人线粒体亮氨酸tRNA结构和功能的研究超嗜热菌亮氨酰tRNA合成酶双亚基的体外重组--优秀毕业论文 可复制黏贴.pdf

中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 博士学位论文 人线粒体亮氨酸trna结构和功能的研究超嗜热菌亮氨酰-trna合 成酶双亚基的体外重组 姓名：郝睿 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：王恩多 20060601 中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1 ) 所呈交的学位论文，是奉人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文 不包含任何其他个人或集体已绛发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贞献的个人和集体，均已在：文中以明确方式标明。 二) 所呈交的学位论叟，实验结果均由相应的实验数据分析得m ，史验数 据真实可靠。 该声明的法律结果由本人承担。 研究生学位论文版权使用授权声明 l _ f 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、使用学位论 史的规定，即：生科院有权保留送交论文的复印件和电子文件，并提供论文的目 录检索及借阅、查阅；生科院可以公布论文的伞部或部分内容，可以将本学位论 丈的仑部或部分内容编入有天数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制 手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名缝导师签名： h 期： 御# 7 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿摘要 摘要 人线粒体亮氨酸t r n a 结构和功能的研究 超嗜热菌亮氮酰t r n a 合成酶双亚基的体外重组 郝睿( 生物化学与分子生物学专业) 导师：工恩多研究员 线粒体性脑肌病，乳酸中毒和中风样发作综合症( m e l a s 症) 足一种罕 见的先天性线粒体d n a 病，有报道指出，位于编码人线粒体t r n a m ( u u r ) 基 因中的五种点突变与m e l a s 症相关。我们构建并转录获得了这些t r n a 突变 体，通过体外的氨基酰化实验，测定了这些点突变对t r n a 接受茎活力的影响。 结果显示，和野生型t r n a 相比，带有这五种点突变的t r n a m f u u r ) 转录子的 氩基酰化水平都宵不同程度的降低。进一步的热稳定性实验证明，氨基酰化水 平虽低的a 3 2 4 3 g 突变体和t 3 2 9 1 c 突变体的结构0 i 稳定。另外，t 3 2 9 1 c 突 变体能够竞争性地抑制野生型t r n a 的亮氨酰化，暗示携带该突变的t r n a 可 能作为一种抑制剂存在于患者的线粒体内。 人线粒体亮氨酸) r n a 的c u n 等受体( h m t r n a h ( c u n ) ) 负责解码线粒 体蛋白质编码系统巾使用频率撮高的密码子，目前有六个致病性点突变被定位 于它的基因内部。本文的体外实验显示，和野生刑的h m t r n a m ( c u n ) 转录子 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿摘要 相比，疾病柏关的u 4 8 c 突变体的氨基酰化水平明显升高，动力学实验也证实 u 4 8 c 突变体更容易被氨基酰化。二级结构分析和结构探测实验均显示，野生 型h m t r n a “( c u n ) 具有比u 4 8 c 突变体更为灵活的结构，这种结构柔性使野生 型t r n a 的t - 茎能够在两种潜存的配对方式之问发生滑动。我们构建，系列 具有特定t _ 萃环结构的h r n t r n a m ( c u n ) 突变体，用米模拟t - 茎滑动到不同阶 段时t r n a 的分子构象。通过研究这螳突变t r n a 的结构和功能，我们发现这 种特殊的t - 茎滑动现象不但能够改变t r n a 的分子构象，还可以调节 h m t r n a “( c u n ) 的接收萃活力，暗示这可能是一种t r n a 分子调节其自身结构 和功i l l l j 新方式。分别将不同的t r n a 分子崮定在微球表面，以此筛选人线粒 体中能够和特定构象的t r n a 相结合的蛋白质，s d s p a g e 电泳图谱上蛋白质 的差肆条带提示我们，t _ 茎滑动受阻影响_ rt r n a 与某些配体分子的结合。这 些发现为我们探索相关疾病的分子机珥! 提供了新研究角度。 超嗜热菌爿q “可ha e o l i c u s 的亮氨酰t r n a 台成酶( 邮l e u r s ) 是已知唯一 朵合的亮氨酰、t r n a 合成酶( l e u r s ) 。本实验在c 【亚基基因编码序列的5 ，端上 游接入寡聚t i i s 标签的编码序列，将带有h i s 基冈的质粒转化大肠杆菌 b l 2 1 ( d e 3 ) r 扣。经过低温下的诱导表达，并用n i n t a 亲和层析柱一步纯化 扶得结构稳定的“亚基融合蛋白。将此n 亚基与b 亚基存体外进行罩组，获得的 重组酶具有催化t r n a 氨皋酰化反应的能力。通过对比不同因素对重组效果 的影响，发现加入尿素可以显著提高重组效率。 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 郝睿摘要 关键词人线粒体；t r n a 帆：氨基酰化；t i 茎滑动；a q u i f e xd e o i c l d s o l b l e u r s ：体外重组 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 郝睿摘要 s t u d yo nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fh u m a n m i t o c h o n d r i a lt r n a h “ nl i t r or e c o m b i n a t i o no ft h et w os u b u n i t so fl e u c y l t r n a a b s t r a c t s y n t h e t a s ef r o ma q u i f e x a e o l i c u s r u ih a of b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o re n - d u ow a n g t h em i t o c h o n d r i a lm y o p a t h y ，e n c e p h a l o p a t h y , l a c t i ca c i d o s i sa n ds t r o k e - l i k e e p i s o d e ss y n d r o m e ( m e i a s ) i sar a r ec o n g e n i t a ld i s o r d e ro fm i t o c h o n d r i a ld n a ( m t d n a ) f i v es i n g l e n u c l e o t i d es u b s t i t u t i o n sw i t h i nt h eh u m a nm i t o c h o n d r i a l t r n a “( u u r ) g e n eh a v eb e e nr e p o r t e dt ob ea s s o c i a t e d w i t hm e l a s h e r ew e p r o v i d e i nv i t r oe v i d e n c et h a tt h ea m i n o a c y l a t i o nc a p a c i t i c s o ft h e s ef i v e h m t r n a 。”( u u r ) t r a n s c r i p t s a r er e d u c e dt od i f f e r e n te x t e n t sr e l a t i v et ot h e w i l d t y p eh m t r n a k “( u u r ) t r a n s c r i p t at h c r m a ld e n a t u r a t i o ne x p e r i m e n ts h o w e d t h a tt h ea 3 2 4 3 ga n dt 3 2 9 1 cm u t a n t s ，w h i c hw e r et h el e a s tc h a r g c db yl e u r s ，h a v e f r a g i l es t r u c t u r e s i na d d i t i o n ，t h et 3 2 9 1 cm u t a n tc a ni n h i b i ta m i n o a c y l a t i o no ft h e w i l d t y p eh m t r n a “( u u r ) i n d i c a t i n g t h a ti t m a ya c t a sa ni n h i b i t o ri nt h e m i t o c h o n d r i a lh e t e r o p l a s m i ce n v i r o n m e n t 4 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 郝睿 摘要 t h eh u m a nm i t o c h o n d r i a lt r n a l l “( c u n ) 0 a m t r n a k “( c u r , 0 ) c o r r e s p o n d st o t h em o s ta b u n d a n tc o d o nf o rl e u c i n ei nh u m a nm i t o c h o n d r i a lp r o t e i ng e n e s h e r e ，n f i f ，口s t u d i e sr e v e a lt h a tt h eu 4 8 cs u b s t i t u t i o ni nh m t r n a l 2 “( c u n ) ，w h i c h c o r r e s p o n d s t ot h e p a t h o l o g i c a l t 1 2 3 1 1 c g e n em u t a t i o n ，i m p r o v e d t h e a m i n o a c y l a t i o ne f f i c i e n c y o fh m t r n a l 8 ”( c u n ) e n z y m a t i cp r o b i n gs u g g e s t e da m o r ef l e x i b l es e c o n d a r ys t r u c t u r ei nt h ew i l dt y p eh m i r n a t 2 。( c u n ) t r a n s c r i p t c o m p a r e dt o t h eu 4 8 cm u t a n t s t r u c t u r a la n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ef l e x i b i l i t yo f h m t r n a t “( c u n ) f a c i l i t a t e s at - s t e ms l i dr e s u l t i n gi n2 p o t e n t i a lt e r t i a r ys t r u c t m - e s s e v e r a lr a t i o n a l l yd e s i g n e dt r n a 。“( c o n ) m u t a n t sw e r eg e n e r a t e dt oe x a m i n et h e s t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lc o n s e q u e n c e so ft h et - s t e ms l i p e x a m i n a t i o no ft h e s e h m t r n a k “( c u n ) m u t a n t si n d i c a t e dt h a tt h et - s t e ms l i p c o u l dc h a n g et h et r n a t e r t i a r ys t r u c t u r e a sw e l la sg o v e r ni t sc h a r g i n ga c t i v i t y t h e s er e s u l t ss u g g e s ta n o v e l ，s e l f - r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo ft r n as t r u c t u r ea n df u n c t i o n d i f f e r e n tt r n a t r a n s c r i p t sw e r eb o u n do nb e a d sr e s p e c t i v c l y , b yw h i c hw es c r e e n e dt r n ab i n d i n g p r o t e i nl f r o mh u m a nm i t o c h o n d d a ，u s i n g t h i sm e t h o d ，w ef o u n da nu n k n o w np r o t e i n t h a tc a nr e c o g n i z es p e c i f i ct r n as t r u c t u r e t h i sr e s u l tc a s t an e wl i g h to nt h e m e c h a n i s mo fr e l a t e dm i t o c h o n d r i a ld i s e a s e 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿摘要 t h ea q u i f e xa e o l i c u sa b - l e u r si st h e o n l y k n o w nh e t e r o d i m e r i c l e u c y l - t r n as y n t h e t a s e t h eh i s 6 一t a g g e d a - s u b u n i tg e n ew a sc l o n e di n t oa n e x p r e s s i o nv e c t o r w h i c hw a st r a n s f e r r e d i n t oec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a f t e rl o w t e m p e r a t u r ei n d u c e de x p r e s s i o n t h es o l u b l eh i s np r o l e i nw a sp u r i f i e di nas i n g l e s t e pb ym e t a l ( n i 2 + ) c h e l a t ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y w em i x e dt h eh i s aa n dp 伽 v i t r oa n df o u n dt h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nr e c o v e r e dl e u c y l a t i o n a c t i v i t y c o m p a r e dw i t h s e v e r a lo t h e rf a c t o r s ，u r e a p r o m o t e s r e c o m b i n a n te f f i c i e n c y o b v i o u s l y k e yw o r d s ：h u m a nm i t o c h o n d r i a ；t r n a l 。“；a m i n o a c y l a t i o n ；t - s t e ms l i p ； a q u i f e ra e o f f c u s ；n b l e u r s ；抽v i t r or e c o m b i n a t i o n 6 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 郝睿第一章 第一部分 第一章某些m e l a s 症相关的点突变导致人线粒体 t r n a 山( u u r ) i 驹氨基酰化降低 摘要人类的多种遗传疾病与线粒体t r n a 基因突变有关，这些突变导致疾病 发生的分子机理是当前研究的热点。线粒体性脑肌病，乳酸巾毒和巾风样发作 综合疵( m e l a s 症) 是线粒体遗传病| e | 勺常见类型，有报道指出，位于编码人 线粒体t r n a l e 。( u u r ) 基因中的五种点突变与m e l a s 症相关。我们构建并转录 获得了这些t r n a 突变体，通过体外的氨基酰化实验，测定了这些点突变对 t r n a 接受萃活力的影响。结果显示，和野生掣t r n a 相比，带有这盘种点突 变的t r n a k “( u u r ) 转录子的氯基酰化水平都有不同程度的降低。进一步的热稳 定性实验显示，氢基酰化水平最低的a 3 2 4 3 g 突变体和t 3 2 9 1 c 突变体的结构 不稳定。另外，t 3 2 9 1 c 突变体能够竞争性地抑制野生型t r n a 的氨基酰化，暗 示携带该突变的t r n a 可能作为一种抑制剂存在于线粒体内。 关键词人线粒体；m e l a s 症相灭突变：t r n a m ( u u r ) ；氨基酰化 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论丈 郝睿第一章 引言 蛋白质的生物合成是所有生命体中一个基本而又重要的过程，它的一个关 键步骤是氨基酸与对应t r n a 分子的共价连接，即t r n a 的氨基酰化反应。在 氨基酰t r n a 合成酶( a m i n o a c y l - t r n as y n t h e t a s e ，a a r s ) 渊的催化下， t r n a 的3 一末端腺苷酸核糖上的2 或37 羟基与其对应氨基酸的a 一羧基之间发生 酯化反应生成氨基酰一t r n a 。氨基酰t r n a 是核糖体生物龠咸蛋白质的原料， 它作为接头分了在核糖体上按照m r n a 卜的遗传密弓合成蛋白质1 1 1 。一般来 说，氨基酰化反应由两步反应完成：首先，氨摹酸攻击a t p 的a 磷酸基团，产 生活化的中问体氨基酰一腺苷酸和焦磷酸；然后，活化的氨基酸被转移到t r n a 的3 术端腺苷酸的核糖上，产生氨基酰t r n a 和a m p 2 。为了保证氨基酰化 反应的精确性，细胞内的a a r s 必须从2 0 种t r n a 中选择对应的t r n a 进行氨 基酰化，i r n a 分子上的个性决定件和个性拮抗元件是确保它们被对应的 a a r s 准确识别的重要因素 3 4 】。细胞中的t r n a 能够高效、准确地被氨基酰化 是蛋白质顺利合成的| j i 提条件， 线粒体是真核细胞中负责能量转换的重要细胞器，它翕有独市于细胞核基 因组之外的少量遗传物质，例如，人线粒体皋因组为含有1 6 5 6 9 个碱基对的环 形舣链d n a ，能够编码和表达与氧化磷酸化相关的少量蛋白质。人线粒体中的 蛋白质翻译系统依赖于2 2 种t r n a ，它们都足由线粒体基因绍中的咂拷贝基因 编码的 5 】。 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿第一章 和原核细胞或真核细胞质中的t r n a 相比，线粒体的t r n a 具有两个显著 的特点，即数量上的低冗余性和结构上的不稳定性。通过d n a 测序，人们已 经住一百多种生物的基因组中发现了超过7 6 0 0 种编码t r n a 的序列f 6 】。在细 胞内组成蛋白质的氨基酸有2 0 种，而t r n a 则有6 0 至7 0 种或更多，能携带同 一种氮基酸但结构不同的t r n a 称为等受体t r n a ，t r n a 数量上的这种冗余性 有助于保持蛋白质翻泽系统的稳定。但在人线粒体中，除了t r n a “和t r n a 锄 具有两种等受体外，其他1 8 种氨基酸分别对应唯一一种t r n a ，任何种t r n a 的功能发牛改变，都可能对线粒体的蛋白质翻译系统造成明显的影响。在结构 方而，j 1 , 3 a 所有的原核生物t i u n a 和真核牛物细胞质中的t r n a 都具有经典的 三叶草形一级结构，并且能够通过进一步的茎环扭转和艮距离三级相互作用 ( 1 0 n g r a n g et e r t i a r yi n t e r a c t i o n s ) 而形成稳定的倒l 形二级结构【7 】。而序列分 析显示，线粒体t r n a 的一级结构中的a u 酣对和不稳定的非w a t s o n c r i c k 配 对( n o n - w a t s o n - c r i c kb a s ep a i r s ) 的含量明显偏高，并且往往具有缩短的环区 和茎区，有些甚至缺失了整个的茎环结构。线粒体t r n a 这种低热力学稳定性 的结构，决定r 他们非常容易到碱是突变f f 馄n t h l 8 。 事实上，在线粒体基质的高氧化环境下，d n a 发生突变的机率比核基因组 高1 0 至1 7 倍1 9 j 。在过去的二f 。年阜，越来越多的位十人线粒体t r n a 基因中 的碱基突变被证明与多种疾病相关 8 】。临床统计研究表明，自9 0 多种致病性 点突变发生在2 1 种线粒体t p d 4 a 的基因中【1 0 】。这些突变对于线粒1 小t r n a 功 1 4 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论丈 郝睿第一章 能的影u m 尤其是对于t r n a 与线粒体a a r s 间相互识别的影响，是当前的研究 热a 2 _ - 。很多科学家尝试通过分析线粒体t r n a 氨基酰化方面的改变，来推 断相关疾病发生的原因。 人线粒体亮氨酸t r n a 的u u r 密码了等受体( h m t r n a h “( u u r ) ) 的基因 何于线粒体基凼组的3 2 3 1 位到3 3 0 5 位之间，是疾病干h 关突变点发生的热点区 域，到目前为f e 已经有2 0 多种致病性突变被定位于这个区域中f 参见 h n p ：l l w w w , m i t o m a p o r g ) 。线粒体性脑肌病，乳酸中毒和中胍样发作综合症 ( m i t o c h o n d r i a lm y o p a t h y ，e n c e p h a l o p a t h y ，l a c t i ca c i d o s i sa n ds t r o k e 1 i k ee p i s o d e s s y n d r o m e ，简称m e l a s 症) 是遗传性线粒体基因病的常见类型，临床表现为 发作性偏头痛、呕吐、癫痫，以及中风样症状，人们对其发生的分子机理还缺 乏了解【1 1 】。临床研究表明，m e l a s 症与位rh 玎l f r n a ( u u r ) 基因中的五种 单核阡酸突变( a 3 2 4 3 g ，a 3 2 5 2 g ，c 3 2 5 6 t , t 3 2 7 1 c ，以及t 3 2 9 l c ) 有关 1 2 1 6 1 ( 图1 ) 。曾经有科学家用转化了特定线粒体突变基冈的细胞株进行体内研究， 发现线粒体基因纽a 3 2 4 3 位的碱基替换能够降低h m t r n a 嘶( u u r ) 的氨基酰化 水平【1 7 1 8 ，而以体外转录的t r n a 为刘象进行的体外研究显示，t 3 2 7 1 c 突 变体被氨基酰化的能力也m 现了降低，只是程度较弱 1 9 1 。山于埘a 3 2 5 2 g ， c 3 2 5 6 t ，和t 3 2 9 1 c 等另外三种m e l a s 症相关碱基突变的影u 向还末见报道， t r n a 功能受损疾病发生之间还没有找到统一的联系。 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿第一章 a 3 2 4 3 g ( a 1 4 g ) cg ，、。a ga ： b gua 产u c f 3 a c c 5 ta g c u - - a t3291cu a 一- - a u ( u 6 0 c ) a uf ：二： uua 箩。l f ( f ? ( i a 名g a gg u u c au a u 一- - a u - a g a 【a 3 2 2 5 1 2 g g ) c ( c 3 2 2 s 5 u 6 t ) aa a 一- - u uc ( t u 3 4 2 。7 1 c c ) 【a 2 l g ) ( c 2 s u ) a u f ：r ( u 4 0 c ) c a o a uaa f i g u r e1 l o c a t i o no fm e l a s - a s s o c i a t e dm u t a t i o n sw i t h i nt h ec l o v e r l e a f s e c o n d a r ys t r u c t u r eo fh u m a nm i t o c h o n d r i a lt r n a k “( u u r ) t h em u t a t i o n sa r ci n d i c a t e dw i t ha r r o w s ，t h en u m b e r sc o r r e s p o n d i n gt ot h e g e n o m i cl o c a t i o n sa r es h o w ni ni t a l i c s ，a n dt h ec o r r e s p o n d i n gs e c o n d a r ys t r u c t u r e l o c a t i o n sa r ep r e s e n t e di nb r a c k e t s 本实验室姚永能等人利用昆虫病毒表达系统确定了人源线粒体亮氨酰 - t r n a 合成酶( h u m a nm i t o c h o n d r i a ll e u c y l t r n as y n t h e t a s e ，h m l e u r s ) 的成熟形 式，并将编码成熟形，的h m l e u r s 的基因片段重组到大肠卡下菌f 西c p r i 曲如 c o l i ，ec o l i ) 的表达质粒r 卜，通过转化ec o l i 受体菌，高表达并纯化了成熟形 式的h m l e u r s 。用此方法得到的h m l e u r s 氨基酰化ec o l it r n a “的比活力 达到1 2 7 7 单位毫克，这是目前报道的具有最高比活力的h m k u r s i 参见姚永 川 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 郝眷第一章 能博十论文】。此高比活力h m l e u r s 的获得为研究疾病相关线粒体t r n a “突 变体的致病机理带来方便。 本文中，我们构建了其他三种带有m e l a s 症相火突变的h m t r n a l “( u u r ) 突变体，分别是a 3 2 5 2 g ，c 3 2 5 6 t ，和t 3 2 9 1 c ，通过研究体外的氨基酰化反应， 我们发现，和野生犁的h m c r na i “( u u r ) 相比，五种m e l a s 症相关的t r n a 突变体接受亮氨酸的能力都山现了不同程度的下降。热变性实验显示，氨基酰 化能。降低最明显的a 3 2 4 3 g 和t 3 2 9 1 c 两种突变体，他们的融解温度( m e l t i n g t e m p e r a t u r e s ，) 相应地出现了显著的下降，说明这两种突变体的结构较野生 型转录子更为脆弱。我们还惊奇地发现，其中的t 3 2 9 1 c 突变体能够竞争性地 抑制野生型h m t r n a m ( u u r ) 的氨基酰化反应，这一发现暗示，在野生型t r n a 和突变体t r n a 共存的异质忭环境( h e t e r o p l a s m i ce n v i r o n m e n t ) 中，这种1t r n a 突变体可能作为抑制剂起作用【2 0 2 1j 。 2材料和方法 2 1材料 l 广亮氨酸，a t p ，d t t ，5 - g m p ，n t p ，s p e r m i d i n e ，无机焦磷酸酶( i n o r g a n i c p y r o p h o s p h a t a s e ，p p a s e ) 购自美幽s i g m a 公司。l - i h c 一亮氦酸购自英国 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 郝眷第一章 a m e r s h a m 公司。g f c 滤纸购自德国w h a t m a n 公司。限制性内切酶为立陶宛 m b i f e r m e n t s 公司产品，t 4 d n a 连接酶为美国p r o m e g a 公司产品，r n a s i n r n a 酶抑制剂为日本t a k a r a 公司产品。t 7 r n a 聚合酶按照本实验室李勇博士的力 法纯化【2 2 】。成熟彤式h m l e u r s 的高表达菌株由本实验室姚永能博士构建 h m l e u r s 按照本实验室发表的文献纯化 2 3 1 。 2 2野生型h m t r n a t 2 “( u u r ) 及其突变体的t 7 体外转录 化学合成的九段寡核苷酸组成了t 7 寤动子、锤头形核酶、h m t r n a l 2 “( u u r ) 基因以及e c o r i 、b a m h l 接头。其中p 1 、p 2 、p 3 、和p 4 组成了编码链，p 5 、 p 6 、p 7 、p 8 、p 9 组成了互补链。 启动子用下划线标出，t r n a 的反密码子用 黑体加粗( t a a ) 表示。这九段寡核苷酸的序列为： p l ：a a t t c 鱼! 叁鱼丛鱼匹至垒旦坠g g g a g a t a a c c t g a t g p 2 ：a g t c c g t g a g g a c g a a a c g g t a c c c g g t a c c g t c g t p 3 ：t a a g a t g g c a g a g c c c g g t a a t c g c a t a a a a c p 4 ；t t a a a a c t l l a c a g t c a g a g g t t c a a t t c c t c t f c r t a a c a c c a g p 5 ：g t l ：c 姐c t c c ( 诮l t a g t g a g t c g t a f f a g c t g p 6 ：g g t a c c g t t t c g t c c t c a c g g a c t c a t c a g p 7 ：t g c g 姐1 a c c g g g c t c t g c c a t c t t a a c g a c g g t a c c g p 8 ：g a a c c t c t g a c t g t a a a g t r l l a a g t r 兀a p 9 ：a a 兀1 c t g g t g l t t a a g a a g a g o a 芦t 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿第一章 p l c 0 rl = = = = = = p 5 p 2p 3p 4 p 6p 7p 8 b “f 1 1 分别将儿段寡核苷酸片段( 2 、3 、4 、6 、7 、8 、9 预先用t 4 寡核凸：酸激酶 将其5 端磷酸化) 各1 0p m o l ，与2 5 0n g 事先经过e c o r i 和b a m h l 酶切的 p t j c l 9 质粒在2 5 l 连接反应体系巾，8 0 。c 加热3 分钟，快速转移到3 7 。c 保 温1 小时，加入3 l1 0 m m o l l a t p 、3g l2 0 m m o l l d t t 、1 单位t 4 d n a 连接 酶，1 6 。c 反应1 0 小时，转化到大肠杆菌d h l 0 b 中。e c o r i 、b a m h ! 酶切鉴 定转化子的质粒，确定j 特有插入片段的质粒，并测定插入片段的d n a 序列， 获得t r n a “基因顺序正确的克隆。用带有突变点的寡核苷酸片段代替相席的 f 常的寡核苷酸片段，用同样的方法获得携带m e l a s 症相关t r n a 突变皋因 ( a 3 2 4 3 g ，a 3 2 5 2 g ，c 3 2 5 6 t ，t 3 2 7 1 c ，以及t 3 2 9 1 c ) ，转化到ec o l i 受体菌中 得到带有的五种t r n a “变种基凶的克隆。 以新构建的质粒为模板，经p c r 扩增出带有h m t r n a h ( u u r ) 基因及m v a i 酶切位j 气的双链d n ：a 。p c r 引物序列如下： p r 7 a ：a g c t a a t a c g a c t c a c l = c 姐1 a p t 7 b ：g a c t c t a g a g g a r c c t g 以m v ai 充分酶剀p c r 产物产牛一g g t 末端，用酚：氯仿：异戊纯( 2 5 ：2 4 ：1 1 抽提去除蛋白质，然后用乙醇、醋酸钠 ) c 淀d n a ，溶丁m i l l i q 纯水中作为转 录模板。转录体系含4 0m mt r i s - h c i ，p h8 0 ，3 0m m m g c l 2 ，4m mn t p , 1m m 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿第一章 g m p , 5 0n m 模板d n a ，1m ms p e r m i d i n e ，0 0 1 ( v v ) t r i t o n x 1 0 0 ，5 0 0u a lt 7 r n a 聚合酶，在3 7 。c 下保温3 小u q ，加入d n a s e i 至终浓度为2 0 u m l ，3 7 。c 继续保温i o 分钟消化d n a 模板，经酚：氯仿：异戊纯抽提去除蛋白质。转录 产物经乙醇、醋酸钠沉淀后，溶j 。5 0m m i r i s h c l ，p h8 ，1 0m mm g c l 2 ，5 5 。c 下温浴3 0 分钟促进锤头形核酶白剪切，用2 0 c m 1 8 c m x 0 1 5 c m 的8m o l l 尿 素- p a g e ( 1 5 ) 充分分离反应，“：物，在紫外灯下割取含有t r n a 组分的胶块 切成小块后浸于含有1 2 5m m n h 4 a c ，0 5 t me d t a ，和0 0 2 5 s d s 的溶液 中，2 5 。c 洗脱4 小时，吸出浸液，用酚：氯仿：异戊纯( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提去除杂质， 加乙醇、醋酸钠沉淀，获得t r n a 转录子。 根据s o h mb 等人义献中的方法，将得到的h m t r n a h ( u u r ) 转录子溶于 1 2m m m g c l 2 ，8 0 。c 热水浴3 分钟，然后迅速转移罕冰上，退火3 0 分钟【1 9 】。 j h 于变性- 复。性( d e n a t u r a t i o n - r e n a t u r a t i o n ) 条件能够在一定程度上影响转录广： 物的折叠情况，我们也尝试了其他几种退火方式，包括改变热水浴的温度和时 问，以及使用缓慢的降温方法，但转录了被氨基酰化水平没有因此产生明显的 差异。r n a 转录子的浓度可以根据以下公式计算得到：浓度c = a 2 h 加- 1 ( e 为各 个t r n a 转录了的消光系数，l 为光程) 。各个r n a 转录子的消光系数e 通过其 核苷酸序列计算得到( 表1 ) 【2 4 1 。 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿第一章 t a b l e1 c a l c u l a t e de x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t sf o re a c hr n a t r a n s c r i p t s w i l dt y p eh m t r n a k u ( u u r ) a 3 2 4 3 g a 3 2 5 2 g c 3 2 5 6 t t 3 2 7 1 c t 3 2 9 1 c 8 0 3 7 4 0 7 9 7 5 6 1 7 9 7 6 6 1 8 0 2 0 2 2 8 0 4 7 3 9 8 0 4 5 2 0 2 3t r n a 转录子接受茎活力的测定 t r n a 转录子的氨基酰化活力与反应时问的关系在3 7o c 测定，经优化 7 0u 1 反应体系含5 0m m h e p e s ，p h7 6 ，2 5m m k c i ，1 0m m m g c l 2 ，2 5m m a t p ，lm m s p e r m i d i n e ，0 5u mr n a s i n ，i 0 0 # g m lb s a ，2 0 州 1 4 q 一亮氨酸 ( 4 0 2c p m p m 0 1 ) ，1 5p ml u n t r n a k “( u u r ) 转录f 。加入1 mh m l e u r s 起始反 应，反应小同时问( 2 分钟，4 分钟，8 分钟，2 0 分钟，3 0 分钟和4 0 分钟) 后 墩出1 0 1 反应液滴加到g f c 滤纸上，放置5 秒钟后将纸片投入含有5m m 亮 氨酸的5 i 氯乙酸中，0 。c 浸泡1 0 分钟，换2 次三氯乙酸，再用9 5 乙醇 浸泡两次，烘十纸片。州p p o p o p o pi = j j 烁液( 1 2 5 9p p o 0 7 5 9p o p o p 溶解于 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文郝睿第一章 2 5 l 甲苯) 进行计数。转录了的氨基酰化水平仵反应丌始4 0 分钟后进入平台期。 测定h m l e u r s 氨基酰化各种h m t r n a h ”( u u r ) 转录子的动力学常数时采 用了与上面相同的条件，只是根据转录产物氨基酰化活力的大小，t r n a 浓度 变化范围分别为1 m 一2 0 m 或2 i m - 4 0 州，所用的h m l e u r s 浓度为0 3 i m 或1u m 。h m l e u r s 氨基酰化各t r n a l e u 转录子的k 。t 和k m 为通过e a d i e h o f s t e e 作图，取二次独立实验结果的平均值。 2 4突变体对野生型t r n a 氨基酰化影响的测定 测定t r n a 突变体对野生型h m t r n a “( u u r ) 氨基酰化反应影响的测定条 件同2 3 只是向含有1 5 肛m 野生型t r n a 的反应体系中加入了不同浓度( o ，1 5 ， 3 ，或4 5 m ) 的a 3 2 4 3 g 或t 3 2 9 1 c 的t r n a 突变体。在3 7 。c ，加入0 3 t m h m l e u r s 起始反应，5 分钟后取1 5 l 反应液进行液州计数。 t 3 2 9 l c 突变体对野生型t r n a 伽( u u r ) 氨基酰化反应的抑制动力学实验存 2 0 , a l i b i 体系中进行。反应体系的离子组成和p h 值同2 3 。往体系阜加入不同浓 度的底物野生型t r n a h ( u u r ) ( 1 ，1 2 5 ，2 ，或5p m ) 和。定浓度的耶2 9 1 c 突 变体( o ，2 ，或5 口m ) 后，再加入0 3 p mh m l e u r s i l g _ 始反应。测定反应速度。 用l i n c w c a v e r - b u r k 作图法确定抑制类型。 2 5各种h m t r n a t 。”( u u r ) 突变体熔点( t m 值) 的测定 中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文 辛f 睿第一章 r n a t m 测定可以根据r n a 在a 2 6 0 的紫外吸收随温度的变化而确定。t m 值的定义为r n a 开始变性的温度( 即a 2 6 0 下紫外吸收曲线的拐点) 。l m l 的测 定体系中含有o d 2 6 0 为0 2 的r n a ，5 0m mh e p e s ，p h7 6 ，2 5m m k c l ，1 0 m mm g c l 2 。温度的变化范围为3 0 争9 0 。c 。所用仪器为带温拧槽的b e c k m a n d u7 4 0 0 分光光度计。 3结果 3 1h m t r n a k ”( u u r ) 变种的构建和转录 为了研究相关疾病发生的分了机理，s o h mb ，等人曾经研究过多种致病性突 变对h m t r n a l 。”u r ) 氨基酰化的