（药物化学专业论文）n烟酰基亚氨基二乙酸合成工艺优化及药理活性.pdf

北京协和医学院& 中国医学科学院 目录 m l l l i | i l l l i | 1 1 l i | l l l l m l l l l i i 寸 y 17 7 5 6 7 8 摘要1 a b s t i 认c t 2 第一章前言4 肿瘤治疗进展4 肿瘤放射抗性5 烟酰胺类衍生物作为放射增敏剂的应用6 研究目的及意义8 本实验创新点8 第二章合成工艺优化1 0 2 1 实验仪器1 0 2 2 原料与试剂1 1 2 3 实验设计1 2 2 4 实验条件探索1 3 2 4 1 反应温度的选择1 3 2 4 2 反应溶液酸碱度的选择1 4 2 4 3 纯化方法选择1 5 2 5 优化后合成工艺1 6 第三章放大实验1 8 3 1 合成烟酰肼1 8 3 2 合成叠氮1 8 3 3 合成n 一烟酰基一亚氨基二乙酸( 放大1 0 倍) 1 8 3 4 合成n 一烟酰基一亚氨基二乙酸( 放大4 0 倍) 1 9 第四章纯化实验及质谱2 0 4 1 纯化数据2 0 4 2 谱图确证2 0 第五章药理实验2 2 第六章结果与讨论2 4 【参考文献】2 6 【图谱】2 9 综述4 9 致谢5 9 北京协和医学院& 中固医学科学院 摘要 恶性肿瘤放射治疗中，乏氧细胞对放射线有较强的抗性，这部分细胞不易杀死， 成为肿瘤放疗后复发和转移的潜在因素。寻找高效低毒的肿瘤放疗增敏剂一直是放 疗急需解决的问题。为了找寻比烟酰胺更有效的放射增敏剂，中国医学科学院放射 医学研究所药物室对烟酰胺结构进行了改造，在侧链引入亲肿瘤的活性氨基酸，从 而合成一系列烟酰胺类氨基酸，其中以合成的n 烟酰基亚氨基二乙酸对肿瘤的放 射增敏效果最好。 然而其合成n 烟酰基亚氨基二乙酸的工艺比较费时，温控变动大，试剂回收 损失大，分解严重且产率低。为了实现中试及产业化放大生产的需要，我们对其工 艺进行优化。 本课题主要从反应温度，p h 范围，纯化方法和溶剂回收方面进行探索，并用优 化后的反应条件进行放大试验。经过系统的试验探索研究后，得到优化后的工艺条 件为：合成叠氮化合物控制在o 5 ，乙醚萃取液回收用低温冷却液循环泵冷凝， 回收率7 5 ；合成n 一烟酰基一亚氨基二乙酸一步反应控制p h 在7 8 ，反应温度保持在 1 5 左右，反应时问可缩短为1 5 1 6 h ，产率能达到6 0 8 0 ，得到一个纯度在9 5 以上的合格产品。 工艺优化达到了缩短反应时间，减少副产物，操作简便，提高产率，提高纯度 的目的，基本满足一类化药的技术要求，为进一步药代，药理学及毒理实验提供用 药。同时我们测试了其与顺铂的抗肿瘤协同减毒增效作用。 关键词：烟酰胺；辐射增敏：n 烟酰基亚氨基二乙酸；工艺优化；协同抗肿瘤 北京协和医学院& 中困医学科学院 a b s t r a c t i th a sb e e nw e l le s t a b l i s h e dt h a ti m d i a t i o nc e l l su n d e ro x y g e nd e p r i v e dc o n d i t i o n s i n c r e a s et h er e s i s t a n c eo fm o s ec e l l st o s p a r s e l yi o n i z i n gr a d i a t i o n t h e s ec e l l sw i l l i n n u e n c em er e s p o n s eo ft h o s et l l m o r st or a d i a t i o na 1 1 dp o t e n t i a l l yl e a dt or e l a p s ea n d m e t a s t a s i so fm a l i g n a n tt u m o r s s e a r c h i n gf o rr a d i o s e n s i t i z e r sw h i c hh a v eh i g h e r e e e c t i v ea n d1 0 w e rt o x i c i t yi sa nu r g e n tt a s ki nr a d i a t i o nt r e a t m e n t t bf i n dm o r e e f f e c t i v er a d i o s e n s i t i z e r st h a nn i c o t i n a m i d e ， p h a m a c o l o g yr e s e a r c hl a bo f i n s t i t u t eo f r a d i a t i o nm e d i c i n eo fc h i n e s ea c a d 锄yo fm e d i c a ls c i e n c e sd i dt h es t m c t u r e m o d i f i c a t i o no fn i c o t i n a m i d e t h em e t h o dw a sa t t a c h i n ga c t i v e 锄i n oa c i di n t ot h es i d e c ：h a i no fn i c o t i n 锄i d e ，t h u ss y n t h e s i z e das e r i e so fn i c o t i n o y l 锄i n oa c i dc o m p o u n d s a m o n gt h e s e ， n - n i c o t i n o y l - i m i n o d i a c e t i c a c i dh a st h eb e s tr a d i o s e n s i t i z a t i o n e l j e e c t i v e n e s s h o w e v e r ，t h et e c l l l l i c so fs y n t h e s i so fn - n i c o t i n o y l - i m i n o d i a c e t i ca c i dc o n s u m e d l o n g e rt i m e ，t e m p e r a t u r ec o n t r o lw a su n s t a b l e ，c a r r y i n go u ts 0 1 v e n t sr e c y c l i n gw a sn o t s a f ea n dh a d1 0 w e rr e c y c l er a t e ，a n dt h ed e c o m p o s i t i o nw a ss e v e r et h u sl e a d i n gt ol o w e r p r o d u c t i v i t y ： s oa st oa c h i e v ep i l o ts c a l ep r o d u c t i o na n di n d u s t r i a l i z e ds c a l e d - u p p r o d u c t i o n ，w ed e c i d e dt oi m p r o v et h et e d m i c so fs ) ，i l t h e s i sa n dp u r i f i c a t i o n t h i sp r o j e c tw a sg o i n gt oa c h i e v et h i sa i mf 如ms e v e m la s p e c t s ， i n c l u d i n g ：r e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，p hr a n g e ，p u r i f i c a t i o nm e t h o d sa 1 1 ds o l v e n tr e c y c l i n g a l s o ，w eu s e dt h e i m p r o v e dt e c h n i c st oc a r uo u ts c a l e d - u pe x p 嘶m e n t s a r e ra s e to fs y s t e m a t i ct r i a l s ，t h e i m p r o v e dt e c i u l i c sc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：t h et e m p e r a t u r es h o u l db ec o n t r o l l e da to 一5 a n dm a i n t a i n e db yt h el o wt 锄p e r a t u r el i q u i dc i r c u l a t i n gp u m p ；w h e nr e c y c l i n gt h e e t h e rs o l v e n tb yr o t a 巧e v a p o r a t i o n ，u s i n gt h e l5 e m a n o la sl o wt e m p e r a t l l r e c i r c u l a t i o nn u i di nt h ec o n d e l l s e rp i p ea i l dt h er e c o v e r yr a t ei s7 5 ；i nt h es t 印o f s y n m e s i so fn - n i c o t i n o y l i m i n o d i a c e t i ca c i d ，t h ep hs h o u l db em a i n t a i n e d7 8 ，r e a c t i o n t e m p e r a t u r ea r o u n dl5 ，t h u sm er e a c t i o nt i m ew a sr e d u c e dt o15 l6 ha n dm ey i e l dr a t e c o u l dr e a c h6 0 一8 0 f i n a l l y w ec o u l dg a i nc o n f o n n i n gp r o d u c tw i t hm ep u r i t ya b o v e 9 5 t l l ep r o d u c t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c l l l l i c sa r e r0 p t i m i z a t i o nh a dr e d u c e dt h er c a c t i o n t i m ea n dd e c r e a s e dt h es i d ep r o d u c t s a l s o ，i t se a s yt oo p e r a t e ，c o u l dr e a c hah i 曲e ry i e l d r a t ea n di n c r e a s e dt h ep u r i t y s a t i s f 弭n gm et e c h n i c a lr e q u i r e m e n t so fc l a s s1c h 锄i c a l m e d i c i n e s a n dp r o v i d i n gd m gf o r f h r t h e r p h a r m a c o k i n e t i c sa n dp h a 衄a c o l o 沓c a l 2 北京协和医学院& 中困医学科学院 r e s e a r c h e s a tt h es a m et i m e ，w et e s t e di t s s y n e r g i z e d a n t i t u m o re f r e c tw i t h c i s p l a t i n u m k e yw o r d s ：n i c o t i n 锄i d e ；r a d i o s e n s i t i z a t i o n ；n - n i c o t i n o y l i m i n o d i a c e t i ca c i d ；o p t i m i z e p r o d u c t i o nt e c l l i l i c s ；s ) ，1 1 e r g i z e da n t i t l l m o u re 骶c t 3 弋， 北京协和医学院中国医学科学院 第一章前言 肿瘤发病现状 恶性肿瘤，是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病。近3 0 年来，癌症发 病率和死亡率一直呈上升趋势。据世界卫生组织报告，1 9 9 0 年全球癌症新发病例数 约8 0 7 万，比1 9 7 5 年的5 1 7 万增加5 6 1 ；2 0 0 0 年全球男性标准化发病率为2 0 1 9 1 0 力，女性为1 5 7 8 1 0 万，共有癌症患者1 0 0 0 万，死亡者高达6 2 0 万，占总死亡人 数的1 2 o ，在多数发达国家达2 5 0 。在全球范围内，癌症的总发病率呈升高的 趋势。由于人口老龄化以及可能危险因素的作用，预计全世界因癌症死亡的人数将 继续增加：到2 0 2 0 年，全世界每年新发病例将达到1 5 0 0 万【1 】；肿瘤患者总数在发 展中国家将增加7 3 0 ，而在发达国家增长2 9 0 。我国在2 0 世纪7 0 年代， 癌 症的发病人数约为9 0 万，9 0 年代为1 6 0 万，到本世纪初，发病人数为2 0 0 万，占 全球总数的五分之一，而死亡为1 5 0 万，占全球总数的四分之一【2 1 。目前癌症死亡 数已位居各类死因的第1 位，尤以西部和农村地区增长明显，成为农民因病致贫、 因病返贫的重要原因。2 0 0 2 年公布的发病情况，男性发病率为1 4 3 9 1 0 万2 1 3 1 1 0 万，女性为1 1 2 9 1 0 万1 5 7 2 1 0 万。我国癌症发病以发展中国家高发癌症为特点 的上消化道肿瘤居多，如食管癌、肝癌和胃癌等；而以发达国家高发肿瘤为特点的 肺癌、结直肠癌和乳腺癌等迅速上升，肺癌发病率男性上升了1 5 9 o ，女性上升 了1 2 2 6 ，呈现出发展中国家与发达国家高发癌谱并存的局面。以上6 种肿瘤加 上宫颈癌和鼻咽癌共8 大肿瘤的死亡数，约占中国癌症总死亡人数的8 0 o 以上， 今后2 0 年我国癌症发病人数还将增加1 倍，抗击癌症的形势相当严峻【3 】o 肿瘤治疗进展 半个多世纪以来，癌症的治疗取得很大进展。外科手术同臻完善，并且同益重 视外科的生物学概念，注重手术方式对肿瘤患者自身的影响，提高患者的生活质量。 放射治疗有了全面而显著的进步，加速器的广泛使用、适形调强技术的开展，使放 疗的适应证增加、疗效提高而对正常组织的损伤减少。化学药物治疗是肿瘤治疗中 发展最快的一个领域，大量的针对不同靶点的新药应用于临床。对药物作用机制及 药代动力学研究的进展也使临床给药途径与方式更加适合于杀伤肿瘤细胞、保护币 常组织。 恶性肿瘤的治疗除传统的外科手术、放射治疗、药物化疗三大手段外，近年来 影像学技术、数字化技术、电子计算机技术、生物工程技术、细胞免疫及分子生物 学技术的发展带来了肿瘤治疗方法的临床变革，新的治疗手段不断出现，对肿瘤治 4 北京协和医学院& 中国医学科学院 疗的要求也不断提高。如何在无创或微创条件下以肿瘤为靶点，在最大限度杀死和 抑制肿瘤细胞的同时，使周围正常组织损伤最小，实现肿瘤靶向治疗，成为目前肿 瘤治疗的热点，并出现了热疗、放射、生物、低温冰冻、电化学疗法、纳米及超声 微泡等靶向治疗技术。它们在临床应用中各有所长，互有补充，在适应证选择上各 有侧重，但互有交错，有的手段在一定程度上可以替代外科手术治疗n 3 。 肿瘤放射抗性 放射治疗是一种有效的局部治疗手段，在肿瘤治疗中应用广泛、疗效确切。据 统计，约7 0 的肿瘤病人在病程中需要放疗【引。1 9 5 5 年，t h o m l i n s o n 和g r a y 发现 恶性肿瘤内存在乏氧细胞。肿瘤细胞暴露于急、慢性缺氧微环境中可对肿瘤的放射 治疗效果产生重要的影响，乏氧现象的存在导致放疗中对电离辐射( x 线或y 线) 的 耐受。实体肿瘤中含有相当大比例的乏氧细胞，约占肿瘤组织l o 5 0 ，这些乏 氧细胞在肿瘤的放疗中，如采用f 常组织可耐受剂量照射，肿瘤的治愈率一般只能 达到4 0 左右。根据f o w l e r 等的计算，直径为7 5 m m 的肿瘤，如果全部是有氧细 胞，杀死9 0 所需的照射剂量为4 3 g y ，如果全部乏氧细胞，则需要1 2 0 g y ，可见 肿瘤内的乏氧细胞与放射治疗的效果密切相关怕】。肿瘤乏氧细胞按其产生的原因可 分为两类：一类为急性乏氧，另一类为慢性乏氧【7 j 。 放射治疗时克服肿瘤乏氧的方法有不均等分割放射治疗，直接或间接增加肿瘤 内的氧含量，乏氧细胞增敏剂，生物还原剂，微波治疗和活血化瘀中药等。其中直 接或间接增加肿瘤内的氧含量包括高浓度氧吸入，增加血红蛋白量及其携氧能力， 应用烟酰胺克服急性乏氧等，并己进行了多种肿瘤临床试验【s ，9 】。试图应用吸入高压 氧来改善乏氧环境从而提高放射治疗效果是不可取的，因吸入高压氧后可能引起 呼吸抑制，反而会使肿瘤的血供更差【1 0 】。另一种技术上比较简单的提高肿瘤氧含量 的方法是c o n 方案即c a 而o g e n ( 5 c 0 2 + 9 5 0 2 ，高浓度吸氧，简称c b ，卡波金) 和烟酰胺( n i c o t i n a m i d e ，简称n a ) 联合应用【i l 】。加入二氧化碳的理由是它能防止增高 的氧浓度对呼吸的抑制。高浓度氧能提高血液氧合乏氧细胞，烟酰胺能扩张肿瘤内 短暂阻塞的血管而克服肿瘤的急性乏氧【坦】。肿瘤放射治疗疗效差是多种因素综合的 结果，其中最突出的是肿瘤细胞的乏氧和增殖，针对这两种因素设计了a r c o n ( a c c e l e r a t e dr a d i o t h e r a p yc o m b i n e dw i t hc a r b o g e na n dn i c o t i n 锄i d e ，加速放射治疗+ 卡波金) 方案。原理是用加速放射治疗来避免因肿瘤快速增殖引起的生物学效应下 降，以及合并c o n 改善肿瘤细胞的乏氧环境提高对放射治疗的效果。目前在局部 晚期头颈部肿瘤和膀胱癌的治疗中应用，近期疗效有所提高：但因没有长期疗效的 结果，现还难以对a r c o n 方案疗效予以准确评价【1 3 j 5 多d 北京协和医学院中困仄学科学院 烟酰胺类衍生物作为放射增敏剂的应用 烟酰胺学名为吡啶3 甲酰胺，又名尼克酰胺( n i c o t i n 锄i d e 、n i a c i n 锄i d e ) ，烟碱 酰胺，简称n a 、v b 3 或n s a ，微毒【m 】。烟酰胺是辅酶i 和辅酶i i 等的组成部分之 一，参与机体多种氧化还原反应，医学上用于治疗糙皮病、口炎、舌炎、肝脏疾病 及f l 光性皮炎。大剂量可降低胆固醇和甘油三酯，其生理作用与烟酸相仿，但水溶 性较好，无明显扩张血管作用【1 5 】。 国际上从上世纪6 0 年代起研究放射增敏剂【l6 1 ，对大量的化合物进行了研究， 建立了一套离体和整体的研究方法【1 7 ，l8 1 。目前已获得一些增敏效价很高的药物，并 适用于临床，如硝基咪哗类化合物m i s o 等，但由于存在明显的神经毒副作用，限 制了其在临床上的应用【i 叭，因而继续寻找高效低毒的肿瘤放疗增敏剂是当前肿瘤 放疗急需解决的问题。n a 是近年来国内外学者研究较多的放射治疗、化疗增敏剂。 它对体外培养的恶性肿瘤细胞、鼠类肿瘤以及人体恶性肿瘤的异种移植瘤均有显著 的放疗和化疗增敏作用【2 1 2 2 1 ，其作用机制为：n a 是辅酶i 和辅酶i i 的组成部分， 参于机体代谢过程，在促进生物氧化还原中发挥递氢作用，从而改善肿瘤组织血供， 提高肿瘤细胞放射敏感性，同时抑制d n a 损伤修复。 郭健莲等通过提高肿瘤细胞对超声杀伤的敏感性来提高其杀伤作用。该研究中 n a 的增敏作用主要是通过提高肿瘤细胞对超声波的敏感性，减少靶区内肿瘤的血 供及抑制细胞的d n a 损伤修复来增强超声的杀伤能力【1 5 】。s i e m a n 等临床前期研究 显示，在小白鼠实验中，对乏氧细胞应用n a 和c b 将提高肿瘤的杀伤力【2 3 1 。 刘雅洁等应用烟酰胺和c b 增敏8 9 s r 治疗多发性骨转移癌，从初步的临床结果 看对骨痛的缓解及生活质量的改善较8 9 s r + 烟酰胺、8 9 s r + c b 及单纯8 9 s r 治疗效率 高，并未增加8 9 s r 的治疗毒性反应【2 4 】。 目前已经明确表明烟酰胺、苯甲酰胺以及一些它们的结构类似物能够提高射线 对培养细胞的杀伤率。已有报道说明在肿瘤和纤维原细胞系中，烟酰胺、苯甲酰胺、 吡嗪酰胺、3 一氨基苯酰胺、3 一乙酰胺基苯酰胺、3 - 甲氧基苯酰胺和5 - 甲基烟酰胺能 提高射线对细胞的杀伤力l z5 。体外条件下这些结构类似物的增强辐射损伤的作用机 制被认为是抑制了细胞的修复过程。具体来说，是抑制了a d p - 核糖基转移酶的活 性。多聚a d p - 核糖是由一系列的a d p - 核糖单位组成的单质聚合物，能够牢固的结 合到蛋白质上，进而对各种酶和结构蛋白的活动产生影响。现已明确知道多聚a d p 一 核糖的生物合成是d n a 损伤后进行有效修复所必需的，尤其是辐射损伤。烟酰胺、 苯甲酰胺及所有的衍生物都能不同程度的抑制a d p r t 的活性，至少有两种化合物， 3 - 氨基苯酰胺l z b j 和3 一乙酰氨基苯酰胺【z 7 j 已被证明能够提高辐射治疗后的d n a 损 6 北京协和医学院中国医学科学院 伤。迄今为止，这些衍生物的体内肿瘤辐射增敏作用，尤其是烟酰胺，已在各种肿 瘤，单次照射和分次照射研究中报道1 2 引。 在所有进行过广泛临床试验，最具有耐受性的结构类似物中，烟酰胺是最有前 途的一个。研究表明，每天6 9 是安全剂量，并且副作用的发生率很低。有试验证 明，为了达到烟酰胺辐射增敏的最大效果，应该在血药浓度峰值时照射。 为了研制出效果更好的放射增敏剂，中国医学科学院放射医学研究所药物室对 烟酰胺结构进行了改造，设计的烟酰胺类化合物保留了烟酰胺的母体结构，在侧链 引入亲肿瘤的活性氨基酸，从而合成一系列烟酰胺类氨基酸，其中以合成的n 烟酰 基皿氨基二乙酸对肿瘤的放射增敏效果最好。体外增敏实验表明：n 一烟酰基亚氨 基二乙酸对l 1 2 1 0 细胞放射增敏比( s e r ) 为1 5 6 ，而烟酰胺为1 0 5 ；对人鼻咽癌 细胞株( k b 细胞) 的放射增敏比为( s e r ) 1 4 1 ，而烟酰胺为1 0 3 。并建立了该化 合物的质量检测方法，并依次做了光照，高温和高湿度实验，结果证明n 烟酰基 亚氨基二乙酸对强光，高温，高湿度均有很好的稳定性。 我们用l a7 9 5t u m o r - b e a r i n gt - 7 3 9 小鼠验证了n 烟酰基亚氨基二乙酸能够极 大的提高放射治疗效果【2 9 1 。n 烟酰基亚氨基二乙酸进一步实验的数据如下： 棚l 。哕疗 。d 窖：蝴， i 岔，t i m 硝妇y s ) 他q u l 嘴l 如r1 a 7 9 5l u m o f st ot 乳r c el im e st h eo | i g i n a l m e 蚴v o l l l m e ；易，g w 椭d e l 鑫y ，c o m 辑d 幻c o 乳订o l 。 顾菲等为进一步验证n 烟酰基亚氨基二乙酸的放射增敏效果，采用细胞克隆 形成法研究其对离体h e l a 细胞的细胞毒性和体外放射增敏作用；采用h 2 2 肝癌小鼠 7 石2 g ； 北京协和医学院中圈医学科学院 研究其对整体动物肿瘤的放射增敏作用；采用小鼠小肠隐窝上皮细胞和小鼠后腿皮 肤观察其对f 常组织的放射增敏作用。结果表明，该化合物对离体h e l a 细胞具有较 强的药物毒性，并随着药物浓度的增加而增大；对h 2 2 肝癌小鼠有较明显的放射增 敏作用，两组剂量的增敏比平均值为1 3 0 ，还发现l 眺g 的腹腔单独用药无明显抗 肿瘤作用；单纯照射组和加药照射组两组小鼠的小肠隐窝肉眼观察形态差别不大， 镜下检查各照射剂量点小肠再生隐窝数也无明显区别( p o 0 5 ) ，剂量效应曲线显示 该化合物是放射增敏比为1 0 1 ，说明对小肠隐窝上皮细胞没有明显放射增敏作用。 研究目的及意义 研究已经发现n 烟酰基亚氨基二乙酸具有放射增敏作用，本课题研究的目的 是通过实验室的条件，解决n 烟酰基亚氨基二乙酸合成耗时，叠氮化合物易分解， 低产率等问题。对其目前常用的合成工艺进行优化，以达到缩短反应周期，提高收 率，提高产品纯度的目的，并进行放大实验，满足一类化药的技术要求，为进一步 药代，药理学及毒理实验提供用药。同时进一步验证药理作用。 本实验创新点 1 反应溶液酸碱度 合成路线的第3 步是由烟酰叠氮与亚氨基二乙酸反应，生成含有酰胺基团的n 烟酰基亚氨基二乙酸，反应液过酸或过碱都能使酰胺键断裂，一n ( c h 2 c o o h ) 2 被 o h 取代，生成烟酸。所以我们要控制反应溶液的p h 值，使之保持在一个适当的 范围，既能减少分解，又能促使反应完成。 2 反应温度 合成叠氮反应需要在o 5 条件下进行，严格控制反应温度是反应顺利进行的 关键，温度过高会使叠氮发生分解。以前的反应是用冰盐浴人工控制反应温度，并 不能保证反应过程中温度一直维持在此范围，所以本实验采用低温冷却液循环泵控 温，不但使温控更严格，缩短了滴加n a n 0 2 时间，减少分解，提高收率，同时节省 了人力。 通过实验我们发现，合成n 烟酰基亚氨基二乙酸时，温度过低( 1 0 ) 反应 速度很慢，耗时，不可取；反应温度过高时( 2 0 ) 分解加快，副产物增加，后处 理困难，同时产率也低。所以选择合适的反应温度( 1 5 ) 也是影响产率，纯化处 理的关键。 3 纯化处理 北京协和医学院& 中国医学科学院 已有的纯化处理方法是重结晶，虽然能得到较纯的化合物，但是损失大，收率 低。为了提高收率且适应大量生产的需要，该实验摸索出了一个简便，高收率同时 纯度能满足需求的后处理方法。 4 溶剂的回收 乙醚极易挥发，易燃，刺激性强，叠氮用乙醚液进行萃取处理后，需要将乙醚 回收。以前用旋蒸减压回收时，用水做冷凝，冷凝效果不好，会有大部分乙醚未被 冷凝就被抽入空气中，不仅污染环境，对实验人员的健康也不利。本实验对用来冷 凝的液体进行了改进，用低温冷却液循环泵循环，1 5 的9 5 乙醇做循环液进行 冷凝。极大的提高了乙醚的回收率，回收后的乙醚还可继续使用，不仅减少了环境 污染还节省了资源。 总的来说，本实验对合成n 烟酰基亚氨基二乙酸的工艺进行了优化，提高了 产率，抑制了分解，减少了能耗和污染，同时又能满足后续实验需求。 9 么孓 北京协和医学院& 中国医学科学院 第二章合成工艺优化 2 1 实验仪器( 如表1 ) 表l 实验所用仪器、型号及来源 仪器名称型号生产厂家 旋转蒸发仪 循环水式真空泵 真空干燥器 红外线快速干燥箱 三用紫外分析仪 集热式恒温磁力搅拌器 接触调压器 电子天平 电子分析天平 熔点测定仪 紫外可见分光光度计 高分辨有机磁质谱仪 低温冷却液循环泵 高效液相色谱仪 超声仪 自动净水器 r e 5 2 9 9河南巩义市英峪予华仪器厂 s h z d ( i i i )河南巩义市予华仪器有限责任公司 d z f 6 0 2 0河南巩义市予华仪器有限责任公司 h w 8 0 1天津市南郊区东方实验设备厂 u v - l上海市顾村电光仪器厂 d f 1 0 1 b河南巩义市英峪予华仪器厂 t d g c 2天津市调压器厂 m e t t l e rt o l e d o 瑞士 t g 3 2 8 a上海天平仪器厂 b u c h l 5 3 5瑞士b u c h i 公司 d u 8 0 0美国b e c k m a n 公司 v g z a b h s英国v g 公司 d l s b 5 2 5巩义市予华仪器有限责任公司 w a t e r s2 6 9 5 2 9 9 8w a t e r s q t l 0 2 6 0 k 天津市瑞普电子仪器公司 m i l l i p o r e天津市奥佳科技有限公司 l o 北京协和医学院中国医学科学院 6 ) 北京协和医学院& 中困医学科学院 2 3 实验设计 目前，合成n 烟酰基亚氨基二乙酸的路线主要有3 条，分别如下： 路线1 ： o o 路线2 ： o o 路线3 ： n h z + h 2 n n h 2 h 2 0 o n 3 +h n c h 2 c o o h 坚竖 c h 2 c o o h c o o 一 9 8 的n 一烟酰基亚氨基二乙酸研细后，配制浓度为5 0 m 咖l ， 7 5 m 咖l ，1 0 0 m m l 的水溶液，并用氢氧化钠调p h 接近中性略显酸性( 中和n - 烟 酰基亚氨基二乙酸的一个羧基) ，抽滤除菌备用。 5 2 实验动物及分组 健康昆明小鼠6 0 只，体重为1 8 2 0 9 ，每组1 2 只，雌雄各半，由中国医学科学 院实验动物研究所提供。动物随机分组，实验设空白对照组、阳性对照组( 顺铂) 以及n 烟酰基亚氨基二乙酸的高、中、低3 个剂量组。 5 3 实验方法 空白组：口服纯净水o 2 m l 只；阳性对照组：腹腔注顺铂o 2 m 1 只；3 个实验组： 腹腔注射顺铂o 2 m l 只，同时口服给药o 4 m l 只。隔一天给一次，给药3 次。第1 0 天时，称重，全部处死，解剖。取出胸腺、肝、脾，称重并计算。 5 4 实验结果( 见表4 ) 从表中可知，n 烟酰基亚氨基二乙酸协同顺铂给药组抑瘤率没有顺铂好，在 3 个剂量组中1 5 0 0m g k 分1 组的效果最好。3 个剂量的脾指数，胸腺指数都不存在显 著性差异。 5 5 讨论 从脾指数分析得出，n 烟酰基亚氨基二乙酸的中剂量组对肿瘤的抑制作用较 好；而从胸腺指数，脾指数分析，协同抗肿瘤作用不明显；3 个剂量组的抑瘤率也 没有阳性对照组高。从抑瘤率数据可以看出，3 个协同给药组的肿瘤大小都比顺铂 北京协和医学院& 中困医学科学院 组大，提示n 烟酰基亚氨基二乙酸可能只有辐射增敏作用，而可能没有与化疗药 物协同抗肿瘤作用，由于研究很初步，需要进一步实验确证，但有一定减轻毒副作 用的功效。n 一烟酰基亚氨基二乙酸药理作用还有待进一步研究。 表4n 烟酰基亚氨基二乙酸的协同抗肿瘤作用结果 空白组 阳性对照组 10 0 0 m g k g 。1 组 15 0 0 m g k g 1 组 2 0 0 0 m g k g 。1 组 7 9 7 士1 8 72 6l 士o 9 3 3 5 9 士2 3 22 0 8 士0 8 4 3 4 5 士2 7 31 0 6 士o 3 8 + 2 9 1 士1 1 4 ”2 5 1 士1 5 6 ”2 9 1 士1 1 4 2 5 1 士1 5 6 。 8 2 5 士13 11 9 6 士o 7 4 6 5 3 3 9 o 4 6 9 3 6 1 注：l ：表中的t 值和p 值均足j | ；f 1 性对照组相比；爿为p o 1 ；木木为p 北京协和医学院& 中国医学科学院 鑫动标尺色谱盈 峰结果 保留尊争问面积高度 名称面积 1 分钟微伏。秒徽伏 2 2 6 14 2 7 9 5 2 27 0 4 2 8 61 o o 附图1 3 批次2 0 0 9 1 1 1 2 2 产物纯化后的h p l c 图 4 2 北京协和医学院& 中网医学科学院 自动标尺色谱圈 峰结果 保留时问面积高度 名称 萄积 ( 分钟徽伏。秒) 徽伏 2 2 7 14 7 3 2 6 4 88 3 0 7 g & 2 4 23 9 5 81 5 2 6 01 0 3 4o 。3 2 3 4 1 9 56 9 2 9 91 1 3 71 4 4 附图1 4 批次2 0 0 9 1 1 1 8 产物纯化后的h p l c 图 4 3 99 北京协和医学院& 中困医学科学院 自动标尺色谱圈 峰结果 保管时闯面积高度 名称面积 悸 钟e 徽伏秒( 徽挠 1z 2 8 86 9 2 7 7 6 36 0 7 9 6 9g g 2 23 ，9 0 86 1 3 a b 49 8 5o 8 8 附图1 5 批次2 0 1 0 0 1 1 9 产物纯化后的h p l c 图 北京协和医学院中国医学科学院 自动标尺色谱蛋 6 霉擂 甘 、 甘寸 、 i 为z厶 二i 0 1 2 3 4o 。5 8 o c7o o8 保寅时闯面积高度 名称面积 1 分钟( 徽伏秒微伏 12 2 6 43 8 5 8 7 3 34 8 7 4 9 6 4 5 24 3 1 67 6 7 6 82 6 1 71 9 2 34 4 6 56 5 3 8 42 4 6 71 6 3 附图1 6 批次2 0 1 0 0 1 2 7 产物纯化后的h p l c 图 4 5 尼p o 北京协和医学院& 中固医学科学院 自动标尺色谱翻 处理通道说嘎：p d a2 5 8 。0 纳米 织终处纛通糊毙嚣嚣芸淼缓戳焉 1 p e a2 5 8 o 幼袋2 1 2 02 9 7 7 3 6 39 5 1 0 17 5 4 9 2 2蜂1p d a2 5 8 o 纳张2 3 1 8 3跨2p b i a2 5 8 o 纳米2 5 8 7 4 p d a2 5 8 o 鳓米2 。8 2 61 5 6 3 3 64 舶7 5 5缝3pd _ a2 5 8 。o 绒泶3 2 ”： 6缝4p d a2 5 8 o 缡涨3 9 1 6 7缝5 p d a2 5 8 o 纳袋4 8 3 3 附图1 7 批次2 0 1 0 0 3 0 2 产物纯化后的h p l c 图 北京协和医学院& 中国医学科学院 3 自动标尺色谱蛋 峰结 台簪 附图1 8 批次2 0 1 0 0 3 1 7 产物纯化后的h p l c 图 4 7 厂) z 矿 暑 鬟 ( ；， 筝鏊 o o 吾 点 三 乏譬 岂。 北京协和医学院& 中困医学科学院 附图1 9 化合物n 烟酰基亚氨基二乙酸的质谱图 4 8 sa童甚西z越摩 广q z 价 一，神、，o一 口m_i103每_摹舟 z i ( ，z a x 1 0 扛q q 挤q u k q o q o ，讲o ，吣谚( ；_ 5 ，v 铲贫，吣a q 坼缸 a ，吣 ，l 铲，吣q 钫”勰心吣吣j q 辑1 。狮1 时研 。 o ，q o o 心讲o ositl03 堑w 一：“奄a投tlo， n o z o t h o 厶 h3濞ru暑m：一z尉暑疗 sa_j口一麝tv口西 no暑暑。了 一。嚣弓童恕；一 c镰国，z蟹摹弗 m 暑| e h 再z n磐ii尊fatl03协mc辨 s o ；) e h殳蒜ml虮矾& h窭010 h 赫4 w 吣a 砧 心o 辩q 吣 oc：诉谚 ”a 一 a 时 喜 北京协和医学院& 中国医学科学院 口年 综述 肿瘤乏氧测定及克服方法的研究进展 高建芳周则卫 ( 北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所，天津3 0 0 1 9 2 ) 【摘要】肿瘤内乏氧细胞的存在是影响放化疗效及预后不良的一个主要原冈。改善肿瘤细胞的 含氧状态是提高放射治疗效果的一个有效途径。目前克服肿瘤乏氧的方法包括提高实体肿瘤氧 合( 如吸入c a r b o g e n ) 、开发乏氧细胞毒性药物、基冈治疗、以h i f 1 为靶点治疗、微波疗法等。 【关键词】肿瘤乏氧；辐射增敏；基冈治疗；h i f l 肿瘤乏氧，亦即肿瘤供养不足，在实体瘤中是一个非常常见的现象，乏氧细胞 约占l o 5 0 ，对放射线有较强的抵抗力【l 】。肿瘤乏氧细胞在新陈代谢、分子遗传 学及病生理方面发生改变，从而在肿瘤的演化进展过程中起着非常重要的作用，并 对放化疗抗拒导致肿瘤局部复发、远处转移和预后不良。现在对肿瘤细胞乏氧的研 究仍是非常热门的课题【2 1 。 l 肿瘤乏氧细胞的生物学特性 分子生物学研究表明，绝大多数恶性肿瘤内存在不同程度的乏氧细胞，并且有 急慢性之分，其慢性乏氧细胞的形成是肿瘤内氧弥散障碍或不足所致，即远离血管 的肿瘤细胞因超过了氧的有效弥散距离( 1 0 0 1 5 0 岬) 而处于乏氧状态：急性乏氧细 胞是由肿瘤内血管变窄或阻塞导致血液断流或不畅而引起的短期暴发氧含量下降 使血管周围细胞乏氧l 3 1 。 近年研究发现肿瘤乏氧细胞并非静止不变，它会为适应乏氧环境而发生一系列 的生物学改变，从而促进肿瘤的恶性表型【4 】。细胞乏氧后细胞周期的改变主要表现 为g l 期阻滞，在g l 期细胞增多的同时g 2 + m 期及凋亡细胞也逐渐增多，而s 期细 胞减少。这种变化仅发生于乏氧后2 l6h 内，2 4h 后各细胞周期比例又恢复到有 氧水平。乏氧在2 1 6h 内发生细胞周期的改变主要是g l 期阻滞，而这只是细胞在 乏氧条件下产生的适应性改变【5 1 。随着乏氧时间的延长在8h 时凋亡细胞达到峰值， 这可能与乏氧诱导死亡及凋亡的信号传导途径被激活有关。 研究发现乏氧在诱导一部分肿瘤细胞产生凋亡的同时，可以使另一部分肿瘤细 胞对乏氧产生耐受且抗凋亡，其生物学机制尚在研究中。对肿瘤细胞增殖周期的 研究发现，乏氧环境能特异性地抑制早s 期d n a 复制的启动，该过程与p 5 3 基因 4 9 i d 。 北京协和医学院中围医学科学院 无关。特点是当细胞再氧合时，d n a 复制能在数分钟内恢复。当肿瘤处在乏氧环 境时，肿瘤内的血管内皮生成因子( v e g f ) 表达增多，促使血管增生，导致在乏氧环 境下处于s 期的细胞再氧合，引起d n a 过度复制，从而诱导放射抗拒基因的合成 增多，使肿瘤对放射治疗的抗拒性增加【6 】。对肿瘤细胞凋亡的研究发现，肿瘤内 w p 5 受乏氧环境的影响使其生成受到限制，而对m t p 5 没有影响，因而有选择性地 提高了肿瘤内m t p 5 3 的比率，使其成为肿瘤组织的主要表达形式，故乏氧环境引起 的细胞凋亡较比有氧时要少。然而，乏氧坏境诱导的凋亡和放疗诱导的凋亡基因是 相同的，因此乏氧环境通过降低凋亡潜能细胞的选择作用引起对放化疗的抗拒性1 7 j 。 乏氧环境具有类细胞因子的作用，它能使许多蛋白质合成增加，包括：血红素氧 合酶l ( h e m eo x y g e n a s e s1 ，h o 一1 ) ( 0 叩3 3 ) 、金属麦硫i i ( m e t a l l ot h i o o n e i ni i ，m t - i i ) ( o 印7 ) 及j u n 族癌基因等，从而使肿瘤细胞表现的更具有侵袭性。但乏氧信号的传 递与生长因子激酶有交叉重复，其中包括氧合作用的信号传导，而其重要的分子是 乏氧诱导因子( h y p o x i a