（植物学专业论文）高产γ氨基丁酸红曲霉菌株的筛选及发酵条件优化.pdf

摘要 丫一氨基丁酸( a m i n o b u t y r i ca c i d ，简称g a b a ) 是一种天然存在的 非蛋白质氨基酸，生物合成由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化脱羧而来。 丫一氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有 降血压、治疗癫病、镇静安神、增强记忆、控制哮喘、调节激素分泌、 促进生殖和活化肝肾等多种生理功能，其制备和应用广受人们的关注 与重视。 从1 9 7 9 年日本学者远腾章发现红曲霉产生降压物质之后，国内 外学者掀起了红曲霉研究热潮。目前，我国功能红曲霉生产还是普遍 存在产量较低、生产成本偏高等问题。原因一方面是培养工艺的不足， 另方面是缺乏优良的红蓝霉菌株。因此进行红曲霉的选育研究具有 非常重要的现实意义。 本文研究从产g a b a 的红曲霉菌株选育，得到一株产g a b a 能 力较高的菌株m 6 1 3 ，研究其生物学特性，通过培养基和发酵条件优 化，提高g a b a 产量。 首先，从自然界中筛选相对高产g a b a 的红曲霉菌株，最终在 红腐乳中筛选到一株红色红曲霉菌株m 6 ，p d a 液体摇瓶发酵产量 最高3 1 6 0 9 l ，再通过紫外诱变和化学诱变，及遗传稳定性实验， 可得到一株遗传性状稳定的菌株m 6 1 3 ，其g a b a 产量达到 5 5 2 7 9 l 。 其次，对所得菌株进行生物学特性研究。研究发现：红曲霉菌株 i m 6 1 3 菌丝生长温度范围为2 0 一4 2 ，最适生长温度为3 5 左右； 生长p h 范围很广，最适p h 值为4 5 5 5 ；对乙醇的耐受程度为1 5 ， 当酒精度超过1 5 时，其孢子很难萌发生长；红曲霉菌株m 6 1 3 有 较高糖化力。 再次，通过对培养基组成和摇瓶培养条件进行单因素实验，如培 养基碳源、氮源，培养温度、p h 值、摇床振荡速度等筛选影响g a b a 产量的主要因素。在单因素实验的基础上，以培养温度( 3 0 、3 3 、 3 5 ) 、初始p h ( 7 0 、6 0 、5 0 ) 和摇床速度( 9 0 r m i n 、1 2 0 r m i n 、 1 5 0 r m i n ) 为三因素及其水平，g a b a 产量为指标，对发酵条件整体 优化进行l 9 ( 3 3 ) 正交试验，通过正交实验对发酵条件进行整体优化。 最佳组合为培养温度3 5 、初始p h 5 0 、摇床速度1 2 0 r m i n ，优化 发酵条件下g a b a 的产量提高到7 8 2 6 9 l 。 最后，在摇瓶发酵优化的基础上，进行分批发酵初探，研究表明 5 0 的接种量、1 0 0 l h 通气量适合g a b a 积累。还对一些低成本农 副产品培养基进行了研究，结果表明，使用小麦粉为主要碳源的培养 基，在最优条件下进行液体发酵，其g a b a 产量可以达到1 2 4 7 0 9 l 。 关键词：红曲霉，1 ，氨基丁酸，选育，发酵条件，优化 a bs t r a c t 7 - a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) ，af o u r - c a r b o nn o n p r o t e i na m i n oa c i d ， s e r v e sa sam a j o ri n h i b i t o r yn e u r o t r a n s m i t t e ri nm a m m a l i a nn e r v o u s s y s t e m s g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ( g a d ，e c 4 1 1 15 ) c a t a l y s et h e i r r e v e r s i b l e 0 【一d e c a r b o x y l a t i o n o fl g l u t a m a t et o 7 - a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) g a b ah a ss e v e r a lp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ss u c ha sh y p o t e n s i v e a c t i v i t y , t r e a t m e n to fe p i l e p s y , t r a n q u i l i z i n ga n da l l a y i n ge x c i t e m e n t ， e n h a n c i n gm e m o r y , c o n t r o l l i n ga s t h m a ，r e g u l a t i n gh o r m o n es e c r e t i o n p r o m o t i n gr e p r o d u c t i o n a n da c t i v a t i n gl i v e ra n d k i d n e y f u n c t i o n p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fg a b aa r ec o n c e r n e d i n19 7 9 ，e n d oai nj a p a nf o u n dt h a tm o n a s c u ss p pc o u l dp r o d u c e s o m e t h i n g ，w h i c hh a sh y p o t e n s i v ea c t i v i t y r e s e a r c h e r sb o t hi nc h i n aa n d a b r o a dh a v eb e e nm a k i n gs t u d yo fi ts i n c et h e n u pt on o w , r e a s o n st h a t t h ep r o d u c t i o no fg a b ai sl o wa n do p e r a t i n gc o s t si sh i g hi no u rc o u n t r y a r et h el a c ko fg a b am o n a s c u ss t r a i n sa n dt h e l a c ko fq u a l i f i e d i n d u s t r i a lf e r m e n t a t i o n t h e r e f o r e ，t h eb r e e d i n go fm o n a s c u ss t r a i n st h a t i so v e r - p r o d u c t i o ng a b ai sv e r yi m p o r t a n t i nt h i se x p e r i m e n t ，m o n a s c u sr u b e rm 6 13w h i c hc o u l dp r o d u c e 7 - a m i n o b u t y r i ca c i dw a sb r e e d e d ，a n dt h eb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i cw a s s t u d i e d ，t h ec u l t u r es u b s t r a t ea n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d i no r d e rt oi m p r o v et h ep r o d u c t i o no fg a b a f i r s t ，丫- a m i n o b u d a c i d p r o d u c i n gmr u b , m 6 i s o l a t e dfromlrsta m m o b u t y n c r u b e r6w a ss o l a t e df r o m ，丫- 一 朋1 i i i n a t u r ea n di d e n t i f i e d t h ep r o d u c t i o no fg a b ar e a c ha t3 16 0 9 lw h e ni t l i q u i d f e r m e n tp d a i nt a p e rb o t t l e t h em u t a n ts t r a i no fm t u b e rm 6 13 f r o mmr u b e rm - 6w a sa c q u i r e d ，a n dt h ep r o d u c t i o no fg a b ar e a c ha t 5 5 2 7 9 l a f t e r15g e n e r a t i o nt h em u t a n ts t r a i nh a ds t a b l ey i e l do fg a b a a n dn or e v e r s em u t a t i o n s e c o n d ，t h eb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i co fmr u b e rm 6 13w a ss t u d i e d t h eb i o l o g yc h a r a c t e r i s t i ci s ：g r o w i n gt e m p e r a t u r eo fm 6 13m y c e l i u mi s 2 0 - - 4 2 。c ，m o r es u i t a b l et e m p e r a t u r eo fm 6 - 1 3i s3 5 。c ；p ho fm 6 1 3 m y c e l i u mg r o wi sw i d e ，m o r es u i t a b l ep hi s4 5 - - 5 5 ；e n d u r a n c ed e g r e e o fs p o r et oa l c o h o li s15 ，s p o r ei sn o tg r o ww h e nd e g r e et oa l c o h o li s h i g h e rt h a n15 m 6 - 1 3h a sh i g hp e r f o r m a n c ed i a s t a t i cp o w e r t h i r d ，t h ec u l t u r es u b s t r a t ea n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fmr u b e r m 6 13w e r eo p t i m i z e db yw a y so fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ta n dl 9 ( 3 3 ) o r t h o g o n a lt e s t s i n g l e f a c t o r sa r ec a r b o n s o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ， g r o w i n gt e m p e r a t u r e ，b e g i n n i n gp ha n ds h a k i n gs p e e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a t b e g i n n i n gp h5 0 ，c u l t u r et e m p e r a t u r ea t 35 ，s h a k i n g s p e e d 12 0r m i n ，t h e h i g h e ry i e l d o f7 - a m i n o b u t y r i ca c i dc o u l db e r e a c h e d t h ec o n t e n to fg a b aw a s7 8 2 6 9 li nt h eo p t i m u mc u l t u r e c o n d i t i o n s f i n a l l y , t h eb a t c hf e r m e n t a t i o n so fm 6 13 w e r es t u d i e do nt h e o p t i m u mc o n d i t i o n t h ee f f e c t so fo p e r a t i o nc o n d i t i o n s ( i n o c u l a t i o na n d v o l u m eo fg a s ) o ng a b ab a t c hf e r m e n t a t i o no fm 6 13 i na3 7l i t e r s i v s t i r r e df e r m e n t e rw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a to p e r a t i o n c o n d i t i o n ( 5 o i n o c u l a t i o na n dlo o l h ) w a sa d v a n t a g e o u st og a b a a c c u m u l a t i o n t h el a s t ，t h el o w c o s tf a r mp r o d u c ew e r es t u d i e da sc u l t u r e m e d i u mt op r o d u c eg a b a t h er e s u l ts h o wt h a tt h ec o n t e n to fg a b a r e a c h e da t 1 2 4 7 0 9 li nt h ew h e a tf l o u rc u l t u r ec o n d i t i o n so no p t i m u m f e r m e n t a t i o n k e y w o r d s ：m o n a s c u s s p p ，7 - a m i n o b u t y r i c a c i d ， b r e e d i n g ， f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，o p t i m i z a t i o n v 浙江师范大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其他机 构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在 论文中作了明确的声明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人 承担。 作者签名：局吻穆弓日期：胁多月，。同 学位论文使用授权声明 本人完全了解浙江师范大学有关保留、使用学位论文的规定，郎：学校有权 保留并向隧家有关机关或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阗和 借阅，可以采用影印、缩印或扫描等手段保存、汇编学位论文。同意浙江师范大 学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播论文的全部或部分内容。同时授权中 国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。 保密的学位论文在解密后遵守此协议。 作者签名辱皖强j 导师签名：荔蜕日期：埘年z 月，。曰 6 9 第一章文献综述 蛋白质是一切生命活动的基础，氨基酸则是构成蛋白质的基本单元。常见的 组成蛋白质的2 0 种氨基酸，称为蛋白质氨基酸。此外，蛋白质还有很多不常见 氨基酸，由常见氨基酸经专一酶催化的化学修饰而得，称为非蛋自氨基酸。非蛋 自氨基酸存在于各种组织和细胞中、并且一般都其有特殊的生理功能。丫基丁酸 ( 了一a m i n o b u t y r i ca c i d ，简称g a b a ) 就是一种天然存在的非蛋鸯质氨基酸。 1g a b a 概述 l 。1g a b a 的结构性质 丫氨基丁酸又称4 一氨基丁酸、氨酪酸，是丁酸的丫位上有个氨基，分子 式为c 4 h 9 n 0 2 ，相对分子量1 0 3 1 2 。 g a b a 为自色或类自色结晶性粉末，结晶为白色叶状( 甲醇一乙醚) ，自色 针状( 水一乙醇) ，有微臭，味微苦，无旋光，熔点是2 0 2 c - - 2 0 4 。c ，熔化时分 解生成毗咯烷酮和水，极易溶予水，2 5 c 时溶解度是1 3 0 9 1 0 0 m l ，微溶于乙醇， 不溶于常见有机溶剂醚和苯。g a b a 在水溶液中主要以兼性离子存在，其解离情 况取决于溶液的p h ，g a b a 等电点p l g a b a = 7 1 9 。g a b a 具有氨基酸的特殊化学 反应，如酰基化反应、烃基化反应、成酰氯反应。此外，g a b a 能与茚三酮反应， 生成紫色化合物。 1 2g a b a 是一种非蛋白腰氨基酸 g a b a 是广泛分布于生物中的一群非蛋叁质氨基酸，生物合成由谷氨酸经谷 氨酸脱羧酶( g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ，e c 4 。l 。1 1 5 ，简称g a d ) 催化脱羧焉来。 19 5 0 年，a w a p a r a 1 1 和u d e n f r i e n d 2 】几乎同时发现在哺乳动物大脑中存在g a b a ， 后证实是一种抑制性神经递质。 g a b a 除了在哺乳动物中枢神经系统作为抑制性神经递质而存在外，在植物 中也广泛分布，如藻类、真菌、藓类、蕨类和有花植物等，和植物逆境反应有一 定的关系【3 1 。在多种细菌、古生菌和真核微生物中发现了的存在谷氨酸脱羧酶【4 】 而谷氨酸脱羧酶，是生物体催化谷氨酸或钠盐脱羧生成g a b a 唯一的酶，这也 表明了微生物体内也广泛存在着g a b a ，如有报道利用酵母【5 、红曲霉1 和乳 酸菌【l o , 1 1 等合成g a b a 。 2g a b a 的生理作用 1 9 5 0 年，a w a p a r a 和u d e n f r i e n d 发现在哺乳动物正常脑内的g a b a 浓度特 别高，但当时g a b a 生理活性还不清楚。随后r o b e r t s 1 2 】证明大脑中g a b a 是 从谷氨酸在谷氨酸脱羧酶作用下，经脱羧反应得到。1 9 6 6 年，k r n j e v i c t l 3 j 等的研 究表明g a b a 在哺乳动物大脑中模仿内源性神经递质工作。1 9 7 5 年，在第二届 g a b a 国际专题讨论会上，g a b a 被确认为是哺乳动物神经递质中枢的一种抑 制性递质【1 4 】。研究表明，g a b a 是中枢神经系统c n s 中最主要的抑制性神经递 质，2 0 - - 4 4 的中枢神经系统突触以g a b a 为神经递质【”】，由g a b a 调控的 抑制信号占总抑制信号的4 0 左右【1 6 】。g a b a 通过结合突触后离子型g a b a 受 体和代谢型g a b a 受体诱发神经抑制【1 7 , 1 8 1 ，能突触传递的终止依赖于定位在突 触前膜和胶质细胞上的g a b a 转运蛋白的快速重摄取，尤其是g a b a 转运蛋白， 它是最主要的神经元转运蛋白【1 9 , 2 0 l 。报道的g a b a 的生理功能大多和抑制性神 经递质相关联【2 1 五4 1 ，主要包括： 2 1 心血管调节作用 g a b a 是哺乳动物脑内重要的抑制性递质，对心血管活动有着重要的调节作 用【2 5 1 。g a b a 是通过调节中枢神经系统，作用于脊髓的血管运动中枢，与突触 后有抗扩张血管作用的g a b a - - a 受体和对交感神经末梢有突触的抑制作用的 g a b a - - b 受体结合，能有效促进血管扩张，从而达到降血压的目的【2 6 2 。 t a k a h a s h i 等【2 8 】首次报道g a b a 对心血管系统的作用，并且发现在y 氨基酸 类中，它的效应最强。以后他们在兔、犬和猫的实验中，证明1 0 m g k g g a b a 的 降低血压和心动过缓的效应，可被切除交感神经或阻断神经节所阻止，且不需迷 走神经、主动脉神经和窦神经参加。 a n t o u a c c i o 等【2 9 】给麻醉猫脑室注射g a b a 受体激动剂( 0 0 3 9 9 k g - - 3 t g k g ) 2 和g a b a ( 3 9 9 k g - - 1 0 0 0 9 9 k g ) ，血压和心率下降均呈剂量一效应关系，首次证 明g a b a 对盎压和心率的中枢性交感抑制机制的。 我国学者孙妙坤1 3 0 】用电离子透入法证臻动脉惩力反射弧的传入渖动在延递 交感神经元上的抑制性递质是g a b a ，揭开7 心血管活动中枢调节之谜。一些报 告证明g a b a 对心血管活动还有外周作用。b i l l i n g s l e y 等【3 1 1 给麻醉狗和大鼠静脉 注射lp g k g - - l0 0 0 9 9 k g 的g a b a ，也获得降压和减慢心率的作用，其它氨基酸 亦无此作用，他推断g a b a 可能直接作用于心肺瓶管的组织。一些离体的实验 证明在狗的基底和大脑中动脉条上g a b a 可产生舒张作用，而在主动脉，肠系 膜动膝或f 了静脉上无此作黑。g a b a 抗心律失常作用的研究也有文献报告，如 k e n i c h i 掣3 2 垮鼹告给猫注射中枢g a b a 激动荆，可预防中枢诱发的冠脉血管阻力 的增加及缺血性心律失常，并证明这是通过交感神经对冠脉血管阻力的调节作用 所致。g a b a 对一些神经相关蛋白及酶的表达也具有一定的调节作用【3 3 】。 2 2 促进生长激素分泌侔用 研究表明，g a b a 具有促进生长激素分泌的作用【3 4 】，口服5 9g a b a 可使血 液中的生长激素( g h ) 显著提高，超过5 n g m l t 3 5 】。g h 是人体内含量最高的几 种激素之一，影响全身细胞、骨髂、肌肉和器官的生长，因此g a b a 对于人体 新陈代谢和各种生理功能有着广泛的调节作用。然两，过多服用生长激素会有副 作用，与补充外源g h 相比，g a b a 由于能够促进人自身的生长激素分泌，因此 更安全合理。 2 3 有助于抗衰老 g a b a 能帮助神经细胞处于对信号的高识别能力状态，科学家给老年恒河猴 大脑视觉皮层的神经细胞施以微量的g a b a ，结果发现神经元的行为变得“年轻 了。 中国科技大学、中科院昆甓动物研究掰和美国犹谴大学的科研人员合作研究 发现，大脑中神经递质一g a b a 的减少可能是脑衰老的一个原因【3 酗。科研入员 对老龄短尾猴进行研究后发现，g a b a 可以帮助大脑处于巅峰状态，但随着年龄 的增长，大脑得到的g a b a 将逐渐减少。短尾猴的视觉功能同人类相似，也会 随着年龄的增加而出现恶化，当大脑处在巅峰状态的时候，它们可以挑选信号来 做出反应。缺乏g a b a 将导致某种神经细胞退化，从而使短尾猴的视觉选择能 力下降。相对年龄较小的短尾猴而言，g a b a 及其增强剂注入老龄短尾猴体内后 的功效更大。该发现预示着如果能够通过某种手段提高人大脑中g a b a 的含量， 则有可能改善老年人的感觉功能以延缓衰老。 2 4 促进生殖 y 一氨基丁酸( g a b a ) 作为一种抑制性神经递质，通过下丘脑一垂体一i 生 腺轴系影响垂体和性腺生理机能，参与激素的分泌调节。g a b a 对卵巢颗粒细胞 孕酮的分泌调节随动情期不同而呈现抑制和促进作用。g a b a 也可通过多巴胺抑 制系统抑制垂体激素：促黄体激素( l h ) 和催乳素( p r l ) 的分泌。g a b a 与 孕酮协同作用，能明显促进精子的获能，提高精子的体外能力 3 7 , 3 8 】。r o l d a n 3 9 1 、 s h i 4 0 1 和王春年h 1 1 等均报道了g a b a 可明显地引起获能小鼠及人精子发生顶体 反应，提高人精予的受精能力。 2 5 预防肥胖 张辉等人对长期投以富含g a b a 米胚芽的大鼠进行研究，发现大鼠体重 增加受到显著抑制，认为富含g a b a 米胚芽具有预防肥胖的功能。 2 6 醒酒功能 由于g a b a 能促进乙醇代谢，因此可以用来醒酒。顾振新等人【4 3 1 以嗜酒者 为研究对象进行试验，服用富含g a b a 米胚芽，在饮用6 0 m l 威士忌后采血测 定血中乙醇及乙醛浓度，发现两者浓度明显比对照组低。 2 7 消臭作用 据文献【“】报道，经实验表明富含g a b a 米胚芽具有与市售消臭食品大体同 等的作用，可以消除体臭、口臭、生理臭和尿臭等。 4 2 8 其它功畿 有文献报道，g a b a 能在胃酸分泌的中枢调节中起重要作用。在脑内注射 g a b a 能增加胃酸的分泌，g a b a 不仅能刺激胃酸的分泌，还能刺激胃蛋白酶 的分泌，增加霄壁粘液蛋白量，从而增加了胃粘膜屏障机能。另外神经组织中 g a b a 含量降低也与h u n t i n g t o n g 疾病、老年痴呆症等神经衰败症有关【4 舅。 3g a b a 的合成与分解代谢 3 1g a b a 代谢途径示意图 g a b a 合成的主要途径是l o l u 的脱羧反应，该反应出g a d 催化。在一些 情况下，g a b a 可由岛氨酸和丁二氨转化而来，但这些物质都是由l g l u 生成的， 所以说g l u 是g a b a 的唯一来源【a 6 1 。 3 。2 生物体内g a b a 伐谢 n a y l o r 和t o l b e r t 在理论上首先推测高等植物中存在g a b a 支路。此后陆续 报道g a b a 支路存在于烟草培养细胞，马铃薯块茎、西红柿和西葫芦幼苗等许 5 多植物【4 7 】。丫氨基丁酸与植物逆境代谢、种子活力和细胞发育有关，它由谷氨酸 脱羧酶( g a d ) 催化l 谷氨酸脱羧产生，因而g a d 的活力可作为禾本科作物种 子活力和幼苗长势的指标。对小麦植株化学成分与麦长管蚜和二叉蚜种群消长的 关联度分析结果表明：在高肥田和中肥田，y 氨基丁酸与麦长管蚜种群消长的关 系最为密切。 在细菌和n g l 动物大脑中，g a b a 首先在g a b a 转氨酶的催化下，和0 【酮 戊二酸发生转氨作用形成琥珀酸半醛( s s a ) 和g l u ，然后s s a 在琥珀酸半醛脱 氢酶( s u c c i n a t es e m i a l e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，s s a d h ) 氧化形成琥珀酸进入三羧 酸循环，这些反应和g a d 催化的g l u 脱羧反应一起，构成a 酮戊二酸氧化成琥 珀酸的另一条支路，称为g a b a 支路3 9 1 。 4 g a b a 制备 由于g a b a 在动植物原料中含量很低，很难直接从这些天然组织中大量提 取得到，目前g a b a 的制备方法主要有化学合成法和生物合成法。生物学途径 制备主要是利用酶催化转化，在g a b a 支路中合成，就酶源而言，可分为两种 途径：植物组织代谢和微生物发酵。 4 1 化学合成法 主要是通过y 一氯丁氰的取代水反应来合成，将邻苯二甲酰亚氨钾与7 一氯丁氰 在1 8 0 。c 反应，然后将产物与浓硫酸回流，再结晶提纯而得4 8 1 。这种合成方法反 应速度快、得率高，但条件剧烈，且有化学物质残留，脱除产品中有毒成分比较 复杂、成本较高、安全性差，即使得到纯品也不属于天然产物，主要应用于化工 和医药领域，不适合在食品中应用。 4 2 植物组织代谢生物学途径 植物组织代谢主要利用内源酶转化制备g a b a ，有两种形式：植物组织生长 代谫十和离体植物组织应激代谢。 4 2 1 离体植物组织应激代谢 植物组织中有两条合成和转化g a b a 的途径：一条由谷氨酸脱羧酶催化谷 6 氨酸合成( g a b a 支路) ，另一条由多胺降解。实际合成主要是利用第一条途径， 是植物组织对外界条件应激代谢生成的。这条途径主要产品有g a b a 茶和发芽 糙米等。目前g a b a 茶在日本正在形成叶茶、袋泡茶和罐装茶等系列产品，肯 尼亚、斯里兰卡等国也开始研究提高红茶中g a b a 的含量，我国也研制出高 g a b a 绿茶【4 9 1 。 此类g a b a 产品还有以米胚芽、米糠、绿茶、南瓜、辣椒、茄子、番茄和 蜜柑等为原料生产的g a b a 功能性食品f 5 0 】。温度应激可使用微波、红外和冷冻 等技术，如制备g a b a 茶时，采用红外加热。 4 2 2 植物组织生长代谢 1 9 9 4 年，日本农林水产省中国农业试验场试育成大胚水稻品种“海米诺里”， 开发成功g a b a - - r g 和米糠，胚芽内的y 一氨基丁酸比普通大米高约4 倍5 1 , 5 2 1 。 中国水稻研究所应用生物工程技术培育出一种富含y 一氨基丁酸的水稻新品种基 尔米，其g a b a 含量是普通大米的6 倍吲。 4 3 微生物发酵生产g a b a 的研究 谷氨酸脱羧酶g a d 广泛分布于各种有机体活细胞，是生物体催化谷氨酸脱 羧生成g a b a 的唯一酶。目前已经在多种细菌、古生菌和真核微生物中发现了 g a d 的存在。乳酸菌、酵母菌和曲霉菌等一些安全性高的微生物在g a b a 类食 品的制备中已有应用，部分已经实现产业化。 3 1 大肠杆菌 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 是发现较早的具有较高g a d 活性的微生物。 许多研究者对利用大肠杆菌生产g a b a 进行探讨，由于微生物g a d 是胞内酶， 一般将ec o l i 菌体作为生产g a b a 的酶源，运用基因工程的方法得到高g a d 酶活的ec o l i ，通过固定化ec o l i 细胞制备g a b a ，g l u 的转化率可以达到9 9 ， g a b a 在反应液中浓度高达2 8 0 9 l 一3 0 0 e d l t 5 钔。 赵景联等 5 5 】用海藻酸钙将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1 谷氨酸溶液 进行间歇反应、连续搅拌式反应与连续式反应生产g a b a 。章汝平等酬用以同 样的方法固定化大肠杆菌细胞对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生 产g a b a ，获得了g a b a 含量达到了9 8 9 ，收率为4 9 6 5 。 7 虽然大肠杆菌具有较高的g a d 活力，以大肠杆菌生产g a b a 在得率上具有 较大的优势，但是对于食品工业来说，以大肠杆菌作为生产菌株存在极大的安全 隐患，因此必须需要寻找一些安全性较高的微生物，用于进行g a d 的提取和 g a b a 的生产。 3 2 乳酸菌 乳酸菌( l a c t i c a c i d b a c t e r i a ) 中的不少菌株对人和动物有保健和治疗的功效， 对其代谢和遗传特性及大量临床研究的结果表明，乳酸菌是一有保健作用的益生 菌，因而近年来，人们采用乳酸菌发酵生产y 氨基丁酸。如：徐冬云等阳从土 壤、泡菜和酸奶中分离出一株发酵g a b a 产量达到0 6 4 3 9 l ；崔晓俊等【5 8 】优化 发酵条件使乳酸菌s k 0 0 5 产g a b a 量达到5 4 己。 3 3 红曲霉 红曲米是以中国传统微生物红曲霉( m o n a s c u ss p p 。) 制备而成，已经广泛作 为粗药和用于民间的制醋和酿酒，含有丰富的g a b a 。 表1 1 微生物合成g a b a 的研究概况 t a b l el - 1o u t l i n eo f b i o s y n t h e s i so f g a b ab ym i c r o o r g a n i s m s 红益霉已经在食品生产中获得了长期使用，实践证瞬，除了极少数种由于产 生桔霉素外，多数都比较安全。许多研究者都对其合成g a b a 的能力进行了研 究，见表l l ，如：k o n o 等【5 9 j 对k o j i 制作中m o n a s c u sp i l o s u s 产g a b a 的变化 进行了研究，g a b a 含量达到了1 2 0 t x g g ；s u 等【6 0 】也报道了采用m o n a s c u s p u r p u r e u s 进行固体发酵，g a b a 含量达到了1 2 0 0 m g k g 。 相比而言，化学合成安全性差、环境污染严重，植物富集的含量较低，因而 微生物发酵生产非常具有商业化开发前景。 5 微生物发酵制备g a b a 的影响因素 生物学制备g a b a ，原料来非常广泛，安全链比化学法要高。影响因素都包 括内因和外因，志因是代谢机制，外因是代谢条件。因此，g a b a 支路代谢机制 和代谢条件是g a b a 制备的决定因素。代谢机制一定时，代谢条件显著影响 g a b a 的制备速度和产率。因而微生物发酵制备g a b a 受如下因素制约： 5 。1p h 值 p h 值影响谷氨酸脱羧酶的活性，影响细胞膜得电荷和渗透性以及外界条件 的电位和物理性质。要正确控制和调节p h 值。从茶叶中提取的谷氨酸脱羧酶最 适p h 值在5 8 左右冷引，萝卜叶中提蹴的谷氨酸脱羧酶最适p h 为5 9 。另外g a b a 支路中还有两种酶：g a b a 转氨酶( 最适p h 8 。9 ) 和琥珀酸半醛脱氢酶( 最适p h 9 0 - - 9 。5 ) ，两者使g a b a 快速氧化成谷氨酸和琥珀酸，因此改变p h 值钝化这两种 酶有利于g a b a 的积累【鲫j 。 5 2 辅酶、纂隶l 弃l 等 磷酸吡哆醛是谷氨酸脱羧酶的辅酶，能促进谷氨酸脱羧酶的作用，但使用成 本较高。也可以加入维生素b 6 ( 0 5 m m o l l ) ，可以使g a b a 产量提高2 0 左右 阐。抑制剂有如巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸和对氯高汞苯甲酸等物质， 这类物质会抑制谷氨酸脱羧酸酶活性弧捌，从而降低g a b a 的产量。 9 5 3 温度 温度主要影响酶和微生物的活性及代谢，因此温度必然影响了生物代谢产 g a b a 的能力。 5 4 溶氧 无氧的环境可以增加谷氨酸脱羧酶的活性，抑制丙酮酸转氨酶和琥珀酸半醛 脱氢酶的活性，一般采充二氧化碳或者抽真空来实现。s a w a i 等 7 3 】将新鲜茶叶经 3 h 的隔氧处理后再经1 h 的有氧处理，如此循环重复3 次，可使茶叶g a b a 含量 提高到4 5 m g 1 0 0 9 。 5 5 底物、补料等 合适的谷氨酸浓度可以提高g a b a 支路碳流量，从而促进g a d 活性，但是 前体过多对微生物生长有抑制作用，浓度高时会产生毒性。一般主要是增加前体 物质和营养物质以及无机盐等。利用纯谷氨酸作作为前体，成本较高，一般添加 谷氨酸衍生物如谷氨酸钠或含谷氨酸丰富的其它物质( 例如茶叶、桑叶和米糠) 。 6 展望 随着g a b a 的生理功能研究不断深入，对g a b a 的研究开发已经成为新的 热点。g a b a 的化学合成由于反应条件剧烈，使用化学试剂具有毒性和腐蚀性， 副产物多、缺乏安全性，不适宜作为食品添加剂。生物合成条件温和、安全性高， 因此，以生物合成法生产食品或医药级g a b a 是一条较理想的途径。 以食用植物和粮食进行g a b a 富积，可以实现以这些原料加工的食品的 g a b a 强化，但是其g a b a 含量很低，要从这些原料提取g a b a 作为食品添加 剂非常困难，而且成本高，产量低，具有很大的局限性。 微生物具有生长速度快，生长条件较简单，代谢过程特殊和分布广等特点， 利用微生物中的g a d 催化谷氨酸生产g a b a ，不受资源环境和空间的限制，具 有显著的优点。但是目前普遍存在g a d 活力不高问题，而且大多数报道产g a d 的微生物具有潜在的不安全因素，因此寻找活力高和安全的微生物用于生产 l o g a b a 食品。 因此稠用g a b a 的生成原理，积极开发各种相应的生物物质资源，发扬药 食同源的思想，并且在医学、营养学和食品科学中继续深入研究，将会显著推动 g a b a 的开发和利用。 7 立题背景和主要研究内容 7 1 立题背景 近十余年来，红曲之热从亚洲国家如中国、日本等波及欧美国家与地区，2 0 0 0 年和2 0 0 4 年在杭州举办了两次红魑国际学术研讨会，从一个侧面反应了全球对 红曲的关注。网时随着生活水平的提高，高血压等楣关疾病患者的大量增多，亟 待开发一种降血压效果的保健品。现在的降血压物质很多只能单向降压，而 g a b a 既能降血压，又能使低血压等疾病患者保持正常的血压，具有双向调节作 用。 g a b a 广泛应用于食品、医药等领域，因而g a b a 的制各广受人们的关注 和重视。鉴于当前对g a b a 的制备还有许多基础性的阆题需要解决，因此，加 强这方面的研究很有必要。在这其中，微生物特别是“食品安全级”微生物合成 g a b a 为制备g a b a 提供了一条有效的途径。 目前，微生物制备g a b a 技术主要集中在菌种选育、发酵以及分离工艺等 方面，主要存在以下问题： ( 1 ) 虽然对产g a b a 菌种有一些报道【4 , 5 , 1 0 , i ! , 7 4 ，但大多数菌种g a b a 产量低。 ( 2 ) 报道产g a b a 菌株的菌株，对g a b a 产量的影响因素也不一样，如通 气量润、抑制剂1 7 纠毅、p 、温度、培养基成分等其它因素7 9 谢】，因此发酵条件 需进一步优化，以提高g a b a 的产量。 ( 3 ) 发酵是是一个复杂的过程，研究发酵过程中参数与g a b a 的关系，可以 指导g a b a 的发酵生产，控制生产成本。 7 2 主要研究内容 针对因前g a b a 生产中存在的一些主要问题，主要研究内容包括以下几个 方面：从产g a b a 红曲霉菌种筛选、诱变，生物学特性研究，到发酵条件优化， 分批发酵初探，再针对工业化生产g a b a 遇到的问题，进一步在发酵罐中对 g a b a 的操作条件( 通气量和接种量) 进行了优化等方面开展研究工作。 7 3 技术路线 土筛选 l 产生g a b a 红曲霉曲株 代谢调控、诱变、 基霹王程改良筛选萄 1r l 高产g a b a 菌株 | i _ 。_ _ - - _ - - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ - - - _ _ _ _ - - _ - - - - - - _ - - _ _ 一 上菌种稳定性研究 1 2 第二章红曲霉g a b a 高产菌株的筛选及诱变 红蓝霉( m o n a s c u ss p p 是类十分重要的药用真菌，系中药红趋的基原 菌【8 2 】。红曲在我国的应用距今已有1 0 0 0 多年历史，它是以大米为原料，经曲 霉发酵生产的一种红色独特的米曲，在食品工业中应用极广，可用于烹饪、制 作豆腐乳和酿酒等【8 3 , 8 4 】，治疗疾病，有降血脂、降血压等作用【8 5 郴】。国内已有 以红曲霉为主要成分的中成药如“血脂康”和“地奥脂必妥”等上市应用，且 疗效确切。红曲霉代谢的生理活性物质g a b a 、多糖、麦角固醇、不饱和脂肪 酸、m o n a c o l i nk 等均引起国内外研究者的关注【5 1 , 8 9 2 1 。 本章从中困传统食品红腐乳中分离红塑霉( m o n a s c u ss p p 。) 着手，通过菌 种筛选和诱变等手段获得高产g a b a 的菌株，以期为使用这善中“食品安全级” 红曲霉进行g a b a 的生产以及富含g a b a 的功能性食品、药品的开发提供参 考依据。 1材料 1 1 菌株来源 选用上海红腐乳、米些和果园壤等材料分离纯化红凿霉菌株。 1 2 墙养基 l 。2 1p d a 培养基 马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂粉2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h6 0 。 1 2 2 查氏合成培养基( c z a ) 葡萄糖3 0 9 ，n a n 0 33 9 ，酵母提取物l g ，k 2 h p 0 4l g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 ， k c l0 5 9 ，f e s 0 4 。7 h 2 00 0 1 9 ，琼脂粉2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h6 0 。 l 。2 2 豆芽汁培养基 豆芽2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂粉2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 6 0 。 ( 豆芽煮沸1 0 m i n 后过滤，滤液加2 0 l 葡萄糖即成，固体培养基加2 0 l 琼脂) 1 2 4 种子培养基 葡萄糖5 0 9 ，蛋白胨5 9 ，酵母膏l g ，k h 2 p 0 4l g ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 1 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，水10 0 0 m l ，p h 6 0 。 1 3 仪器与药品 l r h 2 8 0 生化培养箱( 广东医疗器械厂) 、