（生态学专业论文）久效鳞农药对金鱼carassius+auratus生殖轴线的影响研究.pdf

l 一 川f f i h i i y 1 8 2 8 7 ；i 自；4 久效磷农药对金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 生殖轴线的 影响研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 溯 易一刀， 究工作及取得的 论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得【】或其 他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 兰竺竺竺登，锢飙新碑朋加 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位做作者签名闸千 签字日期：沪f ，o 年r 月弓。日 导师签字： 签字日期：锄睥r 月弓d 的影响研究 蛋白( v i t e l l o g e n i n , v t g ) m r n a 的表达和蛋白合成与分泌，具有潜在的环境雌激素活性，可能是通 过干扰金鱼下丘脑垂体性腺轴( 简称生殖轴线) 对性激素分泌、调控完成的。本 文检测了久效磷农药对雄性金鱼性激素水平的影响，并从芳香化酶( p 4 5 0 a r o m a t a s e ，p 4 5 0 a r o m ) 表达、促性腺激素( g o n a d o t r o p i n s ，g t h s ) 合成与分泌、促性腺 激素释放激素( g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n gh o r m o n e s ，g n r n s ) 调控等多个层次探讨了 久效磷农药影响内源性激素水平的原因，以期从生殖轴线的角度阐明与雌激素受 体无亲和性的久效磷农药发挥环境雌激素活性的机制。此外，雌性鱼类生殖活动 同样受到生殖轴线的调节，其调控机制与雄性鱼类类似，为了确定久效磷农药对 雌性鱼类生殖系统和生殖内分泌系统的干扰作用，本文同时研究了久效磷农药对 雌性金鱼生殖轴线的影响。 本文研究结果表明： ( 1 ) 0 0 l 、0 1 0 和1 0 0m g l 久效磷农药暴露金鱼2 1 天后，采用放射免疫分 析法( r a d i o i m m u n o a s s a y , r t a ) 检测了血浆中性激素含量。结果表明：在雄鱼体内， 睾酮( t e s t o s t e r o n e ，t ) 基样含量较高，l 修雌二醇( 1 7 p - e s t r a d i o l ，e 2 ) 含量极低；在雌 鱼体内，e 2 基样含量较高，t 含量较低；随着久效磷暴露浓度的升高金鱼血浆中 t 含量逐渐降低，e 2 含量逐渐升高，即e 2 厂r 比例逐渐升高，表明久效磷农药暴 露影响了金鱼血浆性激素的水平，从而诱导雄性金鱼合成v t g ，雌性金鱼卵巢 增重。 ( 2 ) 0 0 1 、0 1 0 和1 0 0m g l 久效磷农药暴露金鱼2 1 天后，采用实时定量 r t - p c r 方法检测了性腺和下丘脑组织中p 4 5 0 a r o mm r n a 表达水平。结果表明： 随着久效磷农药暴露浓度的升高金鱼性腺p 4 5 0 a r o m am r n a 表达量逐渐升高， 而下丘脑p 4 5 0 a r o m b 表达无显著变化。因此，我们认为久效磷农药作用的特异 性靶位点为性腺p 4 5 0 a r o m a ，而非脑p 4 5 0 a r o m b ，且其可能是通过提高金鱼性腺 p 4 5 0 a r o m a 的表达，促进了t 向e 2 的转化，从而导致e 2 水平和e 2 t 比值的显 著升高。 ( 3 ) 0 0 1 、0 1 0 和1 0 0m g l 久效磷农药暴露金鱼2 1 天后，采用实时定量 久效磷农药对金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 生殖轴线的影响研究 r t - p c r 方法检测了垂体组织中两种g t h s 卢亚基m r n a 表达水平，包括卵泡刺 激素( f o l l i c l e - s t i m u l a t i n gh o r m o n e ，f s h ) 和促黄体激素( 1 u t e i n i z i n gh o r m o n e ，l h ) ，采 用r i a 检测了血浆中l h 、f s h 的含量。结果表明：随着久效磷农药暴露浓度的 升高金鱼f s h 亚基m r n a 表达和血浆水平逐渐升高，l h 声亚基m r n a 表达 和血浆水平逐渐降低。而f s h 水平的升高会导致e 2 水平的升高，l h 水平的降 低会导致t 水平的降低，从而进一步加强p 4 5 0 a r o m a 基因表达升高所造成的雄 雌激素比例的失衡。因此，我们认为生殖内分泌系统也是久效磷作用于金鱼生殖 轴线的潜在靶位点，从而间接影响性激素合成与分泌。 ( 4 ) 0 0 l 、o 1 0 和1 0 0m g l 久效磷农药暴露金鱼2 1 天后，采用实时定量 r t - p c r 方法检测了下丘脑促性腺激素释放素$ c r n r n 、c g n r h i im r n a 表达水 平。结果表明：随着久效磷农药暴露浓度的升高金鱼下丘脑s g n r h 、e g n r h i i m r n a 表达水平均无显著变化。久效磷农药对金鱼神经内分泌调节的潜在影响 尚需进一步研究。 综上所述，本文从性腺性激素合成与转化、垂体g t h s 合成与分泌、下丘脑 g n r h s 调控三个层次，研究了久效磷农药对雄性、雌性金鱼下丘脑垂体性腺轴 的干扰作用。本文首次提出了久效磷农药环境雌激素作用机制，证实了久效磷与 e 2 等化合物不同，不是与雌激素受体直接结合发挥其雌激素效应，而是通过生殖 轴线的其他位点。久效磷诱导雄性金鱼合成v t g 主要通过：( 1 ) 使雄性金鱼性 腺芳香化酶的基因表达显著增强，从而提高血浆中e 2 含量；( 2 ) 影响垂体g t h s 表达与分泌，从而干扰生殖内分泌调节，间接影响性激素水平。同时，本文研究 证实了久效磷亦可对雌性金鱼生殖轴线的多个位点产生干扰作用，从而诱导血浆 e 2 水平升高并促进卵巢增重，对雌性鱼类发挥其生殖毒性。通过研究生殖轴线的 系统干扰作用，将有利于我们理解化合物如何在生物体的多个水平( 从分子效应 到表征结果) 引起系统范围内的应答效应，为农药的生态风险评价提供理论依据。 关键词：环境雌激素，久效磷，生殖轴线，芳香化酶，促性腺激素 i i 卜 a b s t r a c t m o n o c r o t o p h o s ( m c p ) i s a no r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d et h a ti sh i g h l yt o x i c ，a n d e x p o s u r et o m c p b a s e dp e s t i c i d e s s i g n i f i c a n t l y i n d u c e dt h e h e p a t i cm r n a e x p r e s s i o na n dp r o t e i ns e c r e t i o no fv i t e l l o g e n i n ( v t g ) i nm a l eg o l d f i s h , s u g g e s t i n g t h a tm c ph a ss i g n i f i c a n te s t r o g e n i cp r o p e r t i e s i ti sh y p o t h e s i z e dt h a tm c pi n d u c e s v t gp r o d u c t i o nb yi n t e r f e r i n g 谢t hh o r m o n es e c r e t i o nr e g u l a t e db yt h er e p r o d u c t i v e a x i s ( h y p o t h a l a m i c - p i t u i t a r y g o n a d a la x i s ) t ob e t t e rc h a r a c t e r i z em c pi n d u c t i o no f v t ge x p r e s s i o n , w ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fm c po ns e xs t e r o i dl e v e l s ，a n d e x a m i n e d p o t e n t i a lu n d e r l y i n g m e c h a n i s m sb y d e t e r m i n i n g t h e c h a n g e s i n e n d o c r i n e m e d i a t e d r e s p o n s e sa l o n gt h er e p r o d u c t i v ea x i s i nm a l e g o l d f i s h ， i n c l u d i n gt h ee x p r e s s i o no fp 4 5 0 a r o mi s o f o r m s ，t h es y n t h e s i sa n ds e c r e t i o no fg t h s ( g o n a d o t r o p i n s ) a n dt h er e g u l a t i o no fg n r h s ( g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n gh o r m o n e s ) f u r t h e r m o r e ，a sf e m a l er e p r o d u c t i o ni sa l s ou n d e rt h ec o n t r o lo ft h er e p r o d u c t i v e a x i s ，、) l ，i t l las i m i l a rr e g u l a t i o nm e c h a n i s m 、) l ，i t l lt h em a l e s ，t oe l u c i d a t et h ei n f l u e n c e o fm c po nr e p r o d u c t i v ea n dr e p r o d u c t i v ee n d o c r i n es y s t e m s ，t h ee f f e c t so fm c p p e s t i c i d eo nt h er e p r o d u c t i v ea x i si nt h ef e m a l eg o l d f i s hi sa l s oc o n d u c t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ： ( 1 ) p l a s m as e xs t e r o i dl e v e l sw e r ee x a m i n e db yr a d i o i m m u n o a s s a y ( r i a ) i n g o l d f i s h ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) f o l l o w i n ga21 一d a ye x p o s u r et o0 o1 o 10a n d1 0 0 m g 。l - 14 0 m c p b a s e dp e s t i c i d e i nt h em a l e s ，tb a s a ll e v e l si nt h et h ep l a s m aw e r e r e l a t i v e l yh i 曲，w h i l ee 2c o n c e n t r a t i o n si nt h ep l a s m aw e r ea se x t r e m e l yl o w ；i nt h e f e r u l e s ，e 2b a s a lc o n c e n t r a t i o n si nt h ep l a s m aw e r er e l a t i v e l yh i 曲，w h i l etl e v e l s w e r er e l a t i v e l yl o w m c pe x p o s u r er e d u c e dp l a s m al e v e l so fta n di n c r e a s e dp l a s m a c o n c e n t r a t i o n so fe 2 ，a n dt h e r ea p p e a r e dt ob ead o s e r e l a t e di n c r e a s ei nt h er a t i oo f e 2 ta f t e rm c pt r e a t m e n t 1 1 1 i sp r o v i d e dc o n v i n c i n ge v i d e n c ef o rd i s r u p t i o no fm c p o ns e xs t e r o i d ss e c r e t i o n ，b yw h i c hv t gw a si n d u c e di nm a l e sa n do v a r i a ng r o w t h w a si n c r e a s e di nf e m a l e s i i i m r n ae x p r e s s i o ni nt h eg o n a dw a su p r e g u l a t e da f t e rm c p p e s t i c i d ee x p o s u r ei na d o s e d e p e n d e n tm a n n e r h o w e v e r ，p 4 5 0 a r o m bm r n al e v e l si nt h eh y p o t h a l a m u s w e r en o tc h a n g e d b ya n yt r e a t m e n t o u rs t u d yi n d i c a t e dt h a tg o n a d a lp 4 5 0 a r o m a ，n o t b r a i np 4 5 0 a r o m b ，i st h es p e c i f i ct a r g e to fm c et h u s ，w eh y p o t h e s i z et h a tm c p t r e a t m e n te l e v a t e sg o n a d a la r o m a t a s ee x p r e s s i o na n dc a u s e st h ec o n v e r s i o no fti n t o e 2a n dt h u sc a u s e st h es i g n i f i c a n te l e v a t i o no fe 2l e v e l sa n dt h ee 2 tr a t i o ( 3 ) f s h - f la n dl h - f lm r n ae x p r e s s i o nl e v e l si np i t u i t a r yw e r ee x a m i n e db y r e a l t i m ep c ri ng o l d f i s h ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) f o l l o w i n ga2 1 一d a ye x p o s u r et o0 01 ， 0 10a n d1 0 0m g 。l 叶4 0 m c p - b a s e dp e s t i c i d e a n dw ea l s o i n v e s t i g a t e dt h e p o t e n t i a li m p a c t so fm c p t r e a t m e n to np l a s m al e v e l so fg t h sb yr i a t r e a t m e n t 、杭t h m c pr e s u l t e di ni n c r e a s e df s h - f lm r n al e v e l sa n df s hp l a s m al e v e l s ，w h i l ei t c a u s e dad e c r e a s ei nl h - f lm r n ae x p r e s s i o na n dl hp l a s m al e v e l s o n ec o u l d d e d u c et h a tt h ei n c r e a s ei nf s hs y n t h e s i sa n ds e c r e t i o nb ym c pc o u l dl e a dt ot h e s t i m u l a t i o no fe 2p r o d u c t i o n ，w h i l et h ed e c r e a s ei nl hs y n t h e s i sa n ds e c r e t i o nc o u l d l e a dt ot h ei n h i b i t i o no ft p r o d u c t i o n ，t h u se n h a n c i n gt h ei m b a l a n c eo fe s t r o g e na n d a n d r o g e nc a u s e db yi n c r e a s e dp 4 5 0 a r o m ag e n ee x p r e s s i o n t h ed a t as u g g e s t e dt h a t r e p r o d u c t i v ee n d o c r i n ef u n c t i o nw a sa l s oi m p o r t a n tt a r g e to fm c p i n t e r f e r e n c ew i t h t h er e p r o d u c t i v ea x i si n g o l d f i s h , i n d i r e c t l yi m p a c t i n gs e xs t e r o i ds y n t h e s i sa n d s e c r e t i o n ( 4 ) s g n r h 、c g n r h i im r n ae x p r e s s i o nl e v e l si nh y p o t h a l a m u sw e r ee x a m i n e d b yr e a l - t i m ep c r i ng o l d f i s h ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) f o l l o w i n ga2 1 一d a ye x p o s u r et oo 01 ， o 10a n d1 0 0m g 。l _ 14 0 m c p - b a s e dp e s t i c i d e t h em r n al e v e l so fs g n r ha n d c g n r n - i ii nt h eh y p o t h a l a m u so fg o l d f i s hw e r en o ta f f e c t e db ya n yo ft h em c p p e s t i c i d et r e a t m e n t s t h ep o t e n t i a le f f e c t so fm c pp e s t i c i d eo nn e u r o e n d o c r i n e r e g u l a t i o nn e e df u r t h e rs t u d y i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h ee n d o c r i n ed i s r u p t i o no ft h er e p r o d u c t i v ea x i sb ym c p w a si n v e s t i g a t e di nm a l ea n df e m a l eg o l d f i s hb ye v a l u a t i n gt h ep o t e n t i a li m p a c to n e 2 ，m c pd i dn o ts e e mt oe x e r ti t se s t r o g e n i ce f f e c t si ng o l d f i s hv i ae r m e d i a t e d m e c h a n i s m s ，b u tr a t h e ra to t h e rp o i n t sa l o n gt h er e p r o d u c t i v ea x i s m c pi n d u c e d v t g p r o d u c t i o ni nm a l eg o l d f i s hv i a ( a ) i n c r e a s i n gp 4 5 0 a r o m ag e n ee x p r e s s i o ni n t h eg o n a d ，l e a d i n gt ot h ei n c r e a s e de 2l e v e l si nt h ep l a s m a ；a n d ( b ) i n t e r f e r i n g 埘l g t h s8s u b u n i te x p r e s s i o na n ds e c r e t i o na tt h ep i t u i t a r yl e v e l ，r e s u l t i n gi nad i s r u p t i o n o fr e p r o d u c t i v ee n d o c r i n ec o n t r o la n da ni n d i r e c ti m p a c to ns e xs t e r o i d s t h i ss t u d y a l s op r o v i d e dc o n v i n c i n ge v i d e n c ef o rr e p r o d u c t i v et o x i c o l o g yo fm c p b yd i s r u p t i n g o ft h eh p ga x i sa tm u l t i p l es i t e si nf e m a l eg o l d f i s h ，r e s u l t i n gi ni n d u c e dp l a s m ae 2 l e v e l sa n dt h u se n h a n c e do v a r i a ng r o w t h t h r o u g hs y s t e m a t i cp e r t u r b a t i o no ft h e 1 2 4 鱼类性激素9 1 3 环境激素对鱼类生殖轴线的干扰作用及其机理研究进展1 3 1 3 1 环境激素对性激素水平的影响1 3 1 3 2 环境激素影响性激素水平的机制。1 3 1 4 研究展望l5 1 4 1 鱼类生殖轴线研究1 5 1 4 2 环境激素对鱼类内分泌干扰作用机制研究15 1 4 3 环境激素对生殖轴线影响的分子标志物开发1 5 1 5 研究目的和技术路线1 5 2 久效磷农药对金鱼性激素合成与转化的影响1 7 2 1 材料与方法1 8 2 1 1 实验药品与仪器18 2 1 2 生物材料。l9 2 1 3 实验方法2 0 2 1 4 数据分析2 5 2 2 结果与分析2 5 2 2 1 久效磷农药对雄性金鱼g s i 的影响2 5 久效磷农药对金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u $ ) 生殖轴线的影响研究 2 2 2 久效磷农药对雄性金鱼血浆性激素含量的影响2 6 2 2 3 久效磷农药对雄性金鱼芳香化酶基因表达的影响2 8 2 2 4 久效磷农药对雌性金鱼g s i 的影响2 9 2 2 5 久效磷农药对雌性金鱼血浆性激素含量的影响3 0 2 2 6 久效磷农药对雌性金鱼芳香化酶基因表达的影响3 l 2 3 讨论3 2 2 4 4 、结3 5 3 久效磷农药对金鱼g t h s 基因表达与蛋白分泌的影响。3 6 3 1 材料与方法3 6 3 1 1 实验药品、仪器、生物材料3 6 3 1 2 实验方法3 7 3 1 3 数据分析3 9 3 2 结果与分析3 9 3 2 1 久效磷农药对雄性金鱼g t h s - p 基因表达的影响3 9 3 2 2 久效磷农药对雄性金鱼血浆g t h s 水平的影响。4 l 3 2 3 久效磷农药对雌性金鱼g t h s - p 基因表达的影响4 2 3 2 4 久效磷农药对雌性金鱼血浆g t h s 水平的影响4 3 3 3 讨论4 4 3 4 小结4 5 4 久效磷农药对金鱼g n r h s 基因表达的影响4 7 4 1 材料与方法4 7 4 1 1 实验仪器、药品、生物材料4 7 4 1 2 实验方法一4 7 4 1 3 数据分析4 8 4 2 结果与分析4 8 4 2 1 久效磷农药对雄性金鱼g n r h s 基因表达的影响4 8 4 2 2 久效磷农药对雌性金鱼c , q 1 r h s 基因表达的影响5 0 4 3 讨论5 ( 1 4 4 小结51 久效磷农药对金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 生殖轴线的影响研究 5 结论与创新点。5 2 5 1 结论与展望5 l 5 2 创新点5 l 参考文献5 2 久效磷农药对金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 生殖轴线的影响研究 o 刖罱 近年来，环境激素( e n v i r o n m e n t a lh o r m o n e s ，e h s ) 对野生动物和人类的影响受 到了科学界和公众的广泛重视( a n k l e y e ta l ，1 9 9 8 ；k a v e l o c k ，1 9 9 6 ) 。研究表明，环 境激素能够干扰生物体内激素的合成、释放、运输、代谢、结合等一系列生物学 过程，从而扰乱激素正常水平和内分泌系统机能，甚至对人类及野生动物的生殖 系统发育产生有害影响( c o l b o me ta l ，1 9 9 3 ) 。其中，具有类雌激素效应的化学污 染物，即环境雌激素，因其具有显著的生殖、发育毒性而成为科学家关注的焦点。 久效磷农药是一种广泛的应用于农业和畜牧业的有机磷农药，是联合国环境 规划署优先控制污染物之一。由于久效磷农药的高毒性，发达国家已禁止使用， 但在一些发展中国家如中国和印度等仍有使用，据报道中国某水源地久效磷含量 高达0 1 6 5 “g l d ( 康跃惠等，2 0 0 0 ) ，而在巴基斯坦四大棉花密集种植区( t a r i qe ta l ， 2 0 0 4 ) 和科威特的和食物( s a w a y ae ta l ，1 9 9 9 ) 中均检测到了久效磷，且因久效磷的 高残留造成了许多污染事故，据报道久效磷与阿根廷斯温氏鹰( b u t e os w a i n s o n o 的死亡有关( g o l d s t e i ne ta l ，1 9 9 9 ) ，其危害相当严重。尤其是本课题组研究证实久 效磷农药暴露能诱导雄性金鱼v t gm r n a 的表达、蛋白合成与分泌，表明久效 磷不仅毒性较大，而且是一种潜在的环境雌激素( t i a ne ta l ，2 0 0 9 ) 。但是久效磷能 够诱导雄鱼产生v t g 的机制尚不清楚。 v t g 是雌激素应答蛋白，一般只在雌鱼体内合成。雄鱼也有v t g 基因，由 于雄鱼体内内源雌激素水平较低，不足以诱导v t g 的产生( l i me ta l ，1 9 9 1 ； s u m p t e ra n dj o b l i n g ，1 9 9 5 ；t h o r p ee ta l ，2 0 0 0 ；h e m m e re ta l ，2 0 0 2 ) 。但是鱼类生殖 轴线的多个位点均可作为外源雌激素环境内分泌干扰物的潜在靶位点，即外源 化合物可以通过多种途径对生殖轴线产生影响，从而诱导雄性金鱼合成与分泌 v t g ( a n k l e y e ta l ，2 0 0 9 ) 。鱼类下丘脑合成一种多肽g n r h ，用于调节垂体促性腺 激素。金鱼存在两种g n r h s ，分别为s g n r h 和c g n r h i i ( k i me ta l ，19 9 5 ；y ue ta l ， 1 9 8 8a n d1 9 9 8 ) ，二者均可刺激g t h s 的合成和释放( k l a u s e ne ta l ，2 0 0 1a n d2 0 0 2 ) 。 g t h s 是糖蛋白激素，包括f s h 和l h ，二者均由两个亚基组成，其中a 亚基同 源性较高，而声亚基特异性较高( h e a ma n dg o m m e ，2 0 0 0 ) 。垂体g t h 通过与性腺 中的受体结合，调控配子生成和性类固醇生成。性类固醇生成过程需要多种酶的 参与，而其中芳香化酶p 4 5 0 a r o m 所催化的反应是雌激素合成的限速步骤。 久效磷农药对金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 生殖轴线的影响研究 p 4 5 0 a r o m 是细胞色素p 4 5 0 亚家族成员，催化雄激素如t 转化为雌激素e 2 ( m i l l e r , 1 9 8 8 ；s i m p s o n e ta l ，1 9 9 4 ) 。另外，性激素可通过反馈作用影响g n r n s 和g t h s 水 平( m e l a m e de ta l ，19 9 8 ；n e t te ta l ，2 0 0 2 ) 。 目前研究表明乙烯雌酚( f o l m a re ta l ，2 0 0 2 ) 、4 - 壬基酚( f l o u r i o te ta l ，1 9 9 5 ) 、 双酚a ( l e t c h e re ta l ，2 0 0 5 ) 、0 ，p 一滴滴涕( o k o u m a s s o u ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 等公认的外源 雌激素类化学物质，能够模拟e 2 与雌激素受体直接结合并激活v t g 应答基因， 从而使雄鱼合成v t g 。但这并非是雄鱼合成v t g 的唯一机制，外源化合物还能 通过非e r 介导机制诱导雄鱼v t g 的合成与分泌( t h o m p s o ne ta l ，2 0 0 0 ；t i l t o ne t a l ，2 0 0 2 ；h u g g e t te ta l ，2 0 0 3 ) 。许多研究表明多氯联苯( k a h n e ta l ，2 0 0 1 ；k h a na n d t h o m a s ，2 0 0 0 ) 、酮康唑( v i l l e n e u v ee ta l ，2 0 0 7 aa n d2 0 0 7 b ) 、马拉硫磷及林丹( s i n g h a n ds i n g he ta l ，1 9 9 2 ) 等可以干扰生殖轴线中释放激素、促激素或性激素合成酶的 表达或和分泌，从而可能导致性激素水平失衡和v t g 合成异常。由于久效磷不 具有与雌二醇相似的结构，且c h e ne ta l ( 2 0 0 2 ) 通过体外实验证实久效磷暴露不 能使m c f 7 异常增殖，结果表明久效磷不能与雌激素受体直接结合。由此推测 久效磷对雄性金鱼v t g 的诱导作用可能是非受体介导机制，即通过升高体内内 源e 2 水平。为了阐明久效磷农药诱导雄性金鱼产生v t g 的作用机制，本文检测 了久效磷农药对雄性金鱼性激素水平的影响，并从芳香化酶p 4 5 0 a r o m 表达、g t h s 合成与分泌、g n r h s 调控等多个内分泌相关因子，探讨了久效磷农药对内源性 激素水平产生影响的原因。 而雌性鱼类生殖活动同样受到内分泌系统中生殖轴线的调节，其调节机制与 雄性鱼类类似。大量研究表明环境雌激素同样会影响卵巢的发育和功能，从而影 响雌性生殖力繁殖( f e n t r e s se ta l ，2 0 0 6 ；l i n d e r o t he ta l ，2 0 0 6 ；n a d z i a l e ke ta l ， 2 0 0 8 ) 。而且也有部分研究致力于探讨这些污染物通过生殖轴线影响雌性生殖系 统的机$ 1 j ( a n k l e ye ta l ，2 0 0 2 ，2 0 0 5 ，2 0 0 8 ) 。然而，久效磷作为一种已被确认的环境 雌激素，其对雌性鱼类生殖系统和生殖内分泌系统的干扰作用，及其对雌性生殖 可能造成的影响尚未见报道。对于雌性鱼类，在生殖轴线的调控下合成大量的雌 激素e 2 ，而e 2 是雌性生殖健康的关键因素，不同组织和不同生殖期e 2 分泌的平 衡对维持雌性正常的生殖功能至关重要。虽然我们很容易从生殖轴线角度理解外 源化合物会对雌性生殖产生影响，但是这种影响的机制相当复杂，可能涉及生殖 轴线的三个水平。例如，研究表明多氯联苯可以通过干扰大西洋石首鱼c m r h 合 2 久效磷农药对金鱼( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 生殖轴线的影响研究 成的神经传导途径，导致l h 分泌水平的下降( k a h n e ta l ，2 0 0 1 ；k h a na n dt h o m a s ， 2 0 0 0 ) 。o , p - d d t 促进大西洋石首鱼g t h s 释放，并从而导致卵巢增重( k h a na n d t h o m a s ，1 9 9 8 ) 。漂白纸浆废水暴露可通过影响l h 和性激素分泌等多个位点造成 雌性白亚口鱼生殖损伤( v a nd e rk r a a ke ta l ，1 9 9 2 ) 。由此可见，雌性生殖轴线的多 个位点均可作为外源化合物的潜在靶位点，即外源化合物可以通过多种途径对雌 性生殖轴线产生影响，从而影响雌性生殖健康。为了确定久效磷农药对雌性鱼类 生殖的影响，本文检测了久效磷农药对雌性金鱼性激素水平的影响，并以芳香化 酶p 4 5 0 a r o m 表达、g t h s 合成与分泌、g n r h s 调控等多个生殖轴线上内分泌相 关因子为指标探讨了其影响机制。 本文以久效磷为代表，研究与雌激素受体无亲和性有机磷农药在多个水平上 对鱼类生殖轴线的内分泌干扰作用，将为有机磷农药的环境雌激素作用、生殖毒 性作用机制提供理论基础，并为环境雌激素的生物标志物筛选及生态风险评价提 供科学依据。 久效磷农药对金囱_ ( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 生殖轴线的影响研究 l 环境激素对鱼类生殖轴线的干扰作用及其机制研究进展 1 1 环境激素的定义、种类和特征 1 1 1 环境激素定义 近年来的研究表明，许多环境化学污染物具有类似激素的作用，能够干扰动 物体内激素的合成、释放、运输、代谢、结合等一系列生物过程，从而扰乱内分 泌系统、神经系统和免疫系统的机能( r a l o f f ，1 9 9 4 ；s t o n e ，1 9 9 4 ) ，甚至危害生物 后代生殖功能( m e a c a l f ee ta l ，2 0 0 0 ) ，这些物质被称为环境激素( e n v i r o n m e n t a l h o r m o n e s ，e h s ) ，又称内分泌干扰化学物质( e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t i o n c h e m i c a l s ，e d c s ) ( k a v e l o c ke ta l ，1 9 9 6 ) 。环境激素包括天然存在的和人工合成的 一些化合物，其对内分泌的干扰作用主要表现为类抗雌激素、类抗雄激素以及 类抗甲状腺素活性，其中雌激素样作用是最主要的( k a v l o c ke ta l 。1 9 9 9 ) 。 1 1 2 环境激素种类 具有类雌激素效应的化学污染物是当前世界最受重视的问题，这类物质种类 繁多、使用范围广，是造成环境激素污染严重化、扩大化的根源。世界各国通过 建立的筛选制度和大量研究，已经初步确定了具有雌激素效应的化学物质名单， 还有大量怀疑具有雌激素效应的化学物质正待进行研究筛选。具有和可能具有环 境激素效应的化学物质包括农药类、双酚a 类( b i s p h e n o la ，b p a ) 、烷基苯酚类 ( a l k y l p h e n o l i cc o m p o u n d s ) 、溴化防火剂( b r o m i n a t e df l a m er e t a r d a n t s ) 、尼泊金类 ( p a r a b e n s ) 、邻苯二甲酸盐类( p h t h a l a t e s ) 、多氯联苯类( p c b s ) 、二噫英( d i o x i n s ) 和 金属类。到目前为止，列入环境激素名单的化学物质巳经达到1 0 0 多种。 环境激素可分为环境中的内源性激素和人工合成的外源激素化学物质。 ( 1 ) 环境中的内源性激素是指天然的动植物激素。 天然动物雌激素为甾体类化合物，存在于动物和人体内，一般指e 2 、雌三 醇( e s t r i 0 1 ) 和雌酮( o e s t r o n e ) ，其中雌二醇的作用最强。 植物雌激素( p h y t o e s t r o g e n s ) 是一组在植物中天然存在、本身或其代谢产物具 有与雌激素受体结合诱导产生弱雌激素作用的杂环多酚类化合物的植物化学物。 其结构与e 2 相似，可以与e 2 竞争性结合雌激素受体，表现出雌激素拮抗作用， 主要包括异黄酮( i s o f l a v o n e ) 、木酚素( 1 i g n a n ) 和香豆雌酚( c o u m e s t r 0 1 ) - - - 类。目前己 知至少有4 0 0 多种植物含有具有生物活性的植物雌激素物质。 4 久效