（微生物学专业论文）治泽红假单胞菌cqu01ahl合成酶基因的鉴定、表达及对phb积累的影响.pdf

目 f 幽j!|f!f舢jj|jjf|ffff舢jjjjj|舢 l y 18 817 r | l l l i 3 r l l | i 芝 摘要i a b s l r a c t 。i i i l 文献综述。l 1 1 细菌中的群体感应系统1 1 2 光合细菌及其群体感应系统7 1 3 群体感应信号分子的检测方法8 2 弓i 言1 0 3 沼泽红假单胞菌生理研究1 1 3 1 材料与方法。11 3 2 结果与讨论1 3 3 3 本章小结1 6 4 沼泽红假单胞菌c q u 0 1a h l 合成酶基因的克隆、表达及检测1 8 4 1 实验材料和方法1 8 4 2 结果与讨论2 3 4 3 本章小结。2 5 5 自体诱导物a h l 对p h b 积累的影响2 6 5 1 材料与方法2 6 5 2 结果与讨论_ 2 7 5 3 本章小结：3 0 6 结论与展望3l 6 1 结论3l 6 2 本文创新之处。31 6 3 展望3l 参考文献3 2 致谢3 6 在读期间参加的科研课题和发表的相关论文3 7 西南大学硕士学位论文摘要 微生物学专业硕士研究生：陈宇 指导老师：叶姜瑜副教授 因的 捅要 群体感应( q u o r u m - s e n s i n g ，简称q s ) 系统是指细菌通过一种自体诱导物 ( a u t o i n d u c e r ，舢) 的信号分子的产生、分泌和响应，感知周围细菌密度的变化， 从而调控基因的表达。g _ 细菌的群体感应信号分子多为酰基高丝氨酸内酯衍生 物a h l ；g + 细菌的群体感应信号分子通常是寡肽类；另外还有一类信号分子被 认为是细菌种间“通用的信号分子，即呋喃酰硼酸二脂a i 2 。 沼泽红假单胞菌( r h o d o p s e u d a n o n a s p a l u s t r i s ) 是光合细菌的一种，属于 革兰氏阴性细菌。在光合细菌之一的类球红细菌中发现存在群体感应系统，而且 群体感应系统还调控菌体内聚- f j 一羟丁酸( p o l y - 1 3 - h y d r o x y b u t y r i ca c i d ，简称p h b ) 的积累和光合产氢。沼泽红假单胞菌也积累p h b 和光合产氢，有文献报道在沼泽 红假单胞茵内发现a h l 类信号分子的存在，但是群体感应系统是否对p h b 积累 有调控作用还未可知。 比色法和报告菌株a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sj z a l k y c 5 5 ( p j z 3 7 2 ) ( p j z 3 8 4 ) ( p j z 4 1 0 ) 对沼泽红假单胞菌c q u 0 1 产生自体诱导物a h l 的能力做了检测，比色 法结果显示沼泽红假单胞菌c q u 0 1 的a h l 提取液通过颜色反应，变成咖啡色， 说明沼泽红假单胞菌c q u 0 1 产生自体诱导物a h l ；但是其上清液不能使报告菌 株j z a l 显蓝色，说明产生的信号分子超出了j z a l 的检测范围，其酰胺链上的碳 原子数可能大于1 4 或者含有双键。 根据n c b i 公布的5 株沼泽红假单胞菌的基因序列，通过同源性比对，设计 了一对特异性引物。以沼泽红假单胞茵c q u 0 1 的基因组d n a 为模板，p c r 扩增 出6 5 0 b p 左右的d n a 片段，测序比对发现此片段为自诱导物a h l 合成酶基因 r p a l 。将扩增的d n a 片段连接到p e t - 2 8 a ( + ) ，转化至大肠杆菌d h 5 a 中；蓝白 斑筛选，诱导表达，检测到d h 5 a 菌液中有a h l 产生。说明以沼泽红假单胞菌 西南大学硕士学位论文摘要 c q u 0 1 为模板扩增到得d n a 片段为灿 l 合成酶基匝并且将该基因在大肠杆 菌d h 5 a 中克隆表达，得到a h l 信号分子。 利用乙酸乙酯萃取a h l ，在接种沼泽红假单胞菌c q u 0 1 和沼泽红假单胞菌 肋6 c 缺陷菌株的培养基中添加不同浓度的a h l 萃取液，通过测定沼泽红假单胞 菌c q u 0 1 和沼泽红假单胞茵p h b c 缺陷菌株的p h b 含量，发现厌氧生长时沼泽 红假单胞菌c q u 0 1 的p h b 积累减少；而沼泽红假单胞菌p h b c 缺陷菌株的p i - i b 积累几乎没有变化。说明a h l 可以抑制p h b 积累；并且抑制作用很可能发生于 p 册合酶途径。 关键词：沼泽红假单胞菌：群体感应：自体诱导物? p h b i i 西南大学硕士学位论文a b s t r a c t t h ea u t o i n d u c e rs y n t h s i sg e n ei d e n t i f i c a t i o n ，e x p r e s s i o na n d p h ba c c u m u l a t i o ni nr h o d o p s e u d a n o n a s p a l u s t r i s m a jo r ：m i c r o b i o l o g y d i r e c t i o n ：m i c r o b i a lm o l e c u l a re c o l o g y s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o ry ej i a n g y u m a s t e r c a n d i d a t e ：c h e ny u a b s t r a c t q u o r u ms e n s i n g ( q u o r u m - s e n s i n g ，q s ) s y s t e mi st h e b a c t e r i ac o n t r o lg e n e e x p r e s s i o n o n ac o m m u n i t y - w i d es c a l eb yp r o d u c i n g ，s e c r e t i n g ，d e t e c t i n ga n d r e s p o n d i n gt oe x t r a c e l l u l a rs i g n a l i n gm o l e c u l e s ( a u t o i n d u c e r s ) t h a ta c c u m u l a t ei nt h e e n v i r o n m e n to np r o p o r t i o nt oc e l ld e n s i t y q u o r u ms e n s i n gc o n t r o l l e db c h a v i r o r s g r a m n e g a t i v eb a c t e r i am o s t l yu s ea c y l a t e dh o m o s e r i n el a c t o n e s ( a h l s ) 勰q u o r u m s e n s i n gs i g n a lm o l e c u l e g r a m p o s i t i v eb a c t e r i au s eo l i g o p e p t i d e sa sa u t o i n d u c e r s s o m eb a c t e r i a sp r o d u c e ra n dd e t e c tas e c o n da u t o i n d u c e r , a i 一2 t h i sa u t o i n d u c e ri s p r o d u c e db yar e m a r k a b l yw i d ev a r i e t yo fg r a m n e g a t i v ea n dg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i a , s o m ef i n d i n g sh a v el e dt ot h ep r o p o s a lt h a ta i - 2i sa u n i v e r s a l s i g n a l ，w h i c h f u n c t i o n si ni n t e r s p e c i e sc e l l t o c e l lc o m m u n i c a t i o n r h o d o p s e u d a n o n a sp a l u s t r i si sag r a m n e g a t i v eb a c t e r i a , o n eo fm e m b e ro f p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a q u o r u ms e n s i n gs y s t e m w a sf o u n di nr h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e st h a t i so n eo ft h es p h e r i c a lr e dp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a , a n dq u o r u m s e n s i n gs y s t e m c o n t r o l p o l y p h y d r o x y b u t y r i ca c i d ( p u s ) a c c u m u l a t i o n a n d p h o t o s y n t h e t i ch y d r o g e np r o d u c t i o n r h o d o p s e u d a n o n a sp a l u s t r i s a l s oa c c u m u l a t e d p h ba n dp r o d u c eh y d r o g e ni nt h el i g h to fh e t e r o t r o p h o ca n a e r o b i cc o n d i t i o n b u t w h e t h e rt h e r ei sq u o r u ms e n s i n gs y s t e ma n dr e g u l a t i n ga c c u m u l a t i o no fp h bh a sa l s o b e e nr e p o r t e d t h ea u t o i n d u c e rw e r ed e t e c t e d b yc o l o r i m e t r y a n dt h e r e p o r t e r s t r a i n a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n sj z a l t k y c s 5 ( p j z 3 7 2 ) ( p j z 3 8 4 ) ( p j z 4 1 0 ) 】i n r h o d o p s e u d a n o n a sp a l u s t r i sc q u 0 1 i tf o u n d e dt h a tt h es o l u t i o nt u m d eb r o w n c l a r i f y r p a l u s t r i sc q u o lc a n s y n t h e s i z i n ga h l l 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t d e s i g n e do fap a i ro fs p e c i f i cp r i m e r sa c c o r d i n gt on c b ip u b l i s h e df i v e r h o d o p s e u d a n o n a sp a l u s t r i sg e n o m es e q u e n c eh o m o l o g yc o m p a r i s o n 、i n l t h e g e n o m i cd n a o fr h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sc q u 0 1a st e m p l a t e ，p c ra m p l i f i e d d n af r a g m e n t so fa b o u t6 5 0 b p ，s e q u e n c ec o m p a r i s o nf o u n dt h a tt h ef r a g m e n tf r o m t h ea h ls y n t h a s eg e n er p a i ，n l ea m p l i f i e dd _ n af r a g m e n tw a sc l o n e dt oe c o l i d h 5 a ，b l u e - w h i t es c r e e n i n g ，i n d u c e de x p r e s s i o n ，d e t e c t e di nd h 5 at h a tt h eb a c t e r i u m p r o d u c e s a i 1 a h le x t r a c t e dw i t he t h y la c e t a t a r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sc q u ola n d r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s 肋6 c w e r ec u l t u r eb yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o f e x t r a c ta h l ，a n dt h e nm e a s u r i n gc o n t e n to ft hp h b i tf o u n dt h a tt h ej 6 m lc a l li n h i b i t p h ba c c u m u l a t i o nw h e na n a e r o b i cg r o w t ho fr h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sc q u o1 b u tt h ec o n t e n to fp h ba l m o s th a v en oc h a n g e n o t et h a ta h l m a yb ei n h i b i tp h b s y n t h a s ea n dt h e ni n h i b i tp h ba c c u m u l a t i o n k e y w o r d s ：r h o d o p s e u d a n o n a sp a l u s t r i s ；q u o r u m - s e n s i n g ；a u t o i n d u c e r ；p h b i v 西南大学硕士学位论文1 文献综述。 r 1 文献综述 1 1 细菌中的群体感应系统 长期以来人们认为细菌的生长发育是个体行为，细菌彼此之间没有信息交流、 分工合作等一系列的生命活动。1 9 7 0 年，n e a l s o n 首次在海洋发光细菌费氏弧菌 ( y i b r i o 扮幽p r d 中发现了群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，简称q s ) 现象【1 1 ，不过也只是 认为这是在少数细菌中才存在的特殊现象，如费氏弧菌和哈维氏菌【2 】( f i b r i o h a r v e y i ) 的生物发光系统，链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p p ) 的抗生素合成【3 】及根癌农杆 菌中t i 质粒融合转移【4 】系统等。近年来的研究表明越来越多的细菌中存在群体感 应系统，即随着细菌密度的增加，会积累化学信号分子( 自体诱导物，a u t o i n d u c e r ) ， 该信号分子可以帮助监控周围的细菌密度变化，从而启动或抑制某些功能基因的 表达，引发特异、多样的细胞行为。细菌种内及种间的信息交流对细菌的生长与 环境间的相互作用十分重要。 目前已知的细菌群体感应系统能够调控细菌的多种生理生化功能如根瘤菌与 植物共生【5 l 、生物发光f 6 】、细菌毒性【7 1 、接合转移、色素形成【引、生成孢子、芽孢 杆菌中感受态与芽孢的形成、生物膜的形成1 9 、抗生素产生和细菌运动等等。 群体感应系统使整个细菌群体步调一致，赋予了细菌一些多细胞生物的特性，对 细菌的生命活动具有重要意义【1 1 1 。目前对细菌群体感应系统的研究已经成为微生 物学的一大研究热点。 不同细菌的群体感应系统能利用不同的信号分子，表达调控不同的生物功能。 根据化学种类的不同，可以将群体感应信号分子分为三大类。革兰氏阴性细菌的 信号分子为酰基高丝氨酸内酯类( a c y l - h o m o s e r i n el a c t o n e ，简称a h l ) ；革兰氏阳 性细菌的信号分子为寡肽类【1 2 ，1 3 ( o l i g o p e p t i d e ) ；另外还有一类在革兰氏阴性菌和 革兰氏阳性菌中均存在的信号分子为呋喃酰硼酸二酯( f u r a n o s y lb o r a t ed i e s t e r ，简 称a i 2 ) 1 1 4 , 1 5 1 。与前两种信号分子不同的是，一般认为a i 2 是细菌种间交流的通 用信号分子l l 引。 对群体感应系统的研究目前已经深入到分子生物学领域，通过对信号分子合 成酶基因的克隆、表达或敲除，研究可能存在的基因调节机制【 】。人们希望可以 通过针对群体感应系统进行干扰和促进，从而达到有益于人类的目的。如在医药 卫生行业，许多致病菌分泌的毒力因子都通过群体感应系统调节，抑制信号分子 的生物合成，筛选降解信号分子的酶类，成为新药研发的新思路【1 眈2 】；在发光细 菌中，促使信号分子产生可以提前使发光达到稳定期利于检测水质毒性；也有通 过分子生物学手段构建基因工程检测菌株，如信号分子的检测菌株、专一性水质 西南大学硕士学位论文1 文献综述 毒性的工程菌株等。 1 1 1 革兰氏阴性菌的群体感应系统 在已发现的革兰氏阴性菌中除了夏威夷弧菌和黄色粘球菌，群体感应的调控 模式与费氏弧菌类似，都是l u x i l u x r 调控模式，主要由信号分子a h l 、l u x i 类蛋白及受体蛋白l u x r 构成。l u x i 类蛋白为自体诱导物刽札合成酶，a h l 是 以s - 腺苷甲硫氨酸( s a m ) 和酰基一酰基载体蛋f l ( a c y a c y c a r r i e rp r o t e i n ，简称a c p ) 为底物在l u x i 蛋白酶的催化下合成的，由一个稳定的高丝氨酸内酯( h s l ) 头部和 一个可变的酰基链( a y s l s i d ec h a i n ) 尾部相连，有的细菌体内只产生一种a h l 分子， 有的可以产生几种不同的a h l 分子。a h l 分子的区别主要是：第3 位碳原子上 取代基不同( 有氢、羟基和羰基) ；酰胺链中的碳原子数不同( 从4 到1 8 2 3 】个，多为 偶数，奇数只有7 ) ；有个别a h l 分子的酰胺侧链上含有双键( 如类球红菌) 。a h l 信号分子的不同决定了该类信号分子对细菌不同的调控功能【2 4 】。 a h l 信号分子可以通过细胞膜并在环境中积累，当细菌密度达到一定阈值， a h l 进入细胞内与相应的受体蛋白l u x r 结合，使之构象发生改变，结合于靶基 因启动子区域，从而调控某些功能基因的表达。一种细菌可以产生几种不同结构 的a h l s 分子，而不同种的细菌也可以产生同种结构的信号分子【2 5 1 。同种细菌中 也可能存在多个a h l 合成酶，在费氏弧菌中首先发现的是l u x l 基因，还发现了 a i n s 蛋白也可以催化合成a h l 分子，而且l u x 和a i n s 基因不同源。为什么有些 细菌体内可以存在多个a h l 合成酶系统，还不清楚。 图1 1 为费氏弧菌( v i b r i o f i s c h e r i ) l u x i i l u x r 调控生物发光的模式图。 l _ 脚c e i ld e n s i t y n i g h ( ：e l ld e n s i t y 图1 1 费氏弧菌的群体感应系统调节模式 f i g 1 一lm o d e lf o rq u o r u ms e n s i n gi nv f i s c h e r i 2 西南大学硕士学位论文 1 文献综述 当环境中v i b r i of i s c h e r i 密度较低时，l u x l 、l u x r 仅有少量表达；随着细菌密 度的增大，3 - o x o - c 6 h s l 积累，当达到一定阈值浓度时，3 - o x o - c 6 - h s l 与l u x r 蛋 白结合形成复合物，l u x r 蛋白构象发生改变，能够识别l u xb o x 区域，从而启动 发光基因l u x c d a b e 大量表达。荧光酶基因l u x b 的大量表达，使细菌产生可见荧 光。 二 目前研究比较多的革兰氏阴性菌的群体感应系统主要有以下几种( 表 卜1 ) 。 表1 1 具有费氏弧菌l u x i l u x r 同族基因的细菌及其对应的信号分子 t a b l e1 - 1o r g a n i s m s w i t h h o m o l o g u e s o f t h e l u x l a n d l u x r g e n e s f r o mv i b r i o f i s c h e r i a n d t h e c o r r e s p o n d i n gm o l e c u l es i g n a l s 3 西南大学硕士学位论文l 文献综述 p s e u d o m o n m a u r e o a e i e n s p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s p s e u d o m o n a ss y r i n g a e p v t a b a c i r a l s t o n i as o l a n e a r u m r h i z o b i u me t l i r h i z o b i u m l e g u m i n o s a r u m r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s , r r a t i al i q u e f a c i e n s i 准b r i oa n g u i l l a r u m h b r i o f i s c h e r i x e n o r h a b d u s n e m a t o p h i l u s y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a y e r s i n i a p e s t i s y e r s i n i a p s e u d o t u b e r c u l o s i s r h l r , r h l i c 4 - h s l v s m r , v s m l p h z r , p h z l p h z p h z l p s y p s y l s o l l ks o l i r a i r , r a i l r h i r c e r r , c e r i s w r r , s w r l v a n r , v a n i l u x r , l u x l y e n r , y e n l y p e r , y p e l y p s r , y p s l y t b r , y t b l y u k r , y u l d c 8 h s l ? 3 - h y d r o x y - 7 - c i s - c 1 4 - h s l 7 c i s - c 1 4 - h s l c 4 h s l 3 - o x o - c 1 0 一h s l 3 - o x o - c 6 h s l 3 - h y d r o x y - c 4 - h s lo ra l l a g o r d s t c 6 _ h s l ? 3 - o x o - c 6 - h s l c 8 h s l 外毒素，氰化物，r p o s ， 凝集素，绿脓菌素，鼠李唐 脂，4 - p i l i 吩嗪抗生素 吩嗪抗生素 ? ? 限制结瘤数 结瘤，细菌素，稳定期生存 疏散细菌聚集 群集，蛋白酶 ? 生物发光 毒素，脂肪酶 ? 运动性，聚集 1 1 2 革兰氏阳性菌中的群体感应系统 革兰氏阳性菌的群体感应系统与革兰氏阴性细菌不同的是，革兰氏阳性细菌 产生的信号分子是经过修饰后的寡肽。寡肽类信号分子需要先在细胞质中由前导 肽切割、加工后才能形成有活性的、稳定的自诱导物寡肽【2 6 1 。不同的细菌寡肽类 信号分子的差异很大，主要表现在氨基酸组成及氨基酸残基的多少，大多数在5 1 7 之间。寡肽类信号分子跟a h l s 类信号分子不同的是它们不能自由穿透细胞膜， 而是通过a b c 转运系统( a t p - b i n d i n g - c a s s e t t e ) 或者其他膜通道蛋白分泌到细胞 外1 27 1 。当细菌达到一定密度时，寡肽与细胞膜上的组氨酸激酶感受器相结合，使 其保守的组氨酸残基( h ) 自磷酸化；经过天冬氨酸残基( d ) 的传递，最终把磷酸基 4 lsm ? ? 6c 增加，抑制阻碍菌体形成芽孢的磷酸化酶，使细菌向芽孢方向发展【2 引。 几种由寡肽介导的群体效应如表1 2 所示。 表1 2 几种由寡肽介导的群体感应系统 t a b l e1 - 2s e v e r a lk i n d so f q u o r u m - s e n s i n gs y s t e mm e d i a t e db yo l i g o p e p t i d e 1 1 3 种间的群体感应系统 g _ 细菌的a h l s 和g + 细菌的寡肽类信号分子都具有细菌特异性。除了上述 两种信号分子外，还有一类a i 2 型信号分子，无论在革兰氏阴性细菌还是革兰氏 阳性细菌中均为呋喃酰硼酸二酯，它是一种细菌非特异性信号分子。细菌可以利 用信号分子触2 感知周围其他细菌数量来调节自身的生物行为。舭2 是b a s s l e r 等研究哈维氏菌( 加w 秒d 的群体感应系统时发现的【2 9 】。该菌群体感应系统既能 识别信号分子a h l s 也能识别信号分子灿2 ，识别信号分子a h l s 可以感知自身 细胞密度，识别m 2 可以感知自身或周围其它细菌的数量。群体感应调控模式如 图1 2 ，a h l 和越2 共同调节哈维氏菌的生物发光调控系统。 5 西南大学硕士学位论文1 文献综述 i 低细胞密度 矿 l u x o 激活 i + 黼 l 一 二譬鲨；耸 高绷胞密度 l 失u x 活o i 箭韶泸 ! 一 。：叠甾冷 i 警0 苗笛苗l 图l - 2 哈维氏菌的群体感应系统 f i g 1 - 2q u o r u m - s e n s i n gs y s t e mo fkh a r v e y i 研究发现变异链球菌( s t r e p t o c o c c u s 册甜，口，翁) g s 5 中存在触2 合成酶基因l u x s ， l u x s 基因突变可以减弱蔗糖依赖性生物膜的形成；但是如果环境中有能够产生信 号分子舢2 的细菌存在，该菌又可以形成蔗糖依赖性生物膜。变异链球菌g s 5 通 过信号分子址2 察觉周围其它细菌的存在来调节自身的生物行为。 细菌识别信号分子m 2 的方式与革兰氏阳性细菌中双组分激酶的识别系统一 致。即m 2 型信号分子被双组分激酶识别，然后使给受体蛋白磷酸化，启动相关 基因的表达。人们利用信号分子越2 的报告菌株哈维氏菌b b l 7 0 陆续在4 0 多种细 菌中检测到了该分子的存在，但是对于触2 的结构还不是很清楚。2 0 0 2 年c h e n 等 发现舢2 型信号分子是上下对称双五圆环结构的呋喃酮酰硼酸二酯【3 0 】。l u x s 基因 被认为是合成信号分子a i 2 的标志性基因，约为4 5 0 , - - - 5 5 0 碱基对组成，麟因 在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中都比较保守。触2 合成起始底物与合成信号分子 a h l s 的底物一样也是腺苷甲硫氨酸( s a m ) ，经过一系列的中间反应，由雠因 编码的蛋白酶催化形成信号分子越2 的前体，最后形成呋喃酰硼酸二酯。 不同细菌中信号分子灿- 2 调控的基因和功能不同，在大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 中 调控毒性基因的表达；在格式链球菌中调控共生生物膜的形成；在发光杆菌属中 调控抗生素的产生。陆续在其它细菌中发现似2 的功能，见表1 3 。 6 西南大学硕士学位论文l 文献综述 表1 - 3 信号分子趾2 调控的基因和功能p 1 】 t a b l e1 - 3g e n e sa n df u n c t i o n sc o n t r o l l e db ya i 2 1 2 光合细菌及其群体感应系统 光合细菌( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ，简称p s b ) 是具有原始光能合成体系的原核 生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称。光合细菌在光照缺氧 的环境中能进行光合作用，与绿色植物不同的是，它们的光合作用是不放氧的。 光合细菌细胞内只有一个光系统，即p s i ，光合作用的原始供氢体不是水，而是 h 2 s ( 或一些有机物) 。光合细菌在自身的同化代谢过程中，完成了产氢、固氮、分 解有机物三个自然界物质循环中极为重要的化学过程。这些独特的生理特性使它 们在生态系统中的地位显得极为重要。t m p e r 等将光合细菌分为1 目( 红螺菌目， r h o d o s p i r i l l a l e s ) ，四科( 红螺菌科，r h o d o s p i r i l l a c e a e ；着色菌科，c h r o m a t i a c e a e ； 绿菌科，c h l o r o b i a c e a e ；绿丝菌科，c h l o r o f l e x a c e a e ) 。依据伯杰细菌鉴定手册 ( 第9 版) 将光合细菌分为6 个类群，着色菌科、外硫红螺菌科、红色非硫细菌、 绿硫细菌、多细胞绿丝菌、盐杆菌，共2 7 个属 3 2 】。革兰氏阴性，不能形成芽孢， 7 光合细菌细胞内积累代谢产物聚- 争羟丁酸( p o l y 一1 3 - b y d r o x y b u t y r i ca c i d ，简称p h i ) 。 p h b 的生成的机理与产氢类似，即消耗过剩的还原力和能量。 沼泽红假单胞菌属于紫色非硫细菌，红螺菌科，光合细菌的成员，菌体内积 累p h b 。p h b 作为一种天然高分子聚合物，具有生物相容性、无刺激性、可降解 性、无免疫原性和组织相容性等性能。在组织工程、药物缓释系统、骨科以及医 用手术缝合线等领域应用广泛。p h b 有良好的生物降解性，其分解产物可以全部 被生物利用，不污染环境；其熔融温度为1 7 5 1 8 0 ，是一种可完全分解的热塑 性塑料。目前主要应用于医疗、工业、包装和农业等领域。 类球红细菌也是紫色非硫细菌，红螺菌科，光合细菌的主要成员之一。该菌 是革兰氏阴性细菌，能够合成a h l 类信号分子网。类球红细菌中a h l 合成酶基 因c e r i 是l u x i 的同系物，产生7 ，8 - c i s - n ( t e t r a d e c e n o y l ) h o m o s e d n el a c t o n e 信号分 子，被称为c e r 群体感应系统【3 4 】。群体感应系统对p h b 积累和产氢等一系列的生 理行为进行调控和影响。有人研究了紫色非硫细菌p h b 积累与产氢关系1 3 5 】，试 验中构建了p h b 合酶基因( p h b c ) 的缺失突变株，在温度、光照强度和碳源等影响 产氢多种因素一致的条件下，比较该突变株与对照株的产氢量，结果发现突变株 的产氢量高于对照株。 有文献报道沼泽红假单胞菌中存在群体感应调控蛋白r p a r 和信号分子 p c h s l ( c 1 3 h 1 3 n 0 4 ) 1 3 6 】。但是沼泽红假单胞菌群体感应系统的功能相关报道很少， 所以研究其群体感应系统，特别是群体感应系统对p h b 积累的影响，对p h b 的 生物生产有重要意义。 ， 1 3 群体感应信号分子的检测方法 群体感应现象在细菌中普遍存在，群体感应系统调控细菌生理行为的研究也 越来越多。研究群体感应系统最为重要的就是信号分子的检测方法，因为它是细 菌是否存在群体感应现象的关键因素。检测方法一般有物理学方法、化学方法和 生物学方法。 、 1 3 1 报告菌株法 有些细菌能够产生可见荧光、生成色素，或者其他容易观察的表象特征，且 8 西南大学硕士学位论文 1 文献综述 这些生理活动受群体感应系统的调控，将这些细菌的自体诱导物合成酶基因敲除， 即可制成生物感应器。当环境中没有外源自体诱导物时，生物感应器不表现某种 生理活动，当有外源的自体诱导物存在，且浓度达到一定的阈值时，生物感应器 恢复此种生理活动。不同的自体诱导物合成酶可以构建不同的生物感应器。 s w i f t 等人构建了缺乏l u x i 功能区域的重组质粒p s b 3 1 5 ，携带p s b 3 1 5 质粒 的e c o l i ，在有外源的自诱导物存在且以长链的饱和醛作为底物时，表现出发光 现象【37 1 。此类检测菌株可以检测大多数的3 - o x o 类和a l k a n o y l 类信号分子，但不 能检测n - b u t a n o y lh o m o s e r i n el a c t o n e 或第三个c 上取代基为羟基的分子【3 8 1 。 紫色杆菌c v 0 2 6 3 9 1 是a h l 合成酶缺陷菌株，不能产生紫色杆菌素，在有外 源a h l s 存在时，可以迅速恢复产生色素的能力。c v 0 2 6 对c 6 a h l 最敏感，还 可以检测c 6 - 3 o x o - a h l ，c s a h l ，c s 3 o x o - a h l 和c 4 a h l ：不能检测 c 4 - 3 o x o - a h l 和酰基侧链长于1 0 个碳原子的a h l s ，也不能检测3 羟基a h l s 。 后来，人们又构建了铜绿假单胞菌的l a s f rq s 系统的生物传感器，根癌农 杆菌n t i ( p z l r 4 ) ，荧光假单胞茵2 7 9 等报告菌株。其中z h u l 4 0 】等将3 个相容质 粒p j z 3 8 4 、p j z 4 1 0 和p j z 3 7 2 导入t i 缺失的农杆菌k y c 5 5 ，该报告菌株可以检 测a h l s 的种类很多，而且检测极限很低。 1 3 2 色谱法 通过高效液相色谱一串联质谱( h p l c m s m s ) 法【4 1 】可以同时检测多种自体 诱导物a h l s ，此法适用于多种a h l s 信号分子的定性和定量分析。根据a h l s 的分子质量具有1 7 2 + 1 4 n 的规律，可以用h p l c m s 法【4 2 】直接对细菌发酵液中的 a h l s 进行分析，方法简单、高效，检测的灵敏度大，为从复杂混合物中鉴定a h l s 提供了有效手段。 结合c 1 8 反向薄层层析( t l c ) 和生物感应器法也可以检测a h l s l 4 3 1 。首先将 a h l 标准样品和待测样品一起做反向薄层层析，层析结束后在上面平铺一层含有 报告菌株的水琼脂培养物，恒温培育十几个小时后，检测是否出现相应的信号变 化；并且与信号分子标准品相比，判断待测样品中信号分子的存在及其类型m 】。 此方法将化学检测法、生物感应器检测方法和物理方法有机、恰当的结合起来。 研究细菌的群体感应系统除了信号分子的检测方法外，还需要运用分子生物 学的方法对群体感应相关基因的鉴定，分析其调控功能。研究方法一般包括基因 的克隆表达、基因敲除技术、蛋白质组表达分析和代谢谱系分析等。 9 西南大学硕士学位论文 2 引言 2引言 人们对群体感应的研究还处于起步阶段，很多细菌群体感应的具体调控机制 还没有完全搞清楚。目前对群体感应系统的研究已有了一些初步成果，可以在已 有研究的基础上，探索光合细菌群体感应系统的调节机制，进一步拓宽群体感应 系统的研究范围。 沼泽红假单胞菌是一类紫色非硫细菌，属红螺菌科，光合细菌的主要成员之 一，在生长过程中积累p h b 。类球红细菌中p h b 代谢途径中的一些中间产物是 合成脂肪酸的前体物质，脂肪酸又可以合成群体感应信号分子a h l s 。因此检测 沼泽红假单胞菌是否产生自体诱导物a h l $ 可以推测其群体感应系统类型。根据 n c b i 公布的5 株沼泽红假单胞菌的基因组序列，设计一对特异性引物，在本土 菌株沼泽红假单胞菌c q u 0 1 中p c r 扩增出自体诱导物合成酶基因。将自体诱导 物基因在原核表达载体中异源表达，然后通过在沼泽红假单胞菌c q u 0 1 和沼泽 红假单胞菌砷6 c 缺陷菌株培养基中加入不同浓度的a h l s 信号分子测定细菌的 p h b 含量变化及p h b 合酶活性高低，进而分析自体诱导物与菌体p h b 积累的关 系，希望用于沼泽红假单胞菌群体感应调控系统和p h b 积累机制研究。本课题以 国家重大水专项( 2 0 0 8 z x 0 7 3 1 5 0 0 3 0 2 ) 和国家自然科学基金重点课题( 9 0 5 1 0 0 2 0 ) 为依托。 l o 西南大学硕士学位论文 3 沼泽红假单胞菌c q u 0 1 生理研究 量曼曼詈量置i _ , l i 皇曼曼曼曼鼍曼量量曼皇曼量曼鲁鼍邕 3 沼泽红假单胞菌生理研究 沼泽红假单胞菌( r h o d o p s e u d a n o n a s p a l u s t r i s ) 是光合细菌的一种，属于红假单 胞菌属( r h o d o p s e u d o m o n a s ) ，红螺菌科( r h o d o s p i r i l l a c e a e ) ，红螺菌目 ( r h o d o s p i r i l l a l e s ) ，其基本的生理生化特性见伯杰氏细菌鉴定手册 沼泽红假单胞菌c q u o l 于重庆大学民主湖湖底淤泥中分离得到；沼泽红假 单胞菌p h b c 缺陷菌株是以沼泽红假单胞菌c q u 0 1 作为出发菌株，通过同源重 组方法获得的肋6 c 缺陷菌株。肋6 c 为p i - i b 合酶基因，是合成p i - i b 的关键基因。 本章测定了沼泽红假单胞菌c q u 0 1 的生长曲线；通过染色技术观察菌体内 含物p h b ；利用紫外分光光度计测定沼泽红假单胞菌c q u 0 1 和沼泽红假单胞菌 加6 c 缺陷菌株的p h b 含量；比色法和生物显影法检测菌体是否产生群体感应的 自体诱导物信号分子，即酰基高丝氨酸内酯f n a c y l - h o m o s e r i n el a e t o n a s e ，n a h l s ) 衍生物。 3 1 材料与方法 3 1