（果树学专业论文）柑橘果实糖积累的生理基础研究.pdf

1 i a b a a i h e x j s n i s e s p s s s s u c u d p u d p g v b a b s c i s i ca c i d a c i di n v e r t a s e h e x o s e j u i c es a c s n e u t r a li n v e r t a s e s e g m e n te p i d e r m i s 缩略语表 脱落酸 酸性转化酶 己糖 汁囊 中性转化酶 囊瓣皮 s u c r o s ep h o s p h a t e s y n t h a s e蔗糖磷酸合成酶 s u c r o s es y n t h a s e 蔗糖合成酶 s u c r o s e 蔗糖 u r i d i n ed i p h o s p h a t e 尿苷二磷酸 u r i d i n ed i p h o s p h a t eg l u c o s e 尿苷二磷酸葡萄糖 v a s c u l a rb u n d l e 维管束 中文摘要 我国是世界上最大的宽皮柑橘( c i t r u s ，e t i c u l a t a ) 生产国，产量占世界总“：量的 4 0 以上。但我国柑橘品质相对较差，经济效益不高。随着生活水平的提高和水果 的供应种类的车富，目前对柑橘品质提出了更高的要求。含糖量对柑橘品质起着主 导作用，它不仅影响果实的甜味和着色，还是合成有机酸、维生素和类胡萝h 素等 营养成分的基础原料。因此研究柑橘果实糖积累机理对改善柑橘品质具有匝要意 义。 本试验于1 9 9 9 2 0 0 0 年进行，以富川温州蜜柑为主要研究材料，对果实发育过 程中光合产物的运输、分配，糖的积累，蔗糖代谢相关酶对果实中糖积累的作开】， a b a 含量的变化以及栽培措施对果实糖积累的影响进行了系统研究。主要结果如 下： ( 1 ) 用“c 同位素标记显示，在果实膨大期分配到汁囊中的光合产物占整个架实的 一半以上；进入着色期后分配到果皮中的光合产物迅速增多，而分配到汁囊中 的比例明显下降。i 囊瓣皮与汁囊的放射性比活度的比率随果实的发育逐渐增 大，表明在果实发育后期韧皮部后运输明显地限制了光合产物向汁囊的分配。 ( 2 ) 从果实膨大初期至完熟期汁囊始终是以直接积累可溶性糖为主。计囊二r 曛在全 果中所占的比重随着果实的发育而升高；至究熟期汁囊对果实干重增加的贞献 、 超过8 5 。7 ( 3 ) 果实不同发育时期及不同部位的呼吸强度存在差异。在果实发育后期，且i 然输 入汁囊中光合产物的比例呈下降趋势，但此时可食组织( f t 囊+ 囊瓣皮) 的呼吸速 率也不断下降，且保持较低水平。这对保证汁囊在果实发育后期仍能迅速积累 干物质具有重要意义。、 ( 4 ) 蔗糖代谢相关酶对果实发育和糖积累具有重要影响。锰果实发育前期蔗糖分解 酶类 包括酸性转化酶( a i ) 、中性转化酶( n i ) 和蔗糖合成酶( s s ) 的分解方向】的活 性大于蔗糖合成酶类 包括蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 和蔗糖合成酶的合成方伽：此 时果实新陈代谢旺盛，输入的光合产物被消耗的比例较大，糖的积累缓慢。随 后蔗糖代谢相关酶的活性随着果实的发育而下降，蔗糖分解酶类的降幅业大。 至果实膨大基本完成并开始着色时，蔗糖代谢相关酶的净活性( 蔗糖合成酶类 的活性蔗糖分解酶类的活性) 由负值转为难值，糖积累速度明显加快。剑完熟 j f ，可食组织中蔗糖代谢相关酶的净活性很低，但糖的积累仍较快：说 刿此时 可食组织中糖含量的增加可能是光合产物直接输入的结果。果皮组织中蔗糖分 解酶类( 主要是a i ) 的活性总体上高于可食组织，特别是果实发育后期更f 月显： 这可能是果皮组织中己糖比例商的重要原因。 ( 5 ) 对本地早、桠柑、香柠檬和宫川的研究结果表明：在汁囊中，本地早和寓川是 以积累蔗糖为主，香柠檬以积累己糖为主，碰柑介于二者之间。在酸度较高的 香柠檬中，蔗糖的酸水解可能是影响汁囊中糖分构成的：e 要因素。在酸度较低 的本地早、宫川和桠柑中，果实发育后期汁囊中的a i 活性可能是影响糖分构成 的主要原因。j ( 6 ) 果实中的a b a 含量与糖积累之间关系密切。糖积累较多的品种，如奉地早和 宫川，内源a b a 含量较高：糖含量较低的品种，如碰柑( 采收时可能还没有充 分成熟) 和香柠檬，a b a 含量较低。? 在果实发育后期，汁囊、果皮和输导组织 中的a b a 含量与糖含量均呈显著f 相关，相关系数分别为o 8 9 9 、o8 7 8 和 0 6 8 1 ：而输导组织中的a b a 含量与汁囊中的糖含量之问的相关系数更l 二高达 0 9 0 3 ，这表明输导组织中的a b a 含量对汁囊中糖的积累具有重要意义。 ( 7 ) 增施氮l i e ( 尿素) 降低了柑橘果实汁囊中的糖含量。造成这一结果的主要原因可 能是：首先处理增加了营养生长，减少了光合产物向汁囊中的分配量，因而削 弱了糖分积累的基础：其次增施氮肥降低了果实中a b a i a a 的比值，从而延 迟了果实的成熟；第三处理增加了蔗糖代谢相关酶f 特别是分解酶类) 的活性， 可能导致己糖消耗的增多。 ( 8 ) 外源a b a 处理促进了柑橘果实汁囊中糖分的积累，特别是己糖含量 显提 高。“c 同位素标记显示，a b a 处理并不能促进光合产物向汁囊中的分配。这 可能是，处理加快了果实的成熟与衰老进程，降低汁囊中糖分的代谢消奉。 关键词：柑橘品种，果实，光合产物分配，糖积累，转化酶，蔗糖合成酶，蔗糖磷 酸合成酶，脱落酸，尿素 第一章前言 1 选题的目的 柑橘是芸香科( r u t a c e a e ) 柑橘皿科( a u r a n t i o i d e a e ) 中的一组常绿植物。栽培柑橘 多属于柑橘亚科的柑橘属( c i t r u sl ) 。柑橘果实“色、香、昧”兼优，不仅风味优 美，而且果汁中还含有多量糖分、有机酸、矿物质以及丰富的维生紊，营养价值较 高，因此深受人们的喜爱。除了食用，柑橘还是医药和食品加工的重要原料。如今 柑橘已成为是世界性重要果树，2 0 0 0 年全球产量超过一亿吨，居各类水果之旨。 我国是柑橘的主要原产地之一。柑橘在中国的栽培历史已有4 0 0 0 多年，黄河 以南的1 9 个省( 市、自治区) 都有栽培或分布。近年来我国柑橘产业发展迅速，目 前柑橘是我国仅次于苹果的的第二大水果。2 0 0 0 年我国柑橘产量超过一干两百万 吨，居世界第三位。宽皮柑橘( c i t r u sr e t i c u l a t a ) - - 直是我国的栽培主体，近些年所 占比重虽有所下降，但目前栽培面积和产量仍分别占全国的6 9 和6 3 以t ，占 世界宽皮柑橘总产量的4 0 以上( 根据f a o 网上公布数据整理) 。 浙江是我国主要的柑橘生产省份之一，近几年产量均居全国首位。但由一j 二品种 结构不科学，成熟期过于集中；而管理水平较低，致使果实品质普遍较差。随着人 们生活和消费水平的提高，再加上水果的供应种类日益丰富，目前市场上柑橘已出 现明显滞销。因此，品质问题已经成为阻碍浙江乃至全国柑橘产业健康发展的关键 因素。 柑橘品质包括外观与内质两个方面。外观品质包括果实形状、大小、果皮光滑 度、色泽以及浮皮程度等；内质包括可食率、糖酸比、囊瓣皮以及汁囊的柔软程 度、果汁的含糖量和色泽以及榨出率等。在上述诸多因素中，含糖量对品质起着主 导作用，它不仅左右着风味的好坏，而且还是类胡萝h 素、维生索和有机酸等营养 物质生成的基础原料，同时果皮中糖的含量直接影响到果实的着色( 华南农q k 大学 ( 主编) ，1 9 8 9 ；松本和夫，1 9 8 4 ) ，因此提高果实含糖量对改善柑橘品质具有重要意 义。 为了较全面地了解果实中糖积累的研究状况，我们系统地归纳了前人对果实中 糖的运输、代谢和积累的研究结果。 2 果实中糖的积累特点 不同果实糖积累的方式存在明显差异。在发育过程中，果实通常以淀粉、蔗糖 和己糖的形式积累碳水化合物。储存淀粉的果实( 如香蕉，猕猴桃) 在采后通过分解 果实中淀粉积累可溶性糖( b e a u d r y 等，1 9 8 9 ；h u b b a r d 等，1 9 9 0 a ；m a c r a e 等，1 9 9 2 ) 。缺 少储备型碳水化合物的果实，如香瓜( m u s k m e l o n ) ，必需连在植物体上a 能私! 累可 溶性糖( h u b b a r d 等，1 9 9 0 b ) 。另外，在以山梨醇( 如蔷薇科植物、山楂等) 或棉予糖 ( 如石榴) 等为光合产物主要( 但非唯一) 运输形式的植物中，果实内蔗糖或己糟的积 累是靠把运入的其他种类的糖不断转化为蔗糖或已糖来实现的( v i z z o t t o 等，1 9 9 6 ； b i a n c o 等，1 9 9 9 ；z i m m e r m a n 等，1 9 7 5 ) 。 柑橘果实中的可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖( l o w e l l 等，1 9 8 9 ：t a k a g i 等，1 9 9 4 ) 。由于三种糖的口感和甜度不同，而不同柑橘中这三种糖的含量和比例 存在较大差异( l o w e l l 等，1 9 8 9 ；k o m a t s u 等，1 9 9 9 ) ，因此果实中糖的积累悄；兄列各 种柑橘特有风味的形成具有重要影响。 柑橘果实( 特别是其汁囊部分) 缺少储备型碳水化合物，以直接积累可溶性糖为 主。在果实发育过程中糖的含量逐渐增加，但蔗糖、葡萄糖和果糖的变化并不完全 一致，果实不同部位糖的积累情况也不一样。在早熟和中晚熟温州1 蜜柑果实一h 汁 囊中蔗糖含量都是在9 月开始上升，中晚熟品种果皮中总糖的含量上升较晚，但汁 囊中糖的积累模式相差不大( m u k a i 等，2 0 0 0 ) 。温州蜜柑果皮糖含量从9 月下干u 开始 迅速增加( 紧随汁囊) ，增加的主要是还原糖。在着色期低温可诱导果皮和汁旋中总 糖积累增多，汁囊中以蔗糖增加为主，果皮中以还原糖为主：高温延迟果皮退绿进 程，同时果皮中还原糖积累较少( t a k a g i 等，1 9 9 4 ) 。“m a r s h ”葡萄柚果实在膨大中 期之前汁囊中的蔗糖含量明显高于白皮层、维管束和囊瓣皮，之后汁囊中的蔗糖含 量下降，而白皮层、维管束和囊瓣皮中的蔗糖含量上升并超过汁囊：成熟时汁囊中 的蔗糖和己糖分别占可溶性总糖的4 5 和5 5 ( l o w e l l 等，1 9 8 9 ) 。温州蜜柑( c u n s h i um a r c c v o k i t s uw a s e ) 汁囊中蔗糖的积累速度始终高于果糖和葡萄糖，而 果皮组织中三种糖的含量直比较接近：成熟时汁囊中的蔗糖、果糖和葡萄糖分别 占可溶性总糖的6 5 、2 0 和1 4 ( k o m a t s u 等，1 9 9 9 ) 。在克里曼丁d , = t l 橘( 包括 f i n a ，o r o v a la n dh e r n a n d i n a 等品种) 和橙( 包括n a v e l i n a ，w a s h i n g t o nn a v e la n d n a v e l a t e 等品种) 的成熟过程中，汁囊中蔗糖含量上升，果皮中还原糖含垃上升 ( t a d e o 等，1 9 8 7 ) 。在偏酸果实( 如酸莱檬) 中，蔗糖含量在果实发育早期达到最大 值，之后随着有机酸含量的上升蔗糖含量逐渐下降( e c h e v e r r i a 等，1 9 8 9 ) 。在 i f 来檬 果实的汁囊中以积累己糖为主，蔗糖占总糖含量不超过2 0 ( e c h e x ，e r r i a 等， 1 9 9 7 ) 。可见柑橘品种间果实中的糖积累既有相似之处( 糖随果实的发育而积累) 又有 明显不同( 糖的构成比例不同) ，但目前对品种间糖积累差异的内在机制还不i 分清 楚。 3 糖的运输 果实中的糖主要来自叶片的光合产物。在大多数植物中( 包括柑橘) 光合产物主 要以蔗糖的形式通过韧皮部运入果实( k r i e d m a n n ，1 9 6 9 ) ；在蔷薇科植物中，光合产 物则主要以山梨醇和蔗糖的形式进入果实( b i a n c o 等，1 9 9 9 ；v i z z o t t o 等，1 9 9 6 ) 。 在番茄果实发育过程中，控制糖分积累的关键不是n “p 片的光合作用和光合产物 输出叶片的能力，而是光合产物在果实中从韧皮部卸出、卸出后的运输以及糖跨膜 进入储藏细胞等的能力( h o 等，1 9 8 6 ；o f f e r 等，1 9 8 6 ) 。对柑橘果实中控制糖积累的关 键步骤目前尚无统一的认识。 柑橘果实具有独特的解剖结构。维管束通过果柄进入果实后分布在囊瓣皮的外 侧，汁囊组织被囊瓣皮所包围。积累糖分的薄壁细胞位于汁囊中，而汁囊组织缺少 韧皮部：因此，光合产物进入果实后首先要从位于囊瓣皮表面的维管束卸乩然后 穿过囊瓣皮和由薄壁细胞构成的汁囊柄( 这段运输过程称为韧皮部后运输) 卅能进入 汁囊( k o c h 等，1 9 8 4 ；l o w e l l 等1 9 8 9 ) 。 光合产物在韧皮部后运输比在韧皮部运输的速度急剧减慢( k o c h 等1 9 9 0 ) ，在 此过程中光合产物部分发生水解( k o c h 等，1 9 8 4 ) 。目前已证明番茄果实中糖的切皮 部后运输有质外体和共质体两条途径( d a m o n 等，1 9 8 8 ) 。质外体途径是指糖分从韧皮 部卸出到质外体空间( 细胞间隙) ，再从质外体空间跨膜运入储藏薄壁细胞r h 共质 体途径是指糖分通过胞间连丝从一个细胞进入另一个细胞最后进入储藏薄壁细胞， 整个过程不离开共质体空间。用局部冷却杀死葡萄柚汁囊柄的一段细胞后发现，汁 囊柄仍转运带标记的同化产物，说明质外体途径可以单独进行同化产物运输( k o c h 等，1 9 8 6 ) 。葡萄柚和温州蜜柑的汁囊柄上也存在着一定数量的胞间连丝，根据胞问 连丝的数量较少，可以解释为什么同化产物在汁囊柄中的移动速度较慢( k o c h 等， 1 9 8 6 ；n i i 等，1 9 8 8 ) 。这龅明共质体途径也可能参与了同化产物的运输。但卡“橘果实 中糖的韧皮部后运输到底是通过质外体还是共质体尚无明确的定论。 液泡是细胞内主要的储存部位，糖进入细胞后一部分用于代谢消耗，利余部分 主要储存在液泡中。苹果细胞中的葡萄糖和果糖几乎都存在于液泡中( y a m a k i ， 1 9 8 4 ) 。伏令夏橙果实细胞中全部的蔗糖和7 5 的葡萄糖和果糖储存于液泡中 ( e c h e v e r r i a 等，1 9 8 8 ) 。 糖从细胞质进入液泡必需穿越液泡膜，目前已知的穿膜方式主要有：( 1 ) f i 由扩 散即不需要载体和能量的物质穿膜方式：( 2 ) 易化扩散即需要载体但不需要ij “t 二2 “l d 。的 物质穿膜方式( 3 ) 主动运输即需要载体并消牦能量的物质穿膜方式。在以1 ! 祟己糖 为主的甜莱檬果实中，液泡中的蔗糖被酸性转化酶所分解，从而在液泡膜内外形成 蔗糖梯度，促进蔗糖通过易化扩散穿膜进入液泡( e c h e v e r r i a 等，1 9 9 7 ) 。但在柑橘的 其他种和品种( 如上文提到的以积累蔗糖为主的温州蜜柑) 的果实中，糖的穿膜运输 方式目前还知之甚少。 4 蔗糖代谢相关酶在糖的代谢和积累中的作用 蔗糖是植物体内最重要的一种碳水化合物。它是大多数植物光合产物从源 向库运输的主要形式( k f i e d m a n n ，1 9 6 9 ) ，也是许多果实中糖积累的主要形式 ( v i z z o n o 等，1 9 9 6 ；k o m a t s u 等，1 9 9 9 ；b i a n c o 等，1 9 9 9 ) 。此外蔗糖( 或起源于蔗糖的 某些代谢中间物) 还作为细胞代谢的调节因子( 可能通过影响基因表达起作用) 发挥 着营养之外的作用( j a n g 等，1 9 9 4 ) 。与蔗糖代谢和积累密切相关的酶主要有越糖磷 酸合成酶( s p s ，e c2 4 1 1 4 ) 、蔗糖合成酶( s s ，e c2 4 1 1 3 ) 和转化酶( e c3 2 12 6 ) 。 s p s 广泛存在于光合和非光合组织的细胞质中，是一种低丰度的可溶性酶，且 相对不稳定，因此s p s 的纯化和特性研究进展缓慢。9 0 年代初s p s 才在菠菜和玉 米中被纯化，结果表明s p s 是由分子量介于1 1 7 1 3 8k d a 的亚基构成的二聚体或四 聚体( h u b e r 等，1 9 9 6 ；赵智中等，2 0 0 0 ) 。 s p s 在蔗糖的生物合成中起主要作用，催化如下可逆反应：u d p g + f r u c t o s e 一 6 - p s u c r o s e 6 - p + u d p 。上述反应的生成物s u c r o s e - 6 - p 通常被磷酸蔗糖磷酸化 酶( s p p ) 迅速降解成蔗糖和磷酸根离子；而s p s 和s p p 又是以复合体的形式存在于 植物体内，所以s p s 催化的蔗糖生成事实上是不可逆的( h u b e r 等，1 9 9 6 ) 。 s p s 在蔗糖积累型库组织中具有重要作用。许多果实成熟过程中蔗糖的积累和 s p s 活性的升高密切相关。s p s 是香瓜果实中决定蔗糖积累的主要因子( l i n g l e 等， 1 9 8 7 ；h u b b a r d 等，1 9 8 9 ) 。桃、草莓、猕猴桃和芒果中s p s 活性的升高与体内蔗糖 的积累相一致( h u b b a r d 等，1 9 9 1 ) 。成熟期普通番茄果实中蔗糖含量不超过1 5m m g f w ，其s p s 的活性在整个果实发育过程中都很低；而在蔗糖积累型的番茄成熟期 果实中蔗糖含量约为l1 8m m g ，其s p s 的活性在果实发育未期约为前期f t ；j ) t 倍 ( m i r o n 等，1 9 9 1 ) 。在高蔗糖积累型日本梨c h o j u r o 成熟过程中s p s 和s s 的活性 和蔗糖的积累相一致：在低蔗糖积累型中国梨鸭梨成熟过程中s p s 和s s 的活 性没有升高( m o r i g u c h i 等，1 9 9 2 ) 。温州蜜柑可食组织( 汁囊和囊瓣皮) 中蔗糖的积累 趋势和s p s 活性的升高相一致( k o m a t s u 等，1 9 9 9 ) 。对香蕉、猕猴桃、甜椒、甜菜 等 3 - 1 0 的研究也表明：在果实成熟过程中随着果实中蔗糖浓度的升高s p s 的活 性显著提高( h u b b a r d 等，1 9 9 0 a ；m a c r a e 等，1 9 9 2 ；n i e l s e n 等，1 9 9 1 ；f i e u ws 等， 1 9 8 7 ) 。 目前至少已在玉米、菠菜和水稻等1 4 种植物中克隆到s p s 的编码基凶( 赵智中 等，2 0 0 0 ) 。温州蜜柑s p s 基因的三个同源e d n a 片段( 包括一个全长c d n a ) ( k o m a t s u 等，1 9 9 9 ) 也已被克隆到。n o r t h e r n 杂交结果表明，在成熟期，柑橘可食组 织和猕猴桃果实中s p s 转录产物的积累与s p s 活性的升高相一致( k o m a t s u 等，1 9 9 9 ； l a n g e n k a m p e r 等，1 9 9 8 ) 。对转基因番茄的研究表明：降低马铃薯叶片和块茎的s p s 的活性，则块茎中蔗糖的重新合成能力被降低；提高叶片中s p s 的活性，! j ! i j 果实 中糖的含量上升( g e i g e n b e r g e r 等，1 9 9 5 ) 。这些结果显示了s p s 对库组织中蔗糖的代 谢具有重要影响。 s s 是一种存在于细胞质中的可溶性酶 成的四聚体( h u b e r 等，1 9 9 6 ；t a n a s e 等 等1 9 8 8 ) 。 它是由分子量约为8 3 1 0 0k d a 的、i e 基构 2 0 0 0 ；n a s c i r n e n t o 等，2 0 0 0 ；m o r i g u c h i 在植物生长发育与光合产物的相互作用中s s 是一个主要因子。它催化如下可逆 反应：u d p g + f r u c t o s e s u c r o s e + u d p 。虽然s s 既可催化蔗糖合成又可催化蔗 糖分解，但通常认为s s 在植物体内主要起催化蔗糖分解的作用。不过对2 3 _ i l i 梨的 研究发现，果实中s s 的活性与蔗糖含量的相关系数为0 6 3 3 而s p s 的活性与蔗糖含 量的相关系数仅为0 4 4 5 ( m o r i g u c h i 等，1 9 9 2 ) 。对甘蔗和桃果实的研究也表明，s s 在 蔗糖积累中的贡献远超过s p s ( b a t t a 等，1 9 8 6 ；m o r i g u c h i 等，1 9 9 0 ) 。事实上s s 具有不 同的同工型( w o l o s i u k 等，1 9 7 1 ；s u n g 等，1 9 7 7 ；g r o s s 等，1 9 8 2 ；e c h t 等，1 9 8 5 ；l a r s e n 等， 1 9 9 0 ) 。比如在梨中发现了s s 的两种同工型s si 和s si i ，他们分子量相同，但催化 性质却存在明显差异。成熟果实中的s si i 可能是蔗糖迅速积累时起作用的一种s s 同工酶，因为与s si 相比s si i 更容易催化蔗糖的合成：未成熟果实中的s si 更接近 典型的s s ，它在植物体内主要是催化蔗糖的分解。因此，s si 和s s1 1 分别在未成熟 和成熟果实碳水化合物的利用中发挥作用( s u z u k i 等，1 9 9 6 ；t a n a s e 等、2 0 0 0 ) 。葡萄 柚果实从细胞活跃分裂期到膨大中期，汁囊中s s 的合成活性逐渐升高，而分解活 性迅速降低( l o w e l l 等，1 9 8 9 ) 。这种合成活性与分解活性的迥异变化，或许也与同 工酶的作用有关。 s s 被定位在柑橘和玉米叶片的中脉以及果实维管束卸出区的伴胞中；s s 的活 性在葡萄柚的维管束和维管束卸出区远高于其他组织。这暗示在维管束组织t ps s 具有重要生理功f l ( t o m l i n s o n 等，1 9 9 1 ；n o l t e 等，1 9 9 3 ) 。在番茄果实发育i t 期，改 变s s 的活性直接影响果实中千物质的积累速率和蔗糖的分解指数。这表哪is s 可 能通过对蔗糖的分解来调节蔗糖向果实的运入及分配去向( d e m n i t z 等，1 9 9 7 ) 在 转入反义s s 基因的番茄幼果中蔗糖的卸出能力下降。说明s s 直接影响幼果中蔗 糖的输入能力( d a o u s t ，1 9 9 9 ) 。凋此，s s 可作为反映果实库强度的一个指标( s u n 等，1 9 9 2 ) 。但另有研究表明，在转入反义s s 基因的番茄幼果中，虽然s s 的活性降 低了大约9 9 ，却对果实中淀粉和糖的积累没有影响。所以，s s 是否真的能反映 果实的库强度尚有疑问fc h e n g a p p a 等，1 9 9 9 ) 。 在小麦、玉米、番茄和水稻等植物中已分离到s s 基因( w a n g 等，1 9 9 9 ：w a n g 等，1 9 9 3 ) 。柑桔中的s s 基因也已被克隆得到( k o m a t s u 等，1 9 9 5 ) 。目前人h j f f 在通 过转基因植株对s s 的功能作进一步的研究。 转化酶包括酸性转化酶( a i ) 和中性转化酶( n d 。酸性转化酶的最适p h 值为3 到 5 之间：它又有可分为可溶性酸性转化酶( s o l u b l ea i ) 和不溶性酸性转化酶( i n s o l u b l e 酸性转化酶) 两种：前者分布于液泡中，后者存在于细胞间隙并结合在细胞壁上。 中性转化酶的最适p h 值在7 左右：也分为可溶性中性转化酶( s o l u b l en i ) i i 不溶性 中性转化酶( i n s o l u b l en i ) 两种，分别分布于细胞质和细胞壁中( l o w e l l 等，1 9 8 9 ； k l a n n 等，1 9 9 6 ；x u 等，1 9 9 5 ) 。转化酶催化如下反应：s u c r o s e + h ，o - f r u c t o s e + g l u c o s e ，因此对组织获得作为能量和碳源的己糖具有重要影, t 自( s t u r m 等，1 9 9 5 ) 。 在桃果实发育早期酸性转化酶的活性与果实重量增加的相关性比s s 皿为密切 ( l o b i a n c o 等，1 9 9 9 ) 。在胡萝h 的根部，液泡中的转化酶对形成和维持源库之间的 浓度梯度具有重要作用( s t u r m 等。1 9 9 5 ) 。在蔗糖积累型的番茄果实中，蔗糖的积累 主要发生在果实达至n 其最大体积后这段时期，在此期间s p s 的活性并未随着蔗糖 的增加而上升。在蔗糖积累型果实和己糖积累型果实问睢明显的区别就是f j u 者缺 少酸性转化酶活性。在整个蔗糖积累型果实发育期间检测不到酸性转化酶的 m r n a ( k l a n n 等，1 9 9 3 ) 。在甜瓜( s w e e tm e l o n ) 中伴随着蔗糖的积累a i 的活性急剧下 降( s c h a f f e r 等，1 9 8 7 ) 。n i 的活性在葡萄柚的非维管组织( 如汁囊和白皮层) c m 高， 而葡萄柚汁囊组织中己糖含量高达5 5 ( l o w e l l 等，1 9 8 9 ) 。通过转入反义可溶性酸 性转化酶基因，大大降低了栽培番茄成熟果实中的转化酶活性水平，从而提高了蔗 糖含量( k l a r m 等，1 9 9 6 ) 。因此，转化酶被认为参与了植物的生长( m o r r i s 昝，1 9 8 4 ， p f e i f f e r 等，1 9 9 5 ) 、韧皮都的卸出( r o i t s e h 等，1 9 9 6 ) $ 1 己糖的积累( k l a n n 等，1 9 9 3 ) 等 过程。 目前转化酶的基因已在番茄、胡萝h 等十六种植物中被克隆( k l a n n 等，1 9 9 2 ； s t u r m ，1 9 9 0 ) 。在果树中葡萄的转化酶基因已有报道( d a v i e s 等，1 9 9 6 ) ；柑橘和草莓 的转化酶基因目前在g e n b a r 出中也已有登录序列。这为进一步研究转化酶的功能 奠定了基础。 因为上述三种酶类都与蔗糖有关，所以蔗糖代谢相关酶的综合作用对果实中糖 的代谢和积累的影响远比一种酶的作用更为重要。例如，草莓果实中蔗糖含量增加 时，s p s 、中性转化酶和s s 的活性都在升高( h u b b a r d 等，1 9 9 1 ) 。在桃果实的发育 过程中，虽然蔗糖逐渐积累，但s p s 的活性并未升高，而转化酶活性却呈卜降趋 势( v i z z o a 等，1 9 9 6 ) 。在蔗糖积累型甜瓜( s w e e tm e l o n ) 中，酸性转化酶的活性伴随 着蔗糖的积累而显著下降；而在蔗糖含量较低的黄瓜和非甜瓜( n o n s w e e tm e l o n ) 中，成熟期的果实中仍有明显的酸性转化酶活性( s e h a f f e r 等，1 9 8 7 ) 。可见果实中蔗 糖的积累并非总是伴随着s p s 活性升高，也可由其他原因，如转化酶活性降低， 引起。 有关蔗糖代谢相关酶在果实糖代谢和积累中的作用在番茄研究较多。k l a n n 等 认为蔗糖积累型和己糖积累型果实在酶方面唯一显著的区别是前者缺少酸性转化酶 活性( k l a n n 等，1 9 9 0 ) 。m i r o n 等则发现蔗糖积累型番茄果实中可溶性酸性转化酶活 性的下降也与蔗糖浓度的上升相一致( m i r o n 等，1 9 9 1 ) 。而d a l i 等却发现在蔗糖积累 型番茄中，蔗糖水平的提高与s p s 活性的升高和转化酶活性的逐渐降低1 h 一致 ( d a l i 等，1 9 9 2 ) 。可见虽然在不同的番茄果实中蔗糖和己糖的积累情况刁i j i d ，但 蔗糖代谢相关酶在果实中糖的代谢和积累的作用是肯定的。 目前关于蔗糖代谢相关酶在柑橘果实糖代谢和积累中的作用的研究还比较少： 而要深入了解柑橘果实糖积累的机理，就必须对酶的作用有一个明确的认识 5 其他因素对果实中糖积累的影响 在水分供应基本满足需要的前提下，一定时期内适度的水分亏缺对果实品质无 不良影响，甚至还能使果实汁液中可溶性固形物和含糖量有所提高( m i l l s 等】9 9 6 ； m u k a i 等，1 9 9 6 ；y a k u s h i j i 等，1 9 9 6 ) 。水分胁迫条件下的温州蜜柑( n a n k a n2 0 g o u ) 果实果汁中蔗糖、葡萄糖和果糖浓度上升，汁囊中酸度也升高，单果含糖量1 1 月显高 于供水良好的果实。说明在水分胁迫条件下果实中糖的积累不是由于脱水造成，而 是由于水分胁迫造成的活跃渗透调节所致( y a k u s h i j i 等，1 9 9 6 ) 。同位素杯记戈验证 明，在适度干旱胁迫条件下，温州蜜柑果实中分配到的碳元素最多，单果含糖越高 0 于严重缺水和供水良好的果实。表明干旱胁迫条件下果实中粑的积累是由1 i 光合产 物运输的增加造成的( y a k u s h i j i 等，1 9 9 8 ) 。i 而k a d o y a 则推测在水分胁迫条什i j ，细 胞壁的水解导致果实中在适度水分胁迫条件下，桃果实中的l lj 梨醇、蔗糖、总糖水 平和山梨醇氧化酶活性都上升，a b a 的水平也升高。这说明水分胁迫诱导的a b a 可以通过活化山梨醇代谢来激活糖的积累( k o b a s h i 等，2 0 0 0 ) 。但水分胁迫埘果实中 糖积累促进作用与蔗糖代谢相关酶的作刚有无关系，尚未见报道。 矿质元素对柑橘品质也有定影响。超量施氮会造成果皮 h 厚、着色延迟，果 汁含糖量减少、果实品质下降( 华南农业大学，1 9 9 1 ) 。但适当施用氮肥则可i & 顾产 量和品质两个方面( 马国瑞，1 9 9 4 ；张谷雄等，1 9 9 4 ) 。在定施磷量范围内，温州蜜 柑果实中含糖量在一定范围内随施磷量的增加而提高，缺磷或超量磷会降低果实中 含糖量f 刘运武，1 9 9 5 ) 。适量增施钾肥对提高柑橘品质有良好的效果，但 ；l f f 肥用量 过多不仅使果实着色推迟，而且糖分减少、酸度增加( 马国瑞，1 9 9 4 ) 等等。f f 是， 目前对矿质元素影响相橘品质的生理机制却知之甚少。 a b a 可以阻止植物的发育( w a l t o n ，1 9 8 0 ；z e e v a a r t 等，1 9 8 8 ) ，促进同化产物在库 组织中的积累( b e r u t e r ，1 9 8 3 ；h e i n 等，1 9 8 4 ；k o j i m a 等，1 9 9 3 ，1 9 9 4 ；s c h u s s l e r 等， 1 9 8 4 ) 。例如，非呼吸跃变型果实( 如柑橘、草莓、葡萄和樱桃等) 的成熟伴随着 a b a 含量的增加( 莱谢姆等，1 9 9 0 ) ：草莓果实成熟过程中内源a b a 的积累与果实 中糖的积累成平行关系( a r c h b o l d ，1 9 8 8 ) 。外源a b a 处理可以使甘蔗的糖度比埘照 提高1 5 5 2 0 9 ( h a y a m i c h i b ，1 9 9 7 ) 。外源a b a 处理可引起柑橘汁囊中葡萄糖和 果糖浓度升高，但对有机酸含量没有影响( k o j i m a 等，1 9 9 5 ) 。 a b a 还可以影响酶的活性，在大豆种予中外源a b a 处理可以提高转化酶的活 性( a c k e r s o n ，1 9 8 5 ) 。喷5 0 0m g l 的a b a 可以促进花后9 0 天的桃( h a k u h o ) 果实中 糖的积累，果实中山梨醇氧化酶的活性提高，但s s 、s p s 和a i 的活性没有变化。 这显示a b a 可以通过刺激山梨醇氧化酶的活性来促进果实中糖的积累( k o b a s h i 等， 1 9 9 9 ) 。这与水分胁迫引起桃果实糖含量升高的原因十分相似。对柑橘果实中a b a 与糖积累的关系以及外源a b a 促进糖积累的生理基础尚未见报道。 适当延迟某些品种的采收是提高果实糖度、改善品质的措施之。t a k e b a y a s h i 等对9 8 个种和品种的柑橘进行延迟采收实验( 留在树上最后直至果实脱落或腐 烂) ，结果表明，根掘果实中糖的积累模式这些柑橘可分为四大类：( 1 ) 果实t ，的总 糖含量可以超过ll ；( 2 ) 总糖含量可以达到1 0 ；( 3 ) 总糖含量只能达到8 ：( 4 ) 总糖含量少于5 。第一类中的m i y a g a w aw a s e 、k i s h um i k a n 和p o n k a n 可以积累 超过1 5 的总糖。早熟品种m i y a u c h ii y o k a n 和k i y o m i 在延迟采收期间品质得到明 显提高( t a k e b a y a s h i 等，1 9 9 3 ) 。浙江省科农院柑桔研究所等单位在临海对4 0 0 0 亩宫 川温州蜜柑实行完熟栽培试验，1 1 月中下旬采收可以提高糖度2 4 度，效果良 好。 6 本研究的意义 我国是世界上最大的柑橘生产国之一。但我国柑橘的出口比例较小，圳：和国 内市场价格明显偏低，经济效益不高。这严重挫伤了果农的生产积极性，m 懈了我 国柑橘产业的进一步健康发展。造成这一结果的原因很多，但品质较差无疑足最主 要的原因之一。因此提高柑橘品质已成为我国柑橘产业今后能否经受住加入w t o 带来的市场冲击，并在竞争中获得长足发展的关键问题。 因为果实含糖量对柑橘品质具有重要影响，因此研究柑橘果实糖积累机艘对改 善柑橘品质具有重要意义。虽然已有许多关于果实中糖积累的研究，但这些研究或 缺乏系统性或不够深入。所以至今为止人们对柑橘果实糖的积累机理仍不十分清 楚。本文作者以我国柑橘的主栽品种类型温州蜜柑为主要研究材料，匝点对 果实发育过程中糖的运输、分配和积累以及栽培措施对果实糖积累的影响进i t 了系 统研究；并在此基础上从生理学的角度分析了柑橘品质形成过程中糖的运输、分配 和积累特点，蔗糖代谢相关酶对果实中糖积累的作用，不同的柑橘果实中糖的含量 和构成比例差异的形成原因，以及各种处理对果实糖积累的影响机制。这为今后生 产中通过各种措施提高柑橘品质提供理论基础：也为将来通过分子生物学于段改良 品种、提高果实含糖量奠定生理学基础。 第二章温州蜜柑果实中光合产物的运输、分配 和干重积累特点 以宫川温州蜜柑为材料，在果实发育的不同阶段研究了“c o 二饲喂叶片4 8 h 后 光合产物在果实中的分配特性，并测定了果实的干、鲜重，糖含苗以及果皮和可 食组织的呼吸速率。结果表明：叶片中光台产物输出的比率随果实的发育进样而 逐渐下降。在果实中，膨大期分配到汁囊中的光合产物r 整个聚实的一、f 以上： 进入着色期后分配到果皮中的光合产物却迅速增多，而分配剑汁囊中的比例明丝 f 降。囊瓣皮与汁囊的放射性比活度的比率随果实的发育逐渐增人，表明在果实 发育后期韧皮部后运输明显地限制了光合产物向汁囊的分配。随着果实的发育汁i 囊部分的干重在全果中所占的比重升高；在完熟期汁囊对果实干重增加的贡献超 过8 5 。果实发育后期果皮和可食组织呼吸速率的不同变化对二者干重的积岽，i 有重要影响 叶片光合产物的不断运入是果实生长和发育的基础( k o c h 等，1 9 9 0 ) 。光合产物 进入果实后主要有两个去向：一是被用于呼吸消耗或转变成其他物质：另一部分则 以蔗糖、葡萄糖和果糖等形式储藏于果实中。在榴莲( d i n i oz i b e t h i n u s ) 果实的发育 过程中，果实的呼吸速率、干重和光合产物的输入量都在不断增加：输入果其中的 光合产物8 0 的以干重的形式积累，2 0 用于呼吸消耗( o g a w a 等，1 9 9 6 ) 。町见光 合产物的运输、分配和呼吸消耗都直接影d i ；, j n 果实中干物质的积累。 叶片光合产物通过枝条维管束穿越果柄进入柑橘果实后，沿维管束运输并卸 出：然后一部分穿过囊瓣皮和汁囊柄分配到汁囊中，另一部分则运入果皮叶，( k o c h ， 1 9 8 4 ) 。虽然对柑橘果实中光合产物的运输、分配及代谢已有较多报道( k o c h 1 9 8 4 ，1 9 9 0 ；t a k a g i 等，1 9 9 4 ；y e n 等，1 9 9 0 ；l o w e l l 等，1 9 8 9 ；k o m a t s u 等，1 9 9 9 ) ，但 目前尚未见对柑橘果实中光合产物运输分配、呼吸消耗与干物质积累的关系进行系 统研究。本文以宫川温州蜜柑为试材，通过“c 同位素标记研究了果实组织中光合 产物运输、分配，干物质的积累和呼吸特点，试图揭示它们之间的相互关系，阐明 柑橘果实干物质积累的生理机制。 1 材料与方法 1 1 实验材料 试验于2 0 0 0 年在浙江省柑橘研究所( 台州市黄岩) 果园内进行，供试果树为成年 枳砧宫川温州蜜 ：h ( c i o 。u su n s h i um a r cc v m i y a g a w aw a s e ) ，盛花期为4 月2 7 2 9r i 。 1 2 c o ，饲喂柑橘n 十片 叶片同位素标记必须兼顾果实的发育时期和天气状况，只有在阳光能保i i e i 叶片 可以进行正常光合作用的情况下才能标记成功。我们选择了果实膨大初期的7 月 2 7 同、膨大期末期的9 月1 9 日、果实着色期的1 0 月l lf | ( 果实退绿转黄) 年果实 完熟期的11 月2 日( 果实基本变黄) 进行试验。首先选择带叶果实，叶片距果柄不 超过5 c m 且正对阳光，饲喂前在叶柄之下远离果实的茎部进行环割以防l i ：标记时 光合产物的向基运输。饲喂时间在上午9 ：0 0 1 2 ：0 0 之间，饲l l 畏前将叶片密土寸在透 明的聚乙烯袋中，袋内注入n a , c 0 3 和n a 2 t m c 0 3 混和液，再注入过量乳酸与n a 2 c 0 3 反应生成c o ：开始饲喂( 记时开始) ，每一叶片的“c 饲喂量为1 8 5 x 1 0 5 b q ，时间为 1h ，在饲喂结束后4 7h 采集果实和标记叶片，立即用液氮冷冻，之后转入2 0 c 保 存。分析时将材料剪碎放入8 0 乙醇( v 厂v ) 中，煮沸1 5m i n 后转入4 c 冰箱 f ! ：、：臧， 固体部分再用液氮蘑碎，加入8 0 醇进行第二次提取，提取液过滤定容后取适 量溶液作放射性测定。试验重复3 次。 1 _ 31 4 c 标记糖的薄层层析 参照r u a n 等( 1 9 9 5 ) 的方法，但薄层层析的硅胶板为6 0 f 2 5 4 ( 2 0c m x 2 0c n l 厚度 o 3 r a m ) 。用乙酸乙酯：乙酸：甲醇：水( 6 0 ：1 5 ：1 5 ：l0 ) 组成上行溶剂系统层析 含”c 标记糖的溶液。标准的葡萄糖、果糖和蔗糖与未知的放射性糖一起同时层 析。在展开1 0 0r a i n 后用1 萘酚硫酸显色剂喷薄板，随后在1 0 0 c 下加热5r a i n 以 测出糖在薄板上的位置。为避免显色剂对待测糖的任何破坏，每一板已展丌的未知 的糖区域在喷显色剂时用纸板遮盖。蔗糖、葡萄糖和果糖的r f 值分别为0 1 8 、0 2 7 和o 3 6 。将原点和溶剂前沿及与每一种糖相对应的水平区带分离刮下到闪烁瓶，闪 烁瓶加0 5m lh 2 0 和4 5m l 二氧六环闪烁液，用w a l l a c l 4 1 0 液体闪烁计数器测定放 射性。试验重复3 次。 1 4 果实干鲜重测定 果实于7 月3 0 日、9 月2 2 日、l o 月1 4 日和1 1 月5r 分五次采收，每次在树 冠外围选典型果1 8 个，分别测定全果、汁囊、果皮、囊瓣皮和维管束的鲜重。然 后在6 0 c 条件下烘5 昼夜至恒重，分别测定其干重。 1 5 糖的分析 参照k o m a t s u 等”坪口l o w e l l 等【i ”的方法，并加以改进。称取4 个果的混合 样，在液氮中磨碎，加提取液( 乙醇：氯仿冰= 1 2 ：5 ：3 ) 后p i - q 浆3 5 m i n ，4 5 0 0 x g 离 心1 5m i n ，取上清液，重复三次，合并提耿液，转入分液漏斗，加水使之分层， 4 5 0 0 。g 离心1 0 r a i n 去除氯仿层，用0 1 nn a o h 调p h 值至7 0 ，在4 0 。c 条件下真 空中干燥，重蒸水定容，用高效液相色谱( b e c k m a n ) n f j 定糖的含量，色谱条件 为：流动相( 乙腈重蒸水= 7 0 3 0 ，v v ) ，流速1 m l m i n ，柱型为p h e n o m e n e x 公司 n u c l e o s i l5 un 心1 0 0 a 柱，1 5 6 示差检测器，s y s t e mg o l ds o f t w a r e 控制及数掘处理 系统。 1 6 呼吸测定 分别于9 月2 2f 1 、1 0 月1 4 日、1 1 月5 日选择有代表性的果实取样。放入2 7 培养箱中预平衡2 4 h ，