（分析化学专业论文）烟酸和维生素b1的离子色谱分析.pdf

摘要 摘要 经过三十多年的发展，离子色谱技术的应用越来越广泛。本文首先对离子色谱研究 进展进行了综述，主要包括检测方法、仪器技术及离子色谱在生物医药分析方面的应用， 引用文献7 7 篇。第二章采用离子色谱直接电导法分离测定了烟酸中氯离子和硫酸根离 子的含量。主要考察了流动相组成对分离检测的影响。三种离子的检测限在0 5 0 0 0 2 5 0 0 p g m l 之间，各组分回收率均在9 0 以上。第三章采用离子色谱紫外检测法分离测定维 生素b l 和碱式碳酸铋中的硝酸根离子含量。探讨了不同流动相组成对检测的影响。被 测组份的峰面积与进样浓度呈良好的线性关系，线性相关系数达0 9 9 9 以上，硝酸根检 测限为2 0 0 0 “g m l ，回收率分别为8 2 9 0 和9 6 1 7 。第四章采用反相离子对色谱法 测定了维生素b l 片剂中维生素b l 的含量。考察了流动相组成、有机改进剂含量、离子 对试剂浓度及p h 值对色谱分离的影响。维生素b l 线性相关系数为0 9 9 9 7 ，检测限为 2 0 o o m g l ，回收率为1 0 4 5 。 关键词离子色谱法反相离子对色谱紫外检测烟酸维生素b l a b s t r a c t a b s t r a c t t h r o u g ho v e rt h i r t yy e a r s d e v e l o p m e n t ，t h ei o nc h r o m a t o g r a p h yh a sb e e nu s e dm o r e a n dm o r ew i d e l y i nt h ep a p e r , ar e v i e wo ft h er e c e n tp r o g r e s so fi o nc h r o m a t o g r a p h yw a s g i v e nf i r s t ，i n c l u d i n gd e t e c t i o nm e t h o d s ，t e c h n o l o g yo ft h ea p p a r a t u s ，a n da p p l i c a t i o n si n b i o l o g i c a lm e d i c i n ea n a n l y s i so fi o nc h r o m a t o g r a p h y r e l a t i v er e f e r e n c e sa r e7 7p i e c e s t h e n ， i nt h es e c o n dc h a p t e r , ai o nc h r o m a t o g r a p h ym e t h o do fd i r e c tc o n d u c t o m e t r i cd e t e c t i o nw a s e s t a b l i s h e df o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fc 1 一a n ds 0 4 2 - i nn i c o t i n i ca c i d t h ee f f e c t s o ft h ec o m p o s i t i o no ft h em o b i l ep h a s eo ns e p e r a t i n gd e t e c t i o nw e r ec h i e f l yi n v e s t i g a t e d t h e d e t e c t i o nl i m i t so ft h et h r e ei o n sa r eb e t w e e n0 5a n d2 5 t g m la n dt h er e c o v e r i e so ft h ec 1 。 a n ds 0 4 2 - a r ea b o v e9 0 i nc h a p t e r3 ，a ni o nc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o du s i n gu l t r a v i o l e t d e t e c t i o nw a sp r o p o s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn 0 3 。i nv i t a m i n b la n d b i s m u t h s u b c a r b o n a t e t h ee f f e c to fd i f f e r e n tc o m p o s i t i o no fm o b i l ep h a s e so nd e t e c t i o nw a ss t u d i e d t h ec a l i b r a t i o ng r a p h se x h i b i tw i d el i n e a rc o n c e n t r a t i o nr a n g e sw i t hc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s o fb e t t e rt h a no 9 9 9f o ra l lt h ec o m p o n e n t s ，t h ed e t e c t i o nl i m i to fn 0 3 一i s2 0 1 x g m la n dt h e r e c o v e r i e sa l e8 2 9 0 a n d9 6 17 ，r e s p e c t i v e l y a n di nc h a p t e r4 ，a ni o nc h r o m a t o g r a p h i c m e t h o du s i n gr e v e r s e dp h a s ei o n - p a i rw a sp r o p o s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fv i t a m i n b1 i n v i t a m i nt a b l e t s t h ee f f e c t so ft h ec o m p o s i t i o no ft h em o b i l ep h a s e ，c o n t e n to fo r g a n i c s o l v e n t ，c o n c e n t r a t i o no ft h ei o np a i rr e a g e n ta n dp h v a l u eo i l c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n w e r ei n v e s t i g a t e d t h el i n e a rc o r r e c t i o nc o e f f i c i e n to fv i t a m i n b li s0 9 9 9 7 ，l i m i to fd e t e c t i o n i s2 0 0 0m s la n d r e c o v e r yi s 10 4 5 k e yw o r d s ：i o nc h r o m a t o g r a p h y ；r e v e r s e dp h a s ei o n - p a i rc h r o m a t o g r a p h y ；u l t r a - v i o l e t d e t e c t i o n ；n i c o t i n i ca c i d ；v i t a m i n bl 河北大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了致谢。 作者签名盔墨盔 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密。 ( 请在以上相应方格内打“) 作者签名： 导师签名： 日期：吐钲上月名l 日 日期：丑年上月等日 保护知识产权声明 ( 彦雪 馁) ，是河北大学化学与环境科学学院的( 二。七) 届 (顾士) 研究生。 本人为获得河北大学( 砚返石员士) 学位证书所提交的题目为： ( 焖破夺 伍也泵眵、曲南a 黾汽份竹 ) 的 ( 顽土) 学位论文，是我个人在导师( i 愁连懒指导并与 导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在河北大学所 提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并严格遵 守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北 大学的相关规定。 本人声明如下：本人以任何形式公开和传播科研成果和科研工作时， 包括发表的学术论文、学术交流、科技咨询和科技成果转让等行为时，如 果涉及到本论文所包含的研究内容和研究成果，本人将征得指导教师 ( 懒 教授) 和河北大学的书面同意和授权。如果违反本声明，本人 承担法律责任。 声明人：签名( 章)密；佞 日期) 哆辛，m 第1 章综述 第1 章综述 离子色谱进展及在生物医药分析中的应用 摘要对离子色谱的检测方法、仪器技术及在生物医药分析中的应用等方面的进展进 行了综述，引用文献7 7 篇。 关键词离子色谱；检测器；生物：医药；综述 l j - 一 月l j 吾 离子色谱( i c ) 是高效液相色谱( h p l c ) 的一种。1 9 7 5 年s m a l l 、s t e v e n s 和 b a u m 籼【1 】发表了离子交换色谱电导自动检测方面的文章。该方法采用两根色谱柱，一 根离子交换树脂柱用于分离，另一根“抑制柱”连接于离子交换分离柱之后，通过在抑 制柱中发生的化学反应，除去流动相中高背景电导的离子，降低流动相的背景电导，获 得较高的检测灵敏度。此文章的发表标志着离子色谱法诞生。1 9 7 9 年，c j e r d e 等【2 】提 出另一种离子分离与检测的方法。该方法用低离子强度的弱电解质溶液作流动相，因流 动相本身的背景电导较低，因此不需要用抑制柱就可以用电导检测器直接检测。人们把 这种不用抑制柱的离子色谱分离法称为单柱离子色谱法( s i n g l ec o l u m ni c ) 或非抑制型 离子色谱法( n o n s u p p r e s s e di c ) ，把使用抑制柱的离子色谱法称为双柱离子色谱法 ( d o u b l ec o l u m ni c ) 或抑制型离子色谱法( s u p p r e s s e di c ) 。离子色谱从问世到现在，发生 了很大变化。随着各种新型离子交换柱填料发展，离子色谱技术得到了广泛的应用。现 在离子色谱分析法不仅可以分析无机阴阳离子【3 7 】，也是分析极性有机化合物以及生物 样品中的糖( 单糖、寡糖) 、氨基酸、蛋白质1 1 等的一种常见方法。我国从2 0 世纪 8 0 年代初期引进离子色谱仪，开始了离子色谱的应用研究工作。 近年来，在实际应用的推动下，离子色谱技术发展较快，主要集中在新型检测方 法的研究、高性能分离柱和抑制器的研究、提高自动化程度方面的研究等【1 2 d 4 1 。本文主 要就离子色谱的检测方法、仪器技术及在生物医药分析方面的应用做一简单综述。 1 1 检测方法的研究 离子色谱常用的检测方法可以归为两类，即电化学法和光学法。电化学法包括电导 河北大学理学硕士学位论文 检测器和安培检测器，而光学法主要是紫# b - 可见光吸收检测器和荧光检测器。离子色 谱中最常用的电化学检测器有三种，即电导、安培和积分安培( 包括脉冲安培) 检测器。 电导检测器是离子色谱中使用较为广泛的检测器，主要用于测定无机阴阳离子 ( 蜗 1 5 。三种离子的标样色谱图见图2 1 。 2 2 2 线性方程和检测限 分别精密量取2 0 0 t g m l 的n a c l 、k n 0 3 和n a 2 s 0 4 混合标准溶液，稀释至不同浓 度。在上述色谱条件下，每次进样1 0 u l ，以峰面积y 为纵坐标，以浓度x 为横坐标， 进行线性回归。在各自的浓度范围内，线性关系良好，结果见表2 1 。用此线性方程求 出烟酸原料样品中c 1 一和s 0 4 2 一的含量。c l 一、n 0 3 一和s 0 4 2 一的最低检出浓度( s n 3 ) 分别 为0 5 0 0 0 p g m l 、2 5 0 0 r t g m l 和2 0 0 0 1 工g m l ，可以满足样品中对c l 一和s 0 4 2 一的检测要求。 表2 1 线性方程及检测限 t a b l e2 1l i n e a re q u a t i o n sa n dd e t e c t i o nl i m i t s 2 2 3 精密度和稳定性试验 精密称取烟酸原料药品1 克，用适量二次去离子水提取其中的c 1 一、n 0 3 - 和s 0 4 2 - ， 超声溶解5 分钟，过滤，将滤液定容至4 m l ，其中离子浓度相当于烟酸原料样品中所 含离子浓度的四分之一。测定时直接进此滤液。每次进样1 t l ，日内进样5 次，c l - 、 n 0 3 - 和s 0 4 2 一的r s d 值分别为0 7 8 、3 8 7 和2 9 0 。同样处理方法，每日处理一 份药品，日进样一次，连续5 次，c 1 一、n 0 3 - 和s 0 4 2 - 的r s d 值分别为4 2 2 、1 0 1 和 2 7 3 。 2 2 4 回收率试验 据回归方程，求出烟酸原料样品中c l - 和s 0 4 2 - 的含量。精密称取烟酸原料样品三 1 第2 章离子色谱法测定烟酸中氯离子和硫酸根离子 份，每份1 克，分别加入c 1 一和s o , 2 - 原有量的约8 0 、1 0 0 、1 2 0 。平均回收率如 表2 2 所示。 表2 2 回收率试验结果 t a b l e2 2r e c o v e r i e so ft h ec i a n ds 0 4 2 2 2 5 样品测定 精密称取某批烟酸原料药品1 克，同精密度和稳定性试验处理方法，将滤液定容至 4 m l 。在上述色谱条件下，每次进样1 0 m l ，进样三次，将峰面积平均值代入线性回归 方程，求得其中c r 和s 0 4 2 一的含量。试验结果符合药典要求。另检出其中含有n 0 3 一， 但药典对此未作要求。烟酸原料样品色谱图如图2 2 所示。 04 81 2 t m i n 图2 1 标样色谱图 f i g 2 1c h r o m a t o g r a m so fs t a n d a r d 1 c 1 2 n 0 3 3 s 0 4 2 一 - _ t _ l l 一- _ 一 0481 2 t m i n 图2 2 烟酸原料样品色谱图 f i g 2 2c h r o m a t o g r a m so fn i c o t i n i ca c i dm a t e r i a l 1 烟酸2 c 1 3 n 0 3 4 s 0 4 2 一 1 3 河北大学理学硕士学位论文 2 2 6 讨论 采用基体消除技术对样品进行预处理，测定有机溶剂中的痕量阴离子，已有报道【7 8 】。 采用离子色谱外加酸化学抑制方法，测定有机溶剂中的痕量阴离子也有报道【7 9 1 。用阴离 子交换柱，直接电导检测，同时分析有机酸和无机阴离子，所用淋洗液为邻苯二甲酸氢 钾【8 0 1 以及用n a o h 调节邻苯二甲酸的p h 值得到分析适合的淋洗强度【1 5 1 ，也可用邻苯二 甲酸氢钾和邻苯二甲酸的混合溶液【1 6 】。三羟甲基氨基甲烷是一种可与邻苯二甲酸混合使 用的试剂，向邻苯二甲酸溶液中加入三羟甲基氨基甲烷，既可调节邻苯二甲酸溶液的 p h ，又可得到合适的淋洗强度【8 l 】。本文试验了几组邻苯二甲酸( h 2 v h ) 与三羟甲基氨基甲 烷( t r i s ) 的混合溶液作淋洗液，试验结果如表2 - 3 所示。 表2 3 淋洗液的组成对保留时间的影响 t a b l e2 3e f f e c to f t h ec o m p o s i t i o no fe l u a n to nr e t e n t i o nt i m e s 最后选定以2 o m m o l l 邻苯二甲酸和1 9 m m o l l 三羟甲基氨基甲烷的混合溶液为淋 洗液，在此试验条件下，各离子分离良好。 第3 章维生素b l 和碱式碳酸铋中硝酸根的离子色谱分析 第3 章维生素b ，和碱式碳酸铋中硝酸根的离子色谱分析 化学药品是人们防病治病的重要武器，因此其质量显得尤为重要。人用药品国际协 调会( i c h ) 1 9 9 5 及1 9 9 6 年通过的协调原则中对新合成的原料药和新药制剂中的杂质 规定为：实际合成原料药杂质包括有机杂质( 起始物、副产物、中间体、降解产物、试 剂、配位体、催化剂) 、无机杂质( 试剂、配位体、重金属催化剂、无机盐及过滤介质、 活性炭等) 和溶剂喁2 1 。而这些杂质中，对人体有毒有害或对人体健康有一定影响的物质 均在药品质量分析的范畴内。中国药典2 0 0 5 版( 二部) 中，对维生素b l 和碱式碳 酸铋等，要求检查其中的硝酸盐含量。维生素b l 又名硫胺素，别名为抗神经炎素，是 一种水溶性维生素。碱式碳酸铋是一种无臭无味的白色粉末，在水或乙醇中不溶。医疗 上对胃肠粘膜有保护作用，也略能收敛，用于胃肠道溃疡性疾病和腹泻等，也可用于皮 肤溃疡。药典所载维生素b l 和碱式碳酸铋中硝酸盐的检测方法均为目视比色法，此方 法较为繁琐，而用离子色谱法检测更为准确、有效。本文建立了离子色谱法测定维生素 b l 注射液和碱式碳酸铋中硝酸根含量的方法。 3 1 实验部分 3 1 1 仪器与试剂 仪器：s h i m a d z ul c 10 a t 高效液相色谱仪( 日本) ，s p d 10 a 紫外可见分光检测 器，n 2 0 0 0 双通道色谱工作站( 浙江大学智能信息工程研究所) ；u v - 2 6 5 紫外可见分光 分光光度计( 岛津，日本) ；k q 2 5 0 型超声波清洗器( 江苏昆山淀山湖检测仪器厂) ；8 0 2 离心沉淀器( 上海手术器械厂) 。 试剂：维生素b l 注射液( 山东某药业股份有限公司，批号2 0 0 6 0 3 2 1 ) ；维生素b l 标准品( 天津市华东试剂厂，批号2 0 0 6 0 4 2 0 ) ；碱式碳酸铋原料药品( 河南某药业股份 有限公司，批号2 0 0 6 0 5 2 6 ) ；碱式碳酸铋标准品( 天津市化学试剂公司，批号：2 0 0 6 0 7 3 1 ) 所用溶液均用二次去离子水配制，n 0 3 - 标准溶液用分析纯的k n 0 3 配制。其他所用试 剂均为分析纯。 河北大学理学硕士学位论文 3 1 2 标准溶液的配制 准确称取一定量的k n o s ，配制成2 0 0 0 p 鲈1 1 l 标准储备液( 4 贮存) 。用时稀释 至不同浓度。 3 1 3 色谱条件 色谱柱：s h i m - p a c ki c a l ( 4 6 m m 1 0 0 m m ) ；前置柱：i c g a l ( 4 6 m m 1 0 r a m ) ；检 测维生素b l 中硝酸根含量所用流动相：2 m m o l l n a h c 0 3 ；检测碱式碳酸铋中硝酸根含 量所用流动相：1 0 m m o l ln a 2 c 0 3 + 1 0 m m o l l n a h c 0 3 ( 1 ：1 ) 的混合溶液；o 4 5p m 滤膜 过滤后使用。检测波长为：2 1 0n m ；流速：1 0m l m i m 进样量：l o “l 。定量分析采 用峰面积工作曲线法。 3 2 结果与讨论 3 2 1 流动相组成对维生素b 1 中硝酸根分析的影响 用不同浓度的n a 2 c 0 3 和n a h c 0 3 的混合溶液为流动相紫外检测n 0 3 - 已有报道【4 5 8 3 】，用电导检测n 0 3 一也有报道 8 3 - 8 6 】。我们研究了流动相组成对色谱分离的影响，由于 用紫外可见分光检测器，维生素b l 和n 0 3 一均有紫外吸收。其中，以水作流动相时， n 0 3 - 的保留时间短，与维生素b l 难以分开，且峰形不好。另外考察了不同配比的h c l n a 2 c 0 3 、n a 2 c 0 3 n a h c 0 3 、以及n a 2 c 0 3 、n a h c 0 3 为流动相时维生素b l 和n 0 3 一的分 离情况。结果表明，以不同配比的h c i - n a 2 c 0 3 、n a 2 c 0 3 n a h c 0 3 为流动相时维生素 b l 和n 0 3 一不易分离，以不同浓度的n a 2 c 0 3 为流动相也不易分离，最后选择 2 m m o l l n a h c 0 3 溶液为流动相。在此条件下，维生素b l 和杂质及n 0 3 - 的峰分离良好。 如图3 1 和3 2 所示。 3 2 2 流动相组成对碱式碳酸铋中硝酸根分析的影响 因碱式碳酸铋在水中不溶，也无紫外吸收，故选择流动相组成时只考虑硝酸根的保 留和检测灵敏度即可。考察了不同配比的h c i n a 2 c 0 3 、n a 2 c 0 3 一n a h c 0 3 、以及 n a 2 c 0 3 、n a h c 0 3 为流动相时，n 0 3 - 的保留时间和峰面积情况。结果表明，以1 0 m m o l l n a 2 c 0 3 + i 0 m m o f ln a h c 0 3 ( 1 ：1 ) 为流动相时，n 0 3 一保留时间较短，紫外吸收较大，因 此，最后选择1 0 m m o l l n a 2 c 0 3 + i 0 m m o l l n a h c 0 3 ( 1 ：1 ) 溶液为流动相。如图3 3 所示。 第3 章维生素b 1 和碱式碳酸铋中硝酸根的离子色谱分析 3 2 3 紫外检测波长的选择 3 2 3 1 维生素b ，中硝酸根紫外检测波长的选择 要检测维生素b l 中硝酸盐含量，因维生素b l 和硝酸根离子均有紫外吸收，选择波 长时应尽量使前者灵敏度低后者灵敏度高。在此原则下，我们选择2 t o n m 为合适的紫 外检测波长。 3 2 3 2 碱式碳酸铋中硝酸根紫外检测波长的选择 因碱式碳酸铋在水中不溶，因此要检测碱式碳酸铋中的硝酸根含量，选择波长只考 虑硝酸根的紫外吸收即可。我们考察了不同波长情况下硝酸根的紫外吸收情况。2 0 0 n m 时，n 0 3 峰面积最大，但此时，其他成分的影响也较大。综合考虑，我们选择2 1 0 n m 为合适的紫外检测波长。 3 2 4 线性回归方程 配制一系列不同浓度的k n 0 3 溶液，在上述色谱条件下，每次进样l o p l ，以峰面 积y 为纵坐标，以浓度x 为横坐标，进行线性回归，以峰面积对浓度绘制工作曲线。 表3 1 所示为测定维生素b l 中硝酸根含量的回归方程及线性范围。表3 2 所示为测定碱 式碳酸铋中硝酸根含量的回归方程及线性范围。 表3 1维生素b ，中n o s 一的线性回归方程及线性范围 t a b l e3 1l i n e a re q u a t i o na n dt h ed e t e c t i o n l i m i t so f n 0 3 i nv i t a m i nb 1 表3 2 碱式碳酸铋中n o 。一检测的线性回归方程及线性范围 t a b l e3 2l i n e a re q u a t i o na n dt h ed e t e c t i o nl i m i t so fn 0 3 。o fb i s m u t hs u b c a r b o n a t e 3 2 5 精密度和稳定性试验 取同批次维生素b l 注射液，每次进样1 0 “l ，日内进样5 次，n 0 3 一的r s d 值为 1 9 0 。同样处理方法，日进样一次，连续5 天，n 0 3 - 的r s d 值为3 4 8 。 取同批次碱式碳酸铋原料药，同样品测定中处理方法，每次进样1 0 此，日内进样 - 1 7 河北大学理学硕士学位论文 5 次，n 0 3 - 的r s d 值为2 5 6 。同样处理方法，日进样一次，连续5 天，n 0 3 一的r s d 值为4 5 8 。 3 2 6 回收率试验 3 2 6 1 维生素b ，中硝酸根的回收率试验 据回归方程，求出维生素b l 注射液中n 0 3 - 的含量。精密量取维生素b l 注射液三 份，分别加n 0 3 - 原有量的约8 0 、1 0 0 、1 2 0 。平均回收率如下表3 3 所示。 表3 3回收率试验结果 t ，l b l e3 3r e c o v e r i e so fe x a m i n a t i o nr e s u l t 3 2 6 2 碱式碳酸铋中硝酸根的回收率试验 据回归方程，求出碱式碳酸铋中n 0 3 一的含量。准确称量碱式碳酸铋标样三份，分 别加入其中n 0 3 - 原有量的约