（作物遗传育种专业论文）太谷核不育基因ms2的分子生物学研究.pdf

太谷核不育基因m s 2 的分子生物学研究 摘要 太谷核不育小麦是我国1 9 7 2 年发现的一份珍贵小麦材料，其独特之处主要 表现在：其不育性受显陛单基因摔制，雄州小育彻底，至今未发现一例自交结实 现象；雄性不育稳定，不受环境条件的影响：不育性只受显性基因m s 2 控制， 不受遗传背景的影响。它是世界上发现的第一份小麦显性核不育材料具有巨大 的经济价值和理论研究价值。在此基础上育成的矮败小麦是具有矮秆基因标记的 显性核不育材料，其显性不育基因m s 2 与显性矮秆基因r h t l o 紧密连锁，二者之 恻的连锁交换率不超过01 8 。本研究所用材料为以中国春为轮回亲本连续回交 十二代的矮败中国春小麦近等基因系，该近等摹因系的高杆可育及矮杆不育株除 在育性、株高上存在差异外，其它遗传背景相同，是进行各项分子生物学研究的 好丰爿料。 利用拟南芥中已克隆的雄性核不荇基因m s 2 和水稻中假定雄性不育蛋白的 保守区域，设计埘简并引物m s p ，在太谷核不育小麦可育株及不育株花药中 扩埔h 了一条1 3 4 b p 的片段，序列分析发玑哦片段在可育及不育花药e d n al 剞 没有差异。该序列1 1 三予延伸得到一个睦为1 。6 0 4 b p 的小麦c o n t i g ，序列比较发现 浚拼接c o n t i g 推测编码的氨基酸序列包含有一段由2 0 0 个氨基酸纳成的雄性不 育保守区，与拟南芥核不育蛋白m s 2 和水稻假定雄性不育蛋白同源性分别为8 8 和9 8 。与拟南芥雄性不育蛋白m s 2 相同推测的雄性不育保守区也含有一 个微体结台信号序列：g l y a r g - a l a 。r t p c r 分析表明该拼接c o m i g 只在小麦可 育花药中表达，而在败育花药、叶片和根中不表达，说明该雄性不育同源基因扈 于花药发育特异基因，为太谷核小育基固m s 2 的一个下游基因。本研究表明基 于同源序列的定位候选克隆策略与电子克降技术相结合可人大加快摹因克隆的 速度。 本研究首先试图寻找与太谷核不育基因紧密连锁的分子标记以矮败小麦的 高杆可育及矮卡下不育d n a 为亲本，分别筛选了已定位在小麦4 d 染色体上的1 1 对s s r 引物和4 个r f l p 探针，另外还筛选了人麦、节节麦上的4 个r f l p 探针， 结果这n 对s s r 日l 物和8 个r f l p 探针在可育及不育小麦d n a 问均无差异， 分别选取小麦4 d 染色体短臂上两个顶端区域内的4 条e s t 序列设计4 对p c r 引物，在矮败小麦可育及不育基因组d n a 中进行扩增，结果4 对来自e s t 序列 的p c r j 物在矮致小麦中有较强的扩增带，但在可育及不育材料闻均不表现多 念。 根据比较基因组的共线性原理，推断水稻第三染色体长臀上m s 7 - b c t 区域与 ，j 、麦4 d 染色体短臂上的m s 2 。r h t l 0 嚣域具订可能的共线性。其中水稻b a c 克 隆a c 0 8 7 7 9 7 台有的赤霉酸反应迟钝肇因o s g a i 与小麦4 d sr 的矮丰下基因r h t l o 高度同源，利用该b a c 克隆中的2 2 个假定基因设计2 2 对p c k 引物，在矮败小 麦可育及不育基园组d n a 中进行扩增，有扩增产物的1 6 对引物在可育与不育 基阔组d n a 间扩增条带均无差异。用可育及不育花药e d n a 为探针与水稻2 2 个基因做反向n o r t h e r n 杂交，表明水稻b a c 克隆a c 0 8 7 7 9 7 中的赤霉酸反应巡 钝基因o s g a l 在小麦花药中表达，推断小麦矮打基因r h t i o 在小麦花药中也表 达。 在已有的s s r 引物中，本研究束发现有与太谷核不商基因m s 2 连锁的标记， 为了寻找与m s 2 紧密连锁的s s r 标职，本研究在从e s t 中开发新的s s r 引物方 面进行了尝试。小麦e s t 数量的迅速增加为丌发新的s s r 标记提供了宝费的数 据资源从国际小麦族e s t 协作潮( i t e c ) 上公布的1 0 ，3 8 0 条e s t 序列中检 索刘4 - 4 4 条台有s s r 的e s t 序列，捡出率7 - j41 。其中台二二核营酸重复学元期 三核苷酸重复单元的s s r e s t s 分别为3 4 条( 77 ) 和3 4 7 条( 7 8 ) 。利用这 些小受s s r e s t s 序列建设计l3 5 对c s s r ；| 物。在矮败小麦近等基因系的高杆 可育株和矮杆不育株莲融组d n a 蚓进 亍筛选，其中8 2 对c s s r l 物在小麦上有 扩增产物，占所设计引物总数的6 1 ，但这8 2 对引物在两个亲本问均不表现差 异。利用小麦一套缺体四体系列，3 2 对c s s r 引物分别被定位到小麦除2 d 、4 b 和4 d 外的1 8 条染色体上，丰富了s s r 引物隶源。 为探讨太签核不育小麦败育机制，本文利用e d n a ”a f l p 技术，以太谷核不 育小麦减数分裂开始前的可育株及不育株花药m r n a 为材利，对太谷核不育小 麦败育发生过程中基因的差异表达进行了分析。鳓果表明t 在花药减数分裂开始 前可育花药与不肯花药中基因的表达存在很大差异。在所统计的1 4 4 对引物组 台扩增结果中，在9 0 b p 至6 2 2 1 w 之蒯的扩增条带数共为2 7 1 2 条，平均每对引物 女增出1 8 。8 条带纹。在所筛选的4 6 9 对a f l p 引物组合中，共舂1 9 3 对引物组 合在可育株与不育株问表现多态，筛选出2 3 2 条差异片段。在反向n o r t h e r n 印 迹鉴定的5 0 条差异片段中共有3 0 条为阳性屯隆。对3 0 条阳性克隆进行了序列 测定和同源性比对分析其中2 2 条序列与g e n b a n k 中已知功能基因同源，1 7 条序列在可育花药中特芹表达或表达量高，5 条序列在败育花药中特异表达或表 达量高。2 4 条序列与小麦e s t 同源，这些序列绝大多数来源于小麦减数分裂期 花药的e d n a 文库。其中1 条可育花药特异表达序列与大麦参与成花的 m a d s b o x 保守结构城网源性高选9 4 ，面该序列在败奇花药中不表达。 总之，本研究从小麦e s t 中共丌发新的e s t - s s r s 引物8 2 对其中3 2 对定 位到了小麦具体染色体上，丰富了小麦s s r 标记数量；筛选了( 8 2 + 1 1 ) 共9 3 对s s r 引物，8 个r f l p 探针和2 6 对p c r 引物，但这些引物和探针在矮败小麦 近等基因系阻j 均无差异。利用基于同源序列的候选基因法结台电子克隆技术得到 了一个小麦中的雄性不育同源序列片段，并进行了表达分析。利用e d n a a f l p 技术得到2 3 2 条在可育及不育花蓟间表这有差异的e d n a 片段，对其中3 0 条阳 性克隆片段进行了测序和序列分析，分离出i7 条在可育张药中特异表达或表达 量高的序列，5 条存败育花药中特异表达或表达量高的序列。发现其中1 条可育 花药特异表达序列与大麦参与成花的m a d s b o x 保守结构域同源性高达9 4 ， 丽改序列在败霄花药中巧；表达。分析了太谷拨一；靠小麦花药| 0 雯禽过程中基因的表 达变化，为克隆雄性不商基因，阐明太谷核不育小麦花药败霄的分子机理奠定了 基础。 关键词；太谷核不冉小麦，雄性不蠢，m s 2 撼因，同源序列te s t ，e s t s s r 日 物，分子标记，电子克隆，e d n a a f l p 差异表选 m o l e c u l a rb i o l o g ys t u d i e so ht a i g ug e n i em a l e s t e r i l eg e n em s 2 a bs t r a c t t h et a i g ug e n i cm a l e s t e r i l ew h e a ti so n eo ft h em o s tc h a r a c t e r i s t i cm a l es t e r i l e p l a n t sd i s c o v e r e du pt ot h ep r e s e n t ，w h i c hi sg r e a tv a l u a b l ei ng e n e t i ci m p r o v e m e n tb y i t ss t a b l ei n h e r i t a n c e ，c o m p l e t em a l ea b o r t i o n , a n dh i g hc r o s s f e r t i l i z e r a t e d w a r f i n g s t e r i l ew h e a ti sad w a r f m a r k e dm a l es t e r i l em a t e r i a l ，c a r r y i n gt h ed o m i n a n t g e n em s 2f o rm a l es t e r i l i t ya n dd o m i n a n td w a r f g e n er h t l 0 t h et w og e n e sa r ec l o s e l y l i n k e dt o g e t h e ro nt h es h o r ta r l t lo fc h l o m o s o m e4 d ，w i t ha c r o s s i n g - o v e rv a l u ea s s m a l la so 1 8 t h em a t e r i a lu s e di nt h i ss t u d yw a st h ed w a r f i n g - s t e r i l ec h i n e s e s p r i n gs e p a r a t e di n d i v i d u a li no u rr e s e a r c h ，s e v e r a lt e c h n i q u e ss u c ha sr t - p c r s s 扎 r f l p , e d n a a f l pa n di ns i l i cc l o n i n gw e r eu s e dt oe x p l o r et h ec o - s e p a r a t em a r k e r , o f m a l es t e r i l eg o n e ，c l o nt h em a l es t e r i l eh o m o l o g yg o n ea n dt oi n v e s t i g a t et h ed i f f e r e n c e i ng o n ee x p r e s s i o nb e t w e e ns t e r i l ea n df e r t i l ea n t h e r sd e v e l o p m e n to f t g m s w o n e1 3 4 b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e di nm a l es t e r i l ea n df e r t i l ew h e a ta n t h e r su s i n go n e p a i ro fd e g e n e r a t e dp r i m e rm s pd e s i g n e db a s e do nc o n s e r v e dd o m a i no fm s 2g o n ei n a r a b i d o p s i st h a l i a n aa n dp u t a t i v em a l es t e r i l ep r o t e i no fo r y z as o t i v a ，a n do n e1 ，6 0 4 b p c o n t i gw a se x t e n d e db yi ns i l i c oc l o n i n gb a s e do nt h e13 4 b pf r a g m e n t t h ec o m p a r i s o n o fs e q u e n c ei n d i c a t e dt h a tt h ep u t a t i v ea m i n oa c i de n c o d e db yt h ec o n t i gi n c l u d ea 2 0 0 b pc o n s e r v e dd o m a i no fm a l es t e r i l i t y , a n dt h i sc o n t i ge x p r e s s e di nm a l ef e r t i l e w h e a ta n t h e r s ，n oe x p r e s s i o ni nm a l es t e r i l ea n t h e r s ，l e a v e sa n dr o o t st h i sr e s e a r c h d e m o n s t r a t e dt h a it h em a l es t e i l eh o m o l o g ys e q u e n c ei ss p e c i f i ct ow h e a ta n t h e r d e v c l o p m e n ta n d t h ec o m b i n a t i o no fc a n d i d a t eg e n ec l o n s t r a t e g yb a s e do nt h e h o m o l o g u es e q u e n c ea n d i ns i l i c oc l o n i n gt e c h n i q u ec a na c c e l e r a t e dt h eg e n eo i o n t of i n dm o l e c u l a rm a r k e r st i g h t l yl i n k e dt ot h em a l es t e r i l i t yg o n em s 2o f w h e a t ， 1 is s rm a r k e r so l l4 dc h r o n l o s o l n e ，8r f l pp r o b e s ，4p c rp r i m e r sd e s i g n e df r o m e s to nt i l es h o r ta l t oo fc h r o m o s o m e4 da n d2 2p c rp r i m e r sd e s i g n e df r o mt i l eb a c e l o na c 0 8 7 7 9 7 ，w h i c hw e r el o c a t e do nt h ec h r o m o s o m e3o fr i c e ，w e r es c r e e n e d b e t w e e nt h eg e n o m i cd n ao f m a l es t e r i l ea n df e r t i l ep l a n t so f t g m s w i nt h er e s u l t ， n o n ep o l y m o r p h i s mw e r ef o u n db e t w e e nt h eg e n o m i cd n ao f m a l es t e r i l ea n df e r t i l e p l a n t so f t g m s w , r e v e r s en o r t h e r nb l o t t i n gr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eg e n eo s g a i o f r i c ee x p r e s si nw h e a ta n t h e r s t h eg r o w i n ga v a i l a b i l i t yo fe s ts e q u e n c e si nw h e a tp r o v i d e sep o t e n t i a l l yv a l u a b l e s o u r c eo f n e ws s rm a r k e r si nt h i ss t u d y , 4 4 4s s r - e s t sw e r ei d e n t i f i e df r o m1 0 3 8 0 e s t si nt h ei n t e r n a t i o n a lt r i t i e e a ee s tc o o p e r a t i v ed a t a b a s e ( i t e c ) ，r e p r e s e n t i n g 4i o ft h et o t e ln u m b e ro fe s t s 3 4d i n u d e o t i d er e p e a t sa n d3 4 7t r i n u c l e o t i d e r e p e a t sw e r ef o u n di nt h e s es s r - e s t s r e p r e s e n t i n g7 7 a n d7 8 o ft h et o t a l s s r - e s t s ，r e s p e c t i v e l y1 3 5c s s rp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt os e q u e n c e sf l a n k i n gs s r s f r o m1 7 5s e l e c t e ds s r - e s t s o fw h i c h8 2p r i r n e r sw e r ee f f i c i e n ti nw h e a ta n d3 2 c s s rp r i m e r sw e r el o c a t e do ni8w h e a tc h r o m o s o m e se x c e p t2 d ，4 ba n d4 d i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ed i f f e r e n c ei ng e n ee x p r e s s i o nb e t w e e ns t e r i l ea n df e r t i l e a n t h e rd e v e l o p m e n to ft a i g ug e n i cm a l e - s t e r i l e ( t o m s w ) ，c d n a - a f l pw a s e m p l o y e dt oc o m p a r et h eg e n ee x p r e s s i o ni np r e - m e i o t i ca n t h e r sb e t w e e nt h em a l e s t e r i l ea n df e r t i l ep l a n t so ft o m s wn i l s i nt h i ss t u d ) , 4 6 9p s t b m s e lp r i m e r c o m b i n a t i o n sw e r ea n a l y s e di nd ) n ao f m a l es t e r i l ea n df e r t i l ea n t h e r s ，a sur e s u l t ，a m e a no f188a m p l i f i c a t i o np r o d u c t sw e r ed e t e c t e di m n tt h ea b o v ee d n at e m p l a t e s a l l d2 3 2d i f l b r e n t i a l l ye x p r e s s e dt r a n s c r i p td e r i v e df r a g m e n t sf t d f s lh a v e b e e n i d e n t i f i e d ， ：i f t yd i f f e r e n t i a l l ya m p l i f i e dp c rp r o d e u t ss p e c i f i ct oe i t h e rm a l ef e r t i l eo r s t e r i l ea n t h e r sw e r ee x c i s e df r o mp o l y a c r y l a m i d eg e l s 、i e a m p l i f i e da n dd i r e c t l y s e q u e n c e df o l l o w i n gp u r i f i c a t i o n o t 、t h ef i i t ys e q u e n c e df r a g m e n t s ，t h i r t yw e r e c o n f i r m e db yr e v e r s en o r t h e r nh y b r i d a z a t i o ns e q u e n c ea n a l y s i so ft h ec l o n e dp c r p r o d u c t sr e v e a l e dt h a tt w e n t y - t w o c l o n e ss h o w e ds i g n i f i c a n ts i m i l a r i t yt ok n o w n g e n e si ng e n b a n k ，o fw h i c hs e v e n t e e ns e q u e n c e sw e r es p e c i f i ct oo rs h o w sh i g h e x p r e s s i o ni nm a l ef e r t i l ea n t h e r s ，f i v es e q u a n c e sw e r es p e c i f i ct oo rs h o w sh i g h e x p r e s s i o ni nm a l es t e r i l ea n t h e r s t w e n t y f o u rc l o n e ss h o w e ds i g n i f i c a n ts i m i l a r i t yt o k n o w ne s t si nw h e a t ，m o s to f t h e s ee s ts e q u e n c e sw e r ec o m ef r o mm e i o s i se d n a l i b r a r yas p e c i f i cs e q u e n c ef o rm a l ef e r t i l ea n t h e rs h o w sh i g hh o m o l o g yt oc o n s e r v e d d o m a ir lo f m a d s b o xw h i c hi sh w o l v e di nb a r l e yf l o r a ld e v e l o p m e n t i ns u m m e r y , w ed e v e l o p e d8 2p r i m e r sw h i c hw e r ee f f i c i e n ti nw h e a ta n d3 2c s s r p r i m e r sw e r el o c a t e d0 n1 8w h e a tc h g o u l o s o m e se x c e p t2 d ，4 ba n d4 d ；i d e n t i f i e da m a l es t e r i l eh o m o l o g yg e n eb yc o m b i n i n gt h eh o m o l o g y - b a s e dc a n d i d a t eg a n e m e t h o da n d 协s i l i cc l o n i n gt e c h n i q u e s ；i d e n t i f i e d3 0d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e s d u r i n ga n t h e ra b o r t i o no ft g m s wb ye d n a a f l et h i ss t u d y w i l lf a c i l i t a t et h e u n d e r s t a n d i n go f t h em o l e c u l a ra s p e c t so ft h em a l es t e r i l i t yo f t g m s w k e yw o r d s ：t a i g ug e n i em a l e - s t e r i l ew h e a t ( t g m s w ) ，m a l es t e r i l r y , m s 2g e n e ，e s t , e s t s s r s ，e s s rp r i m e r s ，m o l e c u l a rm a r k e r s ，h o m o l o g ys e q u e n c e ，i ns i l i c oc l o n i n g ， e d n a a f l pd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n 第一章文献综述 1 - 植物花药发育与雄性不育 植物雄性不育( m a l es t e r i l i t y ) 是指植物雄蕊发育由于受到某些内、外因素的影响 而不能产生功能性花粉，使雄性器官丧失生育能力，但这种影响对雌蕊发育的影 响很小或无影响，雌蕊能正常发育和受精的一种不育现象。植物雄性不育在自然 界广泛存在，早在1 7 6 3 年k o l r e u t e r 就观察并报道过这种现象。1 7 8 6 年c o l e m a n 首次引入并使用“雄性不育”概念。据k a u l1 9 8 8 年报道，已经在4 3 科、1 6 2 属、 3 2 0 个种或种问杂种中发现雄性不育( k a u l ，1 9 8 8 ) 。 导致植物雄性不育的因素是多种多样的，被子植物可育花粉的产生，涉及到 大量遗传控制的生理、生化和形态学过程。任何干扰雄蕊发育、孢原细胞分化、 减数分裂、自由小孢子的发育、小孢子有丝分裂、花粉分化和花药开裂等植物花 和雄蕊发育过程的基因突变，都有可能导致植物的雄性不育。这里就植物花和雄 蕊发育及其与雄性不育关系的研究进展情况进行简要综述。 1 1 花的发育 植物经过一定时期的营养生长后，在植物自身因子和光温等环境因子的诱导 下，从营养，土长向生殖生长转变，花的发育( 成花过程) 就是这种转变的重要标 志。花的发育过程有几个阶段：首先是花的诱导过程，此时植物由环境与自身的 因子诱导从营养生长进行到生殖生长，形成花序分生组织( i n f l o r e s c e n c em e r i s t e m ) ， 然后由花序分生组织逐步形成花的分生组织( f l o r a lm e r i s t e m ) ，进而产生花器官原 基，逐步分化为成熟的花器官。 1 , 1 1 花诱导 花的诱导过程是花发育过程中最为关键的一步，该过程一般指植物在一定诱 发条件下从营养生长开始进入生殖生长的关键时期，此过程受阻则不能产生花。 花的诱导过程实际上包括两方面：内外环境等诱导因素的诱发过程和自身发育特 异基因启动表达的决定过程。目前研究花诱导关键基因的方法也是从这两方面分 别进行的：一方面许多植物受到环境因素如日照、温度等和自身的赤霉素、光敏 色素及钙等因素的影响。从对此类诱导因素反应异常的突变体中克隆到的特异基 因可能参与了该诱导反应。拟南芥的开花受日照和温度的影响，其开花期变化的 突变体可分为“早开花”与“迟开花”两类，k o o m n e e f 将得到的迟开花突变体分 为1 2 种不同的座位( k o o m e e f e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，最新克隆得到的l d 基因的突变体表 现为开花延迟，而且光感受能力受影响( l e e ，e ta 1 ，1 9 9 4 ) ，早开花突变体中目前仅 发现h y 3 ( h y p o c o t y l ) 是由光敏色素b 损伤导致的( r e e d e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。另一方面，直接 从生殖发育内在控制基因的突变体入手，该类突变体在无外在诱导因素作用的条 件下，直接由种子开始进入生殖生长。如突变体e m f 在种子萌发期就跨越了营养 生长过程而直接产生了花序分生组织，表明相应的基因e m f 可能是激活营养生长 所必需的，也可能是起抑制芽的顶端生殖状态的作用。因而s u n g 假设基因e m f 产物在拟南芥的幼苗期处于正常水平，随着成长而逐渐减少，从而发生生殖生长 开了花。而长日照有助于减少e m f 基因的产物快速开花( s u n ge t a l ，1 9 9 2 ) 。但目 前e m f 抑制开花的假说尚未有充分的证据。 1 1 2 花分生组织的形成 在拟南芥和金鱼草的突变体中已鉴定出一些与调控花分生组织启动相关的基 因。其中拟南芥的l e s 匆突变体( 简写珈) 和金鱼草的f l o r i c a u l 突变体( 简写f l o ) ， s q u a m o s a ( 简写s q u a ) 的表型都不同程度地出现花序分生组织转变为花分生组织 受阻，丽被次生花序分生组织取代。它们相应的基因上殿a p l ，f l o 和s q u a 也被 克隆出来，其中f l o ，l f y 编码相似的富含p r o 和酸性区域的蛋白，是转录因子的 普遍特征。上，y 的产物还被发现定位于核中( w e i g e l e ta 1 ，1 9 9 3 ) ，更支持了它们是 转录调控因子的假设。a p l 与s q u a 也具有类似转录因子的同源产物。 1 1 3 花器官原基的形成 花发育的基本单位是轮，典型的花是由四轮同心排列的不同类型的器官组成， 从外向里依次为，轮i ( 花萼) 、轮i i ( 花瓣) 、轮i i i ( 雄蕊) 和轮i v ( 心皮) 。模 式植物拟南芥卅r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 和金鱼草翻n t i r r h i n u mm a j u s ) 中，存在a 。b 、 c 三类花器官决定同源异型突变体。a 类突变体，第轮心皮取代萼片，第二轮发 育为雄蕊：b 类突变体，第二轮发育为萼片，第三轮发育为心皮；c 类突变体，第 三轮由花瓣代替，第四轮由萼片代替。而其它轮的器官决定未发生改变。在2 0 世 纪9 0 年代早期，e l l i o t tm e y e r o w i t z 等通过对花器官决定的同源异型突变体的遗传 分析，提出了花器官决定的a b c 模型。这一模型假定：在正常花器官发育过程中， 2 可以产生a 、b 、c 三个功能，每个功能的作用范围与两个相邻的轮吻合。在三个 功能中，a 和b ，b 和c 可以相互重叠，但是a 和c 有拮抗作用，互不重叠。a 功能区包括轮i 和轮i l ：b 功能区包括轮i i 和轮i i hc 功能区包括轮i 和轮i v 。因 此，相应基因也被分为a 、b 、c 三类。a 基因单独表达发育成萼片，a 、b 基因 共同表达发育成花瓣，b 、c 基因共同作用发育成雄蕊，c 基因单独作用决定心皮 的形成。在拟南芥中3 组5 种不同的同源异形基因共同控制着花器官的发育，它 们分别是a 类基因a p e t a l a l 翻p 和a p e t a l a 2 纠j d 乃，b 类基因a p e t a l a 3 似p 3 ) 和p i s t l l l a t a 伊，) ，c 类基因只有爿g 彻俗臼g ) - t o e ，这些基因任何一个 功能缺失或突变都会导致花器官性状的改变。如在a p 2 突变体中，花被器官被生 殖器官替代，而在昭突变体中，生殖器官被花被器官替代。如今，这些基因均已 被克隆。除a p 2 外，都属于m a d s 转录因子家族( c o e n e ta 1 ，1 9 9 1 ；w e i g e le ta 1 ， 1 9 9 4 ；r i e c h m a n n e ta 1 1 9 9 7 ；t h e i s s e ne la 1 2 0 0 0 ) ( 图1 ) 。 b ia 一1 一c l l a p 3 1 p i l ii l p l f a p 2l a g 花萼花瓣雄嚣麟花萼花瓣壤嚣雌蕊 图1 a ，b ，c 功能及其基对花器官的调控模式 f i g 1g e n e t i cm o d e l ss h o w i n g h o w a ，b ，cf u n c t i o n sa n dt h e i rg e n e ss p e c i f ya n df l o w e ro r g a i n s 1 1 4 花发育调控基因的结构特征与作用机制 目的发现调控拟南芥花器官发育的异源同形基因有a p l 、a p 3 、p 1 和a g 及会鱼草的s q u a 、g l o 、d e f 和儿e 。从结构上看这些基因都属于m a d s 基 因盒，它们编码的转录因子调控不同的结构基因表达。这些基因都至少具有两个 保守区域：“m a d s 区”和“k 区”。“m a d s 区”是在比较拟南芥的a g 产物蛋白 与金鱼草d e f a 的产物具有相似性的基础上，发现它们还与人类s r f 因子，酵母 的m c m l 及a r g 8 0 基因产物的部分区域鄙具有极为相似的序列，而取名为： “m a d s 区”( 即m c m l ，a g 和a r g 8 0 ，d e f a ，s r f 的缩写) ( y a n o f s k y e ta 1 ，1 9 9 0 ； s c h w a r z s o m m c re ta 1 ，19 9 0 ) 。 m a d s 基因盒具有5 个明显的结构特点( k r i z e ke ta 1 ，1 9 9 6 ) ：( 1 ) 含有5 6 个氨基 酸残基的保守m a d s 盒，位于转录因子的n 端。( 2 ) 含有半保守的k 区域。k 区 域是一段约由7 0 个氨基酸残基组成的片段，与角蛋i 刍( k e r a t i n ) 部分同源，可能与 形成亲水、脂的两性卷曲螺旋有关，参与调节蛋白质间相互作用，促进二聚体化。 k 区域是植物转录因子的特征结构。( 3 ) 在m a d s 一盒与k 区域之间存在一段约3 1 - 3 5 个氨基酸残基的i 区域，保守性较低，可能帮助二聚体的转录因子与d n a 结合形 成复合体。( 4 ) 非保守的c 端，主要由疏水氨基酸组成，约3 0 个氨基酸残基的长度。 ( 5 ) 富含碱性氨基酸的n 端。但拟南芥a 类基因a p 2 与上述基因不同，它编码2 个高度保守的重复单元的核蛋白，不具有m a d s 盒特征。 实验研究表明，转录因子m a d s 盒蛋白以二聚体状态执行功能。上述转录因 子形成二聚体时，各有其配体专一性。a g 、a p l 形成二聚体时，需m a d s - 盒和部 分i 区参与；而a p 3 和形成二聚体时，除需m a d s 盒、i 区外，还需k 区域的 部分氨基酸参与。这样决定了a p l 、a p 3 、p 1 和a g 之间只能形成3 种二聚 体：a p i a p l 、a g a g 同源二聚体和a p 3 p i 异源二聚体。只有这些二聚体与 d n a 有亲和性，同d n a 结合形成复合体。体外实验证明其它形式的二聚体如 a p 3 a g 、a g - p 1 、a p 3 a p i 、p i a p l 等均不能与d n a 结合。通过嵌合蛋白 研究发现，i 区域在转录因子二聚体一d n a 复合体的形成过程中起重要作用。通过 基因艘f 和m c m l 研究得知，它们通过二聚体作用于被称为c a r g 盒的d n a 靶 序列。在模式植物中进行的实验也证实a g 产物和金鱼草d e f a 及g l o 产物以二 聚体形式同样结合于“c a r g ”盒。新近拟南芥的实验进一步证明只有a g a g 、 a p i 、a p 3 p 1 二聚体才能同d n a 的c a r g 盒结合。 1 2 花药发育 植物的生活周期包括单倍体( 配子体) 和二倍体( 孢子体) 两个阶段，花粉 作为植物雄配子体世代的代表，在开花植物的整个生命过程中起着重要而独特的 作用。在生殖生长期，携带父方遗传信息的花药将精细胞传递到胚囊中的卵细胞 和中央细胞，实现受精过程，完成生命的延续。 花药的发育可以分为两个阶段。在第一阶段，花药的形态已经建立，细胞和 组织发生分化，小孢子母细胞完成减数分裂。在第一阶段末，花药含有大量特化 的细胞和组织，在花粉囊中出现小孢子四分体。第二阶段的主要事件包括：花粉 粒分化，花药变长，花丝伸长而使花药上举，组织解体，花药开裂，花粉粒释放 等( g o l d b e r g e ta 1 。1 9 9 3 ) 。 花药的不同细胞类型是由花分生组织的特异细胞层分化雨来。完成第一阶段 发育的花药由几种特化的细胞和组织构成，有的参与生殖功能，即孢子的发生和 花粉的形成；有的参与非生殖功能，即产生表皮、皮层、绒毡层、环形细胞团、 药隔、裂口和维管束，这些特化的组织分别执行不同的功能，如裂口和环形细胞 参与花药的开裂( b o n n e r e ta 1 ，1 9 8 9 ) ，绒毡层参与花粉壁的形成( p a c i n ie ta 1 ，1 9 8 5 ) ， 药隔将四个花粉囊联结在一起。除了这些二倍体的孢予囊外，花药的花粉囊内还 充满着单倍体的小孢子，后者进而分化成花粉粒( m c c o r m i c k e ta 1 ，1 9 9 1 ；1 9 9 3 ；s c o t t e ta 1 ，1 9 9 1 ；m a s c a r e n h a se ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 花分生组织在花器官决定基因的作用下在第三轮发育为雄蕊原基，雄蕊原基 进一步分化形成花药和花丝。从雄蕊原基形成的花药原始体在结构上十分简单， 外面是一层表皮细胞，表皮之内是一群形状相似、分裂活跃的幼嫩细胞。以后由 于原始体在四个角隅处细胞分裂较快，使原始体呈现出四棱的结构形状，并在每 棱的表皮下出现一个或几个较大的细胞，这些细胞的细胞核大于周围其它细胞， 细胞质也较浓，称为孢原细胞( a r e h e s p o r i a lc e l l ) 。随后孢原细胞经过一次平周分 裂，形成内、外两层细胞，外面的一层细胞称初生壁细胞，又称初生周缘层( p r i m a r y p a r i e t a ll a y e r ) ，初生壁细胞继续进行平周分裂和垂周分裂，形成药室内壁 ( e n d o t h e c i u m ) 、中层( m i d d l el a y e r ) _ 币7 花药绒毡层( t a p e t u r n ) ，这三层细胞和表皮一 起共同组成花药壁。 在花药壁发育的同时，花粉囊内的初生造孢细胞也在进行分裂。多数被子植 物的初生造孢细胞经过几次分裂后形成小孢子母细胞；小孢子母细胞经过两次减 数分裂后，形成周围仍由一层厚厚的胼胝质包围的四分体小孢子；绒毡层细胞逐 渐向外分泌胼胝质酶，分解胼胝质，使4 个小孢子互相分离，然后小孢子进入第 一次不对称有丝分裂，形成两个大小不均等的细胞，其中只含有少量胞质的发育 成生殖细胞，另一个含有丰富细胞质的则发育成营养细胞。小孢子从生殖细胞开 始即被称之为雄配予体。小孢子发育到一定阶段，生殖细胞逐渐进入营养细胞的 细胞质中，营养细胞的中央液泡开始分散以至消失。大多数植物( 被子植物中约 7 0 的科) 的生殖细胞停留在分裂前期或前中期状态，成熟花粉粒只含有两个细胞， 故称为双核花粉，它们的花粉直到萌发后，才在生长的花粉管中进行第二次有丝 分裂，如烟草、棉花和马铃薯的花粉：剩下的约3 0 的植物生殖细胞在花粉粒中 完成两次有丝分裂，成熟花粉为3 一细胞类型，即三核花粉，如玉米、小麦、水稻 的花粉就属于三核花粉。有丝分裂完成后，花粉粒分泌出由纤维素和果胶组成的 内层花粉壁，并开始积累淀粉直到花粉粒中充满淀粉为止，最终脱水至含水量仅 为干重的6 3 5 ，达到成熟状态。成熟花粉粒中积累了大量营养物质，为花粉萌 发和受精奠定了雄厚的物质基础( 朱玉贤等，1 9 9 7 ) 。一旦花粉落到可亲和的雌蕊 柱头，花粉管迅速萌发，穿过胚孔进入胚珠，到达胚囊，完成受精过程。具体过 程见图2 。 竺 鉴 竺 譬 图2 花药药壁细胞和雄配子的来源、发育过程 f i g 2c e l ll i n e a g e sa n dm a j o r e v e n t st h a to c c u r d u r i n g a n t