（内科学专业论文）rhogd12在肺癌中的作用及其调控机制.pdf

目录 i i iiijii f f i ii i l l l l i i i i i i1 0 y 18 4 4 7 6 6 一、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要6 二、英文缩略语1 1 三、论文 论文一 前言。1 2月u 舌 z 材料与方法1 3 实验结果1 6 讨论1 9 结论：2 1 论文二 前言2 7 一_日f f 舌 材料与方法2 2 实验结果2 8 讨论2 9 结论3 0 论文三 前言3 。1日u 吾- j 材料与方法3 2 实验结果3 5 讨论3 9 结论4 1 四、本研究创新性的自我评价4 2 五、参考文献4 3 i ，一c j 6 7 4 5 5 5 绩 成 一研 r 一私 一 一 问 介 期 简 录述学谢人附综在致个 、六 中文论著摘要 r h o g d l 2 在肺癌中的作用及其调控机制 目的 r h o g d l 2 是r h o g d i s 家族成员之一。r h o g d i s 家族是r h o g t p a s e 活化的中 心调节分子，各种蛋白，脂类及酶驱动r h o g d i s 的替换活动，以调节 r h o g t p a s e r h o g d i 之间亲和力的动态变化。r h o g d l 2 是t h e o d o r e s c u 等人最先 在膀胱癌上确定的肿瘤转移相关的因子，在进一步的研究中他们发现，r h o g d l 2 在大多数肿瘤起源的细胞系中的表达水平普遍低于相对应正常组织，r h o g d l 2 在 健康和疾病组织中的功能，效应靶点和生理作用仍不清楚。目前研究表明作为肿 瘤转移相关的因子，r h o g d l 2 的表达水平的变化趋势，在不同类型的肿瘤以及同 类肿瘤的不同研究层面不尽相同。这些研究结果都表明r h o g d l 2 可能和肿瘤的发 生、发展和转移有关，但是之间的确切关系仍然很不清楚，因此引起了人们极大 的关注。 对于肺癌，r h o g d l 2 作为与肿瘤转移相关的因子，在肺癌细胞系，肺癌组织 的具体作用机制，国内外尚无系统研究报道。我们通过免疫组织化学方法、r t p c r 等方法，对r h o g d l 2 在肺癌组织m r n a 和蛋白表达水平的表达进行了的检测； 利用r t p c r 、w e s t e r n b l o t 和免疫荧光方法，对体外培养的不同类型的肺癌细胞 系中r h o g d l 2m r n a 和蛋白表达水平的表达进行了的检测；并利用肺癌生长、侵 袭转移的经典信号通路p 1 3 k a k t m t o r 上特异性的激动剂和拮抗剂，通过w e s t e r n b l o t 等方法来观察r h o g d l 2 蛋白水平的变化，以进一步分析r h o g d l 2 参与肺癌 侵袭转移可能的机制。 方法 1 、材料 1 1 2 例肺癌病例的石蜡切片及相应的临床资料由中国医科大学附属盛京医院 病理科提供。标本经石蜡包埋、标准条件存放，病例标本包含肿瘤组织及癌旁组 织两部分。2 0 例新鲜的肺癌组织及相应癌旁组织取自辽宁省肿瘤医院。术中立即 从原发肿瘤及周围正常肺组织中耿直径约5 - 8 m m 组织块，立即放入液氮中，随后 转入8 0 冰箱保存备用。 人肺腺癌细胞系a 5 4 9 和s p c a 1 、人高转移大细胞肺癌细胞系9 5 d 及小细 胞肺癌细胞系n c i h 4 4 6 购于中科院上海细胞研究所；h e l a 细胞系由中国医科大 学细胞生物教研室惠赠。 2 、免疫组织化学 r h o g d l 2 一抗( 浓度为1 ：1 0 0 稀释) ，阴性对照加p b s 缓冲液，4 。c 冰箱内过 夜。结果判断按s h i m i z u 方法 r l ，对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄 色、棕黄色和棕褐色分别打0 、1 、2 、3 分，着色阳性面积按无着色、着色 2 3 分别打o 、1 、2 、3 分，然后根据两项打分之和判断其结果，分数 3 分为阳性。 3 、r r - p c r 采用t r i z o l 试剂提取肺癌组织中或培养细胞中的总r n a ，利用r n ap c rk i t ( a m v ) 试剂盒进行r t - p c r 。r t - p c r 产物于1 0 琼脂糖凝胶电泳。 4 、细胞培养和分组 人肺癌细胞系均生长于含1 0 胎牛血清的r m p i 1 6 4 0 培养基中，内加1 0 0 u m l 青霉素、1 0 0 1 x g m l 链霉素，置于3 7 。c 、5 c 0 2 、饱和湿度条件下培养，2 - 3d 传 代一次。细胞呈贴壁生长。 r h h g f 处理组：1 0 n g m l 组：3 0n g m l 组。 l y 2 9 4 0 0 2 处理组：5 p , m o l 1 组：2 0 9 m o l 1 组；5 0 p m o l 1 组。 r a p a m y c i n 处理组：10 n m o l 1 组：2 0n m o l 1 组；4 0n m o l 1 组 联合处理组：l y5 9 m o l 1 + r10 n m o l 1 组；l y10 i t m o l 1 + r10 n m o l 1 组 5 、免疫荧光 制备细胞爬片，4 多聚甲醛室温下固定2 0m i n ，加入r h o g d l 2 一抗( 1 ：1 0 0 ) 湿盒4 过夜，避光加入f i t c 标记的山羊抗兔荧光二抗，3 7 孵育3 0m i n ，使 用荧光显微镜观察成像。 6 、w e s t e r nb l o t 将含5 0 9 9 总蛋白的裂解产物进行s d s p a g e 电泳后，转印至p v d f 膜，配 2 制一抗稀释液r h o g d l 2 ( 1 ：2 0 0 ) ，g a p d h ( 1 ：1 2 0 0 0 ) ，将条带用t t b s 略加 清洗后分别放入一抗稀释液中，摇床上室温杂交2 h ，辣根过氧化物酶( h r p ) 标 记的二抗( 1 ：5 0 0 0 ) 摇床上室温杂交1h 后，e c l 法显色。 7 、细胞增殖测定实验 采用m t t 法，取对数生长期的9 5 d 细胞接种于无菌的9 6 孔培养板。实验组 分别加入不同的处理因素，继续培养，加入m t t ( 5 l ) 2 0 “l ，放置孵箱内4 h 后 弃上清加入1 5 0 9 l 的二甲基亚砜( d m s o ) ，震荡1 5m i n ，用全自动酶标仪检测4 9 0 n r 1 处的各孔吸光光度值( o d 值) 。以处理因素量为横坐标，相对增殖细胞数为 纵坐标绘制细胞增殖曲线。 8 、伤口愈合实验 将9 5 d 细胞悬液加入6 孔板，3 7 。c 、5 c 0 2 培养2 4h ，使细胞贴壁。用1 0 9 l 枪头在孔中划一直线后，用p b s 液再冲洗2 次；加入含不同浓度处理因素，以等 量无药培养液为对照，3 7 。c 、5 c o 继续培养每2 小时观察1 次，直至划痕被细 胞填满。 9 、侵袭实验 m a t r i g e l 胶用4 培养液稀释( 1 ：3 ) ，在上室中每室加入2 0 0 “l 细胞悬液 ( 4x 1 0 5 个细胞) ，下室中加入5 0 0r t l 含2 0 f b s 的细胞培养液；3 7 、5 c 0 2 恒温培养2 4h 后，用棉签擦去m a t r i g e l 胶和上层膜面细胞，无水乙醇固定3 0 m i n ， 结晶紫染色5m i n ，光镜下计数穿膜细胞，每膜计算5 个视野，取均值。 1 0 、统计学分析 用s p s s l 3 0 统计包进行统计学分析，当p 0 0 5 时认为有统计学意义。 争士甲 皇口7 k 1 、r h o g d l 2 在人肺癌组织中的表达 ( 1 ) 免疫组化方法显示r h o g d l 2 蛋白在多数肺癌组织中表达低于相对应的 癌旁正常肺组织。肺鳞癌的阳性表达略高于腺癌的表达，但是两者之间差异无统 计学意义( p = 0 2 6 1 ) ；高中分化组阳性率高于低分化组，有显著的统计学意义 ( p o 0 1 ) ；t n m 分期i h 期组阳性率高于i i i 期组阳性率，两者具有显著的 3 统计学意义( p 0 0 1 ) ；有淋巴结转移组阳性率低于无淋巴结转移组，两者具有 显著的统计学意义( p 0 0 5 ) 。 ( 2 ) r t p c r 方法显示r h o g d l 2m r n a 在多数肺癌组织中表达也低于相对 应的癌旁正常肺组织。 2 、r h o g d l 2 在不同类型肺癌细胞系中的表达 在选取的肺癌细胞系a 5 4 9 、9 5 d 、s p c a 1 和n c i h 4 4 6 中，无论m r n a 水 平还是蛋白水平r h o g d l 2 都有表达，但表达水平不尽相同；通过免疫荧光证实 r h o g d l 2 蛋白主要表达在胞浆，细胞核有少量表达。 3 、i m o g d l 2 与p 1 3 刚a 州m t o r 信号通路关系研究 ( 1 ) h g f 促进9 5 d 细胞的增殖，运动迁移和侵袭；而较低浓度p 1 3 k 抑制剂 l y 2 9 4 0 0 2 和m t o r 抑制剂r a p a m y c i n 就能抑制9 5 d 细胞的增殖，运动迁移和侵 袭，联合应用可明显增强这一作用。 ( 2 ) 无血清培养的9 5 d 细胞中r h o g d l 2 蛋白的表达，高于正常1 0 胎牛血 清培养的细胞组，而1 0 胎牛血清培养的细胞组与1 0 n g m lr h h g f 组r h o g d l 2 蛋 白的表达水平相当，但3 0n g m lr h h g f 组r h o g d l 2 蛋白表达明显降低。p 1 3 k 抑 制剂l y 2 9 4 0 0 2 处理组r h o g d l 2 蛋白的表达量增加，且随浓度增加r h o g d l 2 蛋白 表达也增加。m t o r 抑制剂r a p a m y c i n 组，在低浓度时增加r h o g d l 2 蛋白的表达， 但增大r a p a m y c i n 的浓度，r h o g d l 2 蛋白的表达反而降低。低浓度l y 2 9 4 0 0 2 组 和r a p a m y c i n 组联合应用可以明显增加r h o g d l 2 蛋白的表达。 结论 l 、无论m r n a 水平还是蛋白水平，r h o g d l 2 在肺癌组织中的表达水平均低 于相对应的正常肺组织。r h o g d l 2 的表达与肺癌的组织分化、临床分期和是否淋 巴结转移有关，与组织类型，年龄和性别无关。 2 、r h o g d l 2 在肺癌细胞系中仍有低量表达，这表明r h o g d l 2 下游信号通路 可能已被阻断，也更说明r h o g d l 2 在肺癌细胞系恶性生物学特性中受多种因子及 信号通路调节。 3 、p 1 3 眦t m t o r 信号通路中a k t 的活化与r h o g d l 2 密切相关，r h o g d l 2 4 可能直接或间接通过与a k t 的相互作用参与调节肺癌的侵袭转移的过程。 关键词 肺癌；r h o g d l 2 ；p 1 3 k a k t m t o r 信号通路；侵袭；转移 5 英文论文摘要 r o l e sa n d r e g u l a t i o nm e c h a n i s m o fr h o g d l 2i nl u n gc a n c e r p u r p o s e s r h o g d l 2i so n eo ft h et h r e eh u m a nr h o g d i s r h o g d i sa r ep i v o t a lr e g u l a t o r so f r h og t p a s ef u n c t i o n r h o g d i sc o n t r o lt h ea c c e s so fr h og t p a s et o r e g u l a t o r y g u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g ef a c t o r sa n dg t p a s e - a c t i v a t i n gp r o t e i n s ，t oe f f e c t o rt a r g e t s a n dt om e m b r a n e sw h e r es u c he f f e c t o r sr e s i d e r h og t p a s e - r h o g d i sc o m p l e x e sa r e r e g u l a t e db yv a r i o u sp r o t e i n s ，l i p i d sa n de n z y m e st h a te x e ag d id i s p l a c e m e n ta c t i v i t y r h o g d l 2h a sb e e ns h o w nt ob eam e t a s t a s i s - r e l a t e dg e n ei nb l a d d e rc a n c e ra n ds e v e r a l c a n c e r s b u tt h ef u n c t i o n ，e f f e c t o rt a r g e t s ，a n db i o l o g i c a lr o l e so fr h o g d l 2i nh e a l t h a n dd i s e a s ea r ei n c o m p l e t e l yu n d e r s t o o d a sam e t a s t a s i s - r e l a t e dg e n e ，t h ee x p r e s s i o n p a t t e r no fr h o g d l 2v a r i e si nd i f f e r e n tt u n l o r st y p e so rt h et u m o rs t u d i e sb yd i f f e r e n t m e t h o d s r h o g d l 2i s p r o b a b l y r e l a t e dw i t hc a r c i n o g e n e s i s ，d e v e l o p m e n ta n d m e t a s t a s i sb yu n c l e a rr e l a t i o n s h i p a sam e t a s t a s i s r e l a t e dg e n e ，r h o g d l 2h a sn o ts y s t e m i cr e s e a r c h e si nl u n gc a n c e r t i s s u e sa n dc e l ll i n e sy e t i np r e s e n ts t u d y , w ea n a l y z e dt h er o l e sa n dr e g u l a t i o n m e c h a n i s m so fr h o g d l 2i nf o l l o w i n gp o i n t s ： ( 1 ) t h ee x p r e s s i o na n ds i g n i f i c a n c eo fr h o g d l 2i nt h el u n gc a n c e rt i s s u e sb y i m m u n o h i s t o c h e m i s t ym e t h o da n dr t - p c rm e t h o d ( 2 ) t h ee x p r e s s i o na n dl o c a t i o no fr h o g d l 2i nt h el u n gc a n c e rc e l ll i n e sb y i m m u n o f l u o r e s c e n tm e t h o d ，r t - p c rm e t h o da n dw e s t e r nb l o tm e t h o d ( 3 ) t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nr h o g d l 2a n dp 1 3 k a k t m t o rs i g n a l i n gp a t h w a yi n t h el u n gc a n c e rc e l l m e t h o d s 1 m a t e r i a l s 112 p a r a f f i n - e m b e d d e ds p e c i m e n so b t a i n e d f r o ms h e n 由i n gh o s p i t a lo fc h i n a m e d i c a lu n i v e r s i t y ；w h i l e ，2 0f r o z e ns p e c i m e n so b t a i n e df r o ml i a o n i n gp r o v i n c e c a n c e rh o s p i t a l f r e s hs p e c i m e n sa n dc o r r e s p o n d i n gn o r m a lt i s s u es a m p l e sw e r ep u t 6 i n t ol i q u i dn i t r o g e ni m m e d i a t e l ya f t e rr e s e c t i o na n dt h e ns t o r e da t - 8 0 u n t i lt h e e x t r a c t i o no f 剐n aa n dp r o t e i n l u n gc a n c e rc e l ll i n e sa 5 4 9 ，s p c a 一1 ，9 5 da n dn c i - h 4 4 6w e r ep u r c h a s e df r o m s h a n g h a ic e l li n s t i t u t e ，c h i n e s ea c a d e m yo fs c i e n c e s a n dh e l ac e l ll i n ei sag i f to f d e p a r t m e n to f c e l lb i o l o g y ，c h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y 2 i m m u n o h i s t o c h e m i s t y i m m u n o s t a i n i n gw a sp e r f o r m e db yt h es pm e t h o d t h e yw e r ei n c u b a t e dw i t h r h o g d l 2a n t i b o d yo v e r n i g h t f i v ev i e w sw e r ee x a m i n e dp e rs l i d e ，a n d10 0c e l l sw e r e o b s e r v e dp e rv i e w , a t4 0 0 xm a g n i f i c a t i o n l a b e l i n gs c o r e sw e r ed e t e r m i n e db yt h e p e r c e n t a g eo fp o s i t i v ec e l l sp e rs l i d e w ed e f i n er e s u l t sb ys h i m i z u ss t a n d a r d 3 r r - p c r t o t a lr n aw a se x t r a c t e du s i n gt r i z o lr e a g e n ta c c o r d i n gt ot h em a n u f a c t u r e r s i n s t r u c t i o n s r t - p c rw a sp e r f o r m e d 、v i t l lt h er n ap c rk i t ( a m v ) v e r s i o n3 0 ， a c c o r d i n gt ot h em a n u f a c t u r e r si n s t r u c t i o n s r t - p c rp r o d u c t sw e r ea n a l y z e di n 1 a g a r o s eg e l 4 c e l lc u l t u r ea n dg r o u p s a 5 4 9 ，s p c - a - l ，9 5 da n dn c i h 4 4 6c e l l sw e r ec u l t u r e di nr p m i - 16 4 0m e d i u m ， c o n t a i n i n g10 f e t a lc a l fs e r u m ，10 0 i u m lp e n i c i l l i na n d10 0 p g m ls t r e p t o m y c i n t h e c e l l sw e r eg r o w ni nah u m i d i f i e di n c u b a t o ra t37 ca n d5 c 0 2a i ra t m o s p h e r e c e l l s w e r eg r o w no ns t e r i l i z e dc u l t u r ed i s h e sg l a s sa n dw e r ep a s s a g e de v e r y2t o3d a y sw i t h o 2 5 t r y p s i n - e d t a r h h g fg r o u p s ：10 n g m l ；3 0n g m l 。 l y 2 9 4 0 0 2g r o u p s ：5 1 a r n o l 1 ；2 0 i t m o l l ；5 0 i - t m o l l 。 r a p a m y c i ng r o u p s ：10 n m o l l ；2 0n m o l l ；4 0n m o l 1 l y 2 9 4 0 0 2a n dr a p a m y c i nu n i t e dg r o u p s ：l y5 1 ，l m o l l + r1 0 t o o l l ；l yl o i t m o l 1 + r1 0 n m 0 1 1 5 i m m u n o f l u o r e s c e n t p r e p a r e dc e l ls l i d e sw e r ef i x e db y4 p a r a f o r m a l d e h y d ea tr o o mt e m p e r a t u r ef o r 2 0m i n ，a d d i n gr h o g d l 2a n t i b o d y ( 1 ：10 0 ) i nt h ew e tb o xa t4 co v e r n i g h t ；t h e n ， a d d i n gf i t cl a b e l e dg o a ta n t i r a b b i tf l u o r e s c e n ts e c o n d a r ya n t i b o d yi nt h ed a r kr o o m ； 7 a n di n c u b a t e da t3 7 f o r3 0m i n t h er e s u l t sw e r eo b s e r v e db yf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e 6 w e s t e r nb l o t 5 0 1 x gp r o t e i n sw e r es e p a r a t e db ys d s p a g e a f t e rt r a n s f e r r i n gt op o l y v i n y l i d e n e f l u o r i d em e m b r a n e ，t h em e m b r a n ew a si n c u b a t e d2h o u r sa tr o o mt e m p e r a t u r e 丽t 1 1 e i t h e rt h ea n t i b o d ya g a i n s tr h o g d l 2o rg a p d h a f t e ri n c u b a t i o nw i t hh r pl a b e l e d s e c o n da n t i b o d ya tr o o mt e m p e r a t u r ef o r1h o u r s ，t h ep r o t e i n sw e r ev i s u a l i z e du s i n g e c lm e t h o d 7 c e l lv i a b i l i t ya s s a y c e l lv i a b i l i t yw a sd e t e r m i n e du s i n gt h et h ec o n v e r s i o no fm t tt of o r m a z a nv i a m i t o c h o n d r i a lo x i d a t i o n 9 5 dc e l l sw e r ep l a t e di n9 6 一w e l lp l a t e st h ed a yb e f o r et h e e x p e r i m e n ta n dc e l l sw e r et r e a t e dw i t l l d i f f e r e n td r u gg r o u p s a f t e rd r u gt r e a t m e n t ， a t t a c h e dc e l l sw e r ei n c u b a t e dw i t l lm t tf o r4h o u r sa n ds u b s e q u e n t l y15 0 0 1d m s o w a sa d d e dt oe a c hw e l l t h ea b s o r p t i o na t4 9 0 m nw a sm e a s u r e du s i n ga na u t o m a t i c m i c r o p l a t er e a d e r 8 w o u n da s s a y 9 5 dc e l l si n c u b a t e di n6 - 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