) 两个核苷酸结合位点( n u d e o t i d e - b i n d i n gd o m a i n ，n b d )