（分析化学专业论文）荧光碳点的合成表征及应用.pdf

中文摘要荧光碳点的合成表征及应用分析化学专业硕士研究生毛小娇指导教师郑鹄志副教授中文摘要量子点的性能优于常见小分子荧光试剂。但量子点具有一定毒性，可能会影响细胞或生物大分子的活性；且量子点的粒径较大，如常见的c d s e z n s 型量子点的直径介于1 8 - - 7a m 之间，修饰后粒径甚至可以达到数十纳米；此外，量子点还有光闪烁现象。这些都限制了它的应用。因此寻找具有相似光学性质的优良纳米材料具有重要意义。最近，科学家制备出一种新型荧光纳米颗粒碳点。与量子点等其他荧光纳米颗粒相比，碳点具有荧光稳定，无光闪烁：激发波长和发射波长可调控；生物相容性好，毒性低；分子量和粒径均很小等优点。本文的主要研究工作有：( 1 ) 以制墨工业的原料一油烟制备碳点，可实现大批量合成荧光碳点，得到的碳点荧光性能良好，粒径较小；用p e g l 5 0 0 n 修饰后，提高了荧光量子产率和荧光寿命。这两种碳点，即钝化前后的碳点，水溶性好，稳定性高，在水中可存放半年以上荧光性能不变。( 2 ) 以本实验室自制的碳点为探针，建立测定c u 2 + 的新方法。铜离子能与带负电的碳点通过静电作用相结合，从而导致碳点荧光的猝灭，并在一定范围内聊值( ，d ，分别指未加猝灭剂和加了猝灭剂后碳点的荧光) 与铜离子浓度呈线性关系。( 3 ) 发现c u 2 + 的加入能导致碳点紫外吸收明显减小，且随着温度的升高猝灭作用逐渐减弱，而荧光寿命没有明显变化，猝灭速率常数值也比典型的动态猝灭速率常数上限值高很多，这些都证明c u 2 + 对钝化碳点荧光的猝灭是由于生成了不发光的基态复合物，属于静态猝灭。( 4 ) 采用1 一乙基一3 一( - - 3 - - - - = 甲基氨丙基) 一碳化二亚胺( e d c ) n 一羟基琥珀亚酰胺( n h s ) 法，以表面为羧基的碳点标记末端氨基修饰的d n a 。标记后碳点的吸收光谱发生变化，荧光强度和荧光寿命不变。关键词：荧光碳点；钝化；c u “；荧光猝灭；d n a 标记a b s t r a c tf l u o r e s c e n tc a r b o nd o t s s y n t h e s i s ，c h a r a c t e r i z a t i o na n da p p l i c a t i o np o s t g r a d u a t em a j o r i n gi na n a l y t i c a lc h e m i s t r y ：m a ox i a o - j i a os u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f z h e n gh u - z h ia b s t r a c tq u a n t u md o t s ( q d s ) a r es u p e r i o rt oc o m m o n l yu s e df l u o p h o r e s ，i n o r g a n i c o r g a n i cd y e s h o w e v e r , t h ep o t e n t i a lt o x i c i t ya n dr e l a t i v el a r g es i z eo fq u a n t u md o t sm a yl i m i ti t su s ei ns o m ef i e l d s t h e r e f o r e ，t h es e a r c hf o rb e n i g nn a n o m a t e r i a l so fs i m i l a ro p t i c a lp r o p e r t i e sc o n t i n u e s r e c e n t l y , f l u o r e s c e n tc a r b o nd o t s ( c - d o t s ) ，an o v e lk i n do fc a r b o n o u sm a t e r i a lh a v eb e e np r e p a r e db ys e v e r a lc h e m i s t s t h e s ec a r b o nd o t ss h o w e dh i g hp h o t o s t a b i l i t ya g a i n s tp h o t o b l e a c h i n g ，t u n a b l ee x c i t a t i o na n de m i s s i o nw a v e l e n g t h ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n dl o wt o x i c i t y , r e l a t i v es m a l ls i z ea n dl o wm o l e c u l a rw e i g h tc o m p a r e dt oq u a n t u md o t sa n do t h e rf l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e s t h em a j o rr e s e a r c hw o r k sa r ea sf o l l o w s ：( 1 ) c o m m e r c i a ll a m p b l a c k ，ap r i m a r ym a t e r i a lo fc h i n e s ei n k ，w a su s e dt op r e p a r ef l u o r e s c e n tc d o t s t h eb a r en a n o p a r t i c l e sh a v eag o o df l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e sa n ds m a l ls i z e a f t e rp a s s i v a t e dt h eb a r ec - d o t sw i t ho o 。一b i s ( 3 一a m i n o p r o p y l ) p o l y e t h y l e n eg l y c o l1 5 0 0 ( p e g i s 0 0 n ) ，b o t ht h ef l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l da n df l u o r e s c e n c el i f e t i m ei m p r o v e d t h e s et w ok i n d so fc a r b o nd o t s ，i e ，b a r ec a r b o nd o t sa n db i s a m i n o - t e r m i n a t e dp o l y e t h y l e n e 哲y c o l ( p e g i s o o n ) p a s s i v a t e dc a r b o nd o t s ，a r eh i g h l yw a t e r - s o l u b l ea n ds t a b l et o w a r dp h o t o - b l e a c h i n g t h e ya r es t a b l ei nw a t e rf o rm o r et h a nh a l fay e a rw i t h o u tf l u o r e s c e n c ed e c r e a s e ( 2 ) a p p l y i n gc d o t sa sf l u o r e s c e n tp r o b e sf o rc u 2 + d e t e r m i n a t i o n c o p p e ri o n sc a l lc o m b i n ew i t ht h en e g a t i v e l yc h a r g e dc a r b o nd o t st h r o u g he l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n ，r e s u l t i n gi nf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go ft h ec a r b o nd o t s ，a n di o iv a l u e ( ，a n d 0a r et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fc d o t si nt h ep r e s e n c ea n da b s e n c eo fc u 抖，r e s p e c t i v e l y )e x h i b i t sal i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fc o p p e ri o n s ( 3 ) ，n l ea d d i t i o no fc u 2 + c a nl e a dt ou va b s o r p t i o no fc d o t sr e d u c e ds i g n i f i c a n t l y ,b u td o n tc h a n g ef l u o r e s c e n c el i f e t i m eo fc - d o t s n eq u e n c h i n ge f f e c td e c r e a s e dg r a d u a l l yw i t hi n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e t h eq u e n c h i n gr a t ec o n s t a n tv a l u ei sm u c hm西雨大学硕士学位论文h i g h e rt h a nt h eu p p e rl i m i to ft y p i c a ld y n a m i cq u e n c h i n gr a t ec o n s t a n t a l lo ft h e s eh a v ep r o v e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fp a s s i v a t e dc a r b o nd o t sb yc u z + i sd u et ot h eg e n e r a t i o no fg r o u n ds t a t en o n - l u m i n o u sc o m p o u n d ，w h i c hb e l o n g st os t a t i cq u e n c h i n g ( 4 ) w a t e r - s o l u b l ec - d o t sw i t hc a r b o x y lo nt h es u r f a c ew e r ec o n j u g a t e dt ot h ea m i n o t e r m i n a t e dd n av i at h er e a c t i o no f1 - e t h y l 一3 一( 3 - d i m e t h y la m i n o p r o p y l )c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ( e d c ) a n dn h y d r o c y l s u l f o - s u c c i n i m i d e ( s u l f o n h s ) a f t e rc o n j u g a t e dw i t hd n a ，t h ea b s o r p t i o ns p e c t r ao fc - d o t sc h a n g e d ，b u tt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n dt h ef l u o r e s c e n c el i f e t i m eh a dn os i g n i f i c a n tc h a n g e s a b s t r a c t ：f l u o r e s c e n tc a r b o nd o t s ；p a s s i v a t e d ；c u 2 + ；f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ；d n al a b e l i n g符弓说明q d sb a r ec d o t sp a s s i v a t e dc d o t sm w c n r ss w c n l xt b a pp e g i s o o np p e i e it t d d ab r 缓冲t e m e d眦e bp ：a g ee d cn h st e ma f 】符号说明量子点未钝化碳点钝化碳点多壁碳纳米管单壁碳纳米管四丁铵高氯酸盐b i s ( 3 - a m i n o p r o p y l ) t e r m i n a t e dp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 )p o l y ( p r o p i o n y l e t h y l e n e i m i n e c o - e t h y l e n e i m i n e )4 ，7 ，1 0 一t r i o x a - 1 ，1 3 t r i d e c a n e d i a m i n eb r i t t o n - r o b i n s o n 缓冲n ，n ，n ，n 四甲基二乙胺t r i s 乙酸溴化乙锭聚丙烯酰胺凝胶电泳1 一乙基3 ( 3 二甲基氨丙基) 一碳化- - i i l i 胺n 羟基琥珀酰亚胺透射电子显微镜原子力显微镜v独创性声明本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。不存在抄袭、伪造等学术不良行为所获的相关内容。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：乇小热签字日期：动胗年。6 月呼日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止) 。学位论文作者签名：毛峋导师签名：智名妻乞签字日期：。均f o 年形月弛日签字日期：p 【d 年b 月工作单位：通讯地址：电话：邮编：妒第1 辛文献综述及前言第1 章文献综述及前言1 1 引言随着科学技术的不断发展，人类的认知不断拓展。2 0 世纪末，一种新的科学技术纳米技术逐渐发展起来，这是一种在纳米尺度上( 0 1 1 0 0r i m ) 研究物质( 包括分子、原子的操纵) 的特性和相互作用，通过组建和利用纳米材料来实现特有功能的高科技先进技术。纳米技术在不断渗透到现代科学技术的各个领域的同时，形成了许许多多与纳米技术相关的研究纳米自身规律的新兴学科。它不仅局限于狭义空间尺度上的意义，而是建立了一种崭新的思维方式、认识方法、研究手段和应用技术【1 3 】。其中，纳米材料是纳米级结构材料的简称。狭义的纳米材料通常指的是纳米颗粒构成的固体材料，其中纳米颗粒的尺寸最多不超过1 0 0 姗。广义的纳米材料是包括二维的纳米薄膜和超晶格等；一维的纳米线、纳米管、纳米棒等；以及零维的纳米粒子。纳米材料的重要意义主要体现在纳米尺寸范围内，其所研究的物质对象将产生许多既不同于宏观物体又与微观粒子有所差别的奇特性质，即通常所讲的纳米效应。导致纳米材料产生奇异性能的主要原因有：表面效应、量子尺寸效应、界面效应和宏观量子效应等睁7 1 。功能纳米材料所具备的各种效应和其独特的性质，使其在各个领域，特别是在生物医学领域中具有很好的应用前景【8 一。其中使用最多的荧光纳米粒子就是量子点( q d s ) i o - 1 5 。量子点是近年来发展起来的一类半导体纳米粒子，可以理解为粒径小于或接近于激子波尔半径的半导体纳米颗粒，是半导体介于分子与晶体之间的一种过渡态，具有独特的光学性质和电学性质，如，荧光强度高，耐光漂白，激发波长范围比较宽，发射峰形比较窄，发射波长可调控等优点 1 6 - 2 i 】。但是量子点的毒性和潜在的环境危害性限制了它的应用 2 2 , 2 3 1 。因此寻找适合于生物标记、疾病探测以及药物输送等生物化学领域中所需的优异纳米材料具有重要意义。碳元素是自然界最丰富的元素之一，也是生命体最重要的组成元素之一。生命体的基本结构单元氨基酸、核苷酸等的骨架都是碳元素组成的，因此碳材料通常对生命体是无毒性或低毒性的。由碳元素组成的碳材料种类繁多，形态各异。如传统的碳材料有炭黑、煤炭、石墨、金刚石等；新型纳米结构碳材料有碳纳米管 2 4 - 2 羽、富勒烯 2 9 - 3 2 】、纳米钻 3 3 - 3 6 j 、纳米碳纤维3 7 锕1 等。碳材料之所以备受青睐，是因为它们在众多领域中应用广泛。例如在环境研究中，纳米碳材料可用作吸附剂，强力流膜( h i g h f l u xm e m b r a n e s ) ，深度过滤器( d e p t hf i l t e r s ) ，抗菌剂，环境传感器和防止污染材料等。在生物学中，碳纳米管可用作抗体识别、核酸序列识别、生物分离和生物催化等。富勒烯可用作神经保护剂、x 射线衍射增强剂和药物载西南大学硕士学位论文体。这些都足目前生命科学、化学科学、物理科学、材料科学等学科中的热点领域。与相应的大颢粒物质相比，这些纳米碳材料具有明显不同的性质但是它们还不是有效的发射体，特别是在可见光区。近年来，已有许多化学家成功台成出另一种新型碳纳米材料，即荧光性能良好的荧光碳点( c d o m ) 。接下来主要介绍有关它们的性质、制各和应用。1 2 碳点的性质、制备与应用12 1 碳点的性质12 1 1 激发光谱宽而连续图l1p e g 锄。钝化的碳点在同一光源激发下，甩固示不同波长带通滤光片形成的荧光成像( 激发波长为4 0 0 a m ) f i g u r e l ia q u e o u ss o l u t i o n o f t h ep e g m a t t a c h e dc a r b o n d o t s ( 0e x c i t e da t4 0 0 【1 1 1 1a n dp h o t o g r a p h e d t h r o u g hb a u d p a s s f i l t e r s o f d i f f e r e n t w a v e l e n g t h sa s i n d i c a t e d h i j有机荧光试剂的激发光谱一般较窄，小同的有机荧光染料所需的激发波长也不同，因此无法实现同步检测。碳点的激发光谱从紫外光区一直延伸至可见光区t能吸收所有比它第一发射波长更短的光，因此可实现一元激发多元发射( 如图l1 ) ，有效简化了实际操作步骤降低了对激发光源的要求。1 2 12 荧光稳定性高有机荧光染料的荧光在持续激发光照射下衰减都比较迅速荧光容易被漂白这在很大程度上限制了它们在生物荧光标记上的应用。而碳点即使反复激发数小时，其荧光强度摹本保持不变，在激光韭聚焦显微分析中也不会出现光漂自现象，因此更适合于长时间的生物体内标记和检测。1 2 13 发射波长可“调谐”不同碳点的光学性质有所不同。其激发光谱相似，但发射光谱截然不同( 如图l2 ) ，这与量子点相似4 引。碳点发射光波长跨度很大，从可见光区直延伸到近红外光区 4 “，从而弥补了普通荧光试剂在近红外光谱区品种少的不足蚓。f “m l ! l467b9鼍舅曼粤，舅舅鼍，葛鼍一谢f _3 0 04 吨口即d 瑚船0 啪w m 啪t a r m围12 碳点的明场成像( 上) 紫外灯照射成像( 中) 荧光发射光谱( 下，3 1 5 m n 激发，最大发射波长如图所示) f 唧m i2 0 p t i c a l i m a g e s i l l u m i n a t e d u n d e r w h i t e ( t o p ) a n d u v l i g h t ( 3 1 2r i m ；c e n t e r ) b o t t o m ：f i n o r e s c e a c ee m i s s i o ns i 眦t r a ( e x c i t a t i o na c3 1 5 m m o f t h ec o r r e s p o n d i n g c d o t ss o l u t i o n st h em a x i m u me m i s s i o nw a v e l e n g t h sa r e i n d i c a t e da b o v e t h es p e c t r a l 4 2 】1 2 i4 生物相窖性好、毒性低已有科学家成功用量子点实现活细胞1 4 6 - ”啪活体成像 5 2 。6 1j 。活细胞或活体中光学成像要求纳米材料尽量无毒性才能不影响细胞或生命体的活性，而传统的荧光量子点含有镉或其它重金属，因此即使浓度很低毒性也较大【6 2 删，容易导致细西南大学硕士学位论文胞死亡。实验结果证明，即使用多种有机聚台物修饰或包覆量子点，还是无法阻止细胞的大量死亡嘟- 6 7 1 。新型荧光纳米材料碳点可以克服这些缺点，是一种很好的环境友好型生物标记替代品。从图1 3 毒性实验可以看出，碳点基本没有毒固1 3 能点的细胞成像图“f i w1 3 c f o c a l m i c r o s c o p y i m a g e s o r ec o l i a t c c 2 5 9 2 2c e l l s l a b e l e d w i t h t h e c - d o t s ：( a )z e x = 4 5 8 t i m , d e t e c t e d w i t h 4 7 5n m l o n g p a s s f i l t e r ；o ) k c _ 4 7 7n l l l ，d e t e c t e d w i t h 5 0 5n m l o n gp a s s f i l t e r ；, ( 0 x 鼎2 4 8 8n m ，d e t e e t e d w i t h 5 3 0 n m l o n g p a s s f i l t e r ；a n d ( 由k ( ：5 1 4 r i m , d e t e c t e dw i t h 5 6 0 h m l o n g p a s s f t l t e r f 4 1 11 2 15 分子量和粒径小传统的有机荧光试剂和量子点的粒径相对都比较大唧删，分子量大都是几十万。碳点的粒径则通常很小只有几个纳米( 如图14 ) ，小的碳点分子量只有几千，大的碳点分子量也只有几万眦7 ”。如此小的碳颗粒很容易通过内吞作用进入细胞内，因此有利于荧光标记和生物成像。厂_卜l 二二圊鞫却9 l 助肌叩善善箬三竺= 兰图1 4 碳点的a f m 成像( a ) 粒径分布( b ) 4 2 1f i g u r e i4 a f ma n a l y s i s o f t h e c - d o t sa ) ar e p r e s e n t a t i v e a f m i m a g eb ) h e i 曲id i s t r i b u t i o no ft h e c d o t s i n f r a c t i o n n u t u b e r 妒q12 2 碳点的制备12 2 l 无机碳源合成路线a 电化学制备法丑1 0 u 等”o 通过电化学方法处理多壁碳纳米管( m w c n t s ) 制各出发蓝光的永溶性碳点。以含四丁铵高氯酸盐( t b a p ) 的脱气乙腈溶液为支持电解质，通过观察电解溶液的颜色来控制电解进度。得到的碳点呈均匀球状，粒径分布很窄( 28 0 5r i m ) 。该碳点有多个发射位点或表面状卷，拉曼光谱显示既有s ，碳，又有不规则碳，晶格结构同石墨类似。尽管这种方法得到的碳点粒径较小，荧光性能也较好( 荧光量子产率可迭0 0 6 4 ) ，但是该方法条件苛刻，制各过程复杂，不利于大批量制备另外重金属电解波的存存阻碍了其进一步在生物领域的应用。2 h o等例通过类似的电化学方法氧化石墨得到两种荧光碳点，即分子量 c e d t t r eo f l u m i a e s c e n t c d o t s i碳水化台物常用来制作碳材料，已有报道通过水热合成法可得到不同结构的碳材料，如胶状球体即i 和纳米纤维。晟近p e n g 等i 恻以碳水化合物为原材料，用浓h 2 s 0 4 脱水，再加入硝酸氧化得到具有微弱荧光的碳纳米颗粒，进一步钝化即得到强荧光碳点( 如图l6 l 。硝酸氧化时间太长，会破坏碳颗粒，因而发射峰位置蓝移，这与c d t e 量子点类似 9 0 ”。研究表明用4 ，7 ，1 0 - t r i o x a 一1 ，1 3 - t r i d e c a n e d i a m i n e ( i q q 3 d a ) 钝化的碳点，比用其它三种钝化试剂( b i s ( 3 一a m i n o p r o p y l ) t e r m i n a t e dp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g t 5 0 0 s ) t 乙撑二胺t 油胺)钝化的碳点荧光量子产率要高。b o u f l i n o s 等m ”懒分解不同柠檬酸铵盐制备粒径d x 于l ot i m 的碳点，其中柠檬酸盐为碳源，有机铵盐作为共价表面修饰剂。通过改变表面修饰基团，可改变碳点的溶解性。亲水性碳点的荧光发射在4 0 0 5 0 0a m 范围内不受激发波长影响。这点与s u n 等【4 1 1 制各的碳点不同。b 微- 艘辅助制备法虽近，a 0 叫等报道了用微波辅助制各碳点的方法。将聚乙烯乙二醇( p e g 2 0 0 ) 和糖类物质溶解到水中，在微波炉中加热处理，即可得到荧光碳点。改变微波处理时间，可以得到币同荧光性能的产物( 如图l7 ) 。该方法也是制备与钝化一步完成，可与h u 等聊1 的激光辅助制各法相媲美。微波辐射加热，操作简学、快速，但是非热效应、超热效应等微波现馨会影响产物的均匀性等性质。+hi i l i c r o w a v e0 1 、h5 m i n1 0 r a i nl ，【，图17 微波辅助制备碳点示意图f i g u r e17 m i c r o w a v ep y r o l y s i sa p p r o a c h f o r p r e p a l i n g c - d o l sc 在模板上制备t ：f 1 2 7 1 s i 0 2c o m p o s i t e sp a s s i v a t i o nir e s o l s：。l _ l _ r e s o l f 1 2 7 s i 0 =c o m p o s i t e sp o l y m e r i z a t i o n- _ _ - - p y r o l y s i sc s i 0 2c o r n p o s l t e se t c h i n 9 j oc a r b o nd o t s曝18 硅球模扳制备碳点示意图l 州f l g u r e1 8 p r o c e s s 啦d i a g r a m f o r t h es y n t h e s i so f m u l o c o l o rp h o t o l u r n i n e s c e n t c - d o t s ”1第1 章文献综述及前言l 血等删将硅胶球体用两性聚合物f 1 2 7 ( e o l 侧p o v o e o 舯m 。= 1 2 6 0 0 ：e o =乙撑氧，p o = 环氧丙烷) 功能化，制备球形p o l y m e r f 1 2 7 s i l i c a 复合物作为载体，可溶性酚醛树脂( r e s o l s ，苯酚甲醛树脂，m w 5 0 0 ) 作为碳前体，高温处理，除去硅载体得到纳米碳颗粒然后酸处理再简单表面钝化得到粒径大小15 25n m的水溶性多色碳点( 如图l8 ) 。该方法的关键是引入袭面活性剂修饰的硅纳米球作为载体，它不仅可以作为酚醛树脂在溶液中聚合的核，还可以避免碳纳米颗粒在高温裂解过程中聚沉。这种合成方法可以在水溶液中进行，设备简单，得到的碳点荧光量子产率较高( 1 i 1 5 ) ，并且受p h 值的影响较小，在p h5 9 范围内，荧光量子产率相差不大，这点与l i u 等m 悃蜡烛灰制得的碳点性能有所不同，后者在中性条件下荧光最强，酸性或碱性条件下荧光都减弱。另外，b o u r l i n o s 等【9 2 1 热氧化适度离子交换( 用2 , 4 一d i a m i n o p h e n o ld i h y d r o c h l o r i d e 进行阳离子交换) 的n a y 沸石得到近似球状的碳纳米颗粒附在沸石外表面( 因变换的阳离子很大无法进入沸石内部) ，沸石的结构和交换性质不变，因此这种混合物结台了沸石和荧光碳点的性质。再用h f 酸刻蚀除去沸石模板得到粒径大小4 6n m 的荧光碳纳米颗粒。在各种模板上合成碳点可以起到固定产物韵作用，同时还可以控制粒径大小但是通常在去掉模板的过程中会影响碳点的粒径和荧光性能等，因此青待改进。1 23 碳点的修饰最初合成出的碳纳米颗粒没有荧光或荧光很弱，一般无法用作荧光标记或生物成像。通常需要经过纯化和修饰处理才能产生荧光或提高荧光性能。就研究现状而言，目前主要采用的修饰方法有表面钝化法，掺杂法和包金属法：i23 1 表面钝化法p e g l 5 。0 n+f r o ms u r f a c e图1 9 p e g l s 刚钝化碳纳米颗粒示童圈1f i g u r e l9 s c h e m a t i c m a po f t h e c - d o t s w i t h p e g i ns p e c i e sa t t a c h e d t o t h es u r f a c e h l纳米碳颗粒可被有机物或聚台物表面钝化，从而提高其荧光性能( 如图l9 ) 。s u n 等”分别用p e g t s o o n - 和p o l y ( p r o p i o n y l e t h y l e t a e i m i n e - c o - e t h y l e n e i m i n e ) ( p p e l - 皿西南大学硕士学位论文钝化激光消融碳靶得到的碳细小颗粒，得到荧光碳点。也可将钝化试剂直接加到反应液中，使制备和钝化同时完成1 8 6 , 9 4 。他们推测钝化原理可能是，钝化试剂填补了碳点表面的缺陷；另一种说法是，由于量子尺寸限域效应，经过有机聚合物修饰后，碳纳米颗粒表面产生了能量势阱，导致了碳纳米颗粒的可见光发射。常见的钝化试剂还有t r d d a 、乙撑二胺、油胺等。这种修饰方法使碳点表面带上氨基，可以同许多含羧基的生物分子相结合，实现生物标记，是目前使用最多的一种修饰方法。1 2 3 2 掺杂法碳点的许多性能优于量子点，但是它们的量子产率( 最高1 5 2 0 ) 相对于核一壳型c d s e z n s 量子点仍然比较低，因此在标记和成像上的应用受到一定限制。s u n 等 9 6 1 在碳点表面钝化前，先掺杂z n s 或z n o ，得到的掺杂后荧光碳点量子产率大大提高，分别可达5 0 、4 5 。填补了碳点荧光量子产率较低的缺陷，其机理可能是与有机钝化试剂一起形成了二次表面钝化，从而有效提高碳点的荧光量子产率。掺杂后的碳点荧光可与核一壳型c d s e z n s 量子点相媲美，已成功用于活体光学成像。1 2 3 3 包金属法it i a n 等【明将碳点溶液中的过渡金属( a g ，c u ，p d ) 盐用抗坏血酸还原成纳米金属材料，生成金属包覆的碳点。他们推测具体反应机理可能是：金属离子通过离子交换或协同反应结合在碳点外表面的羧基上，加入抗坏血酸后，金属离子还原成金属原子，成为纳米金属材料生长的晶种。实验证明，这种金属碳点的结构是纳米碳包裹在纳米金属外表面，而且量子产率比纯碳点( o 4 3 ) 明显提高，分别为3 6 7 ( c a g ) ，6 0 1 ( c c u ) ，3 3 4 ( c p d ) 。这种修饰方法的缺点是，球形金属碳点比纯碳点粒径大很多，三种过渡金属碳点的粒径分别为1 6 4 7 2n m( c a g ) ，1 8 6 4 2n m ( c c u ) ，2 0 44 - 9 3a m ( c p d ) ，而纯碳点的粒径只有4 84 - 0 6n m 。如此大的粒径不利于生物标记和活体成像应用，因此不是很实用。1 2 4 碳点的应用碳点荧光强而稳定，耐光漂白，无光闪烁现象，分子量和粒径都很小，。生物相容性好，毒性低，激发光谱宽而连续，并且可实现一元激发多元发射，是一种非常好的荧光标记与成像试剂。另外，碳点既可用于单光子成像，又可用于双光子成像 9 6 1 ，而双光子激发的穿透力强，无光致毒和光漂白，而且成像对比度高、深度好，因此碳点可望代替量子点成为生物医学领域中最具应用前景的环境友好型纳米材料。1 0第1 章文献综述及前言1 2 4l 体外细胞成像s u n 等和l i u 等嗍将碳点标记大肠杆菌细胞后，通过共聚焦显微成像观测发现，用4 i 同激发波长激发，可发出不同颜色的荧光。碳点表面的钝化试剂，如p e g - 姗n 等对碳点的生物成像应用非常重要，因为它小仅是水溶性的，还可与抗体或其它生物活性分子共轭结合。c a o 等伫3 1 进步将碳点应用到人体乳腺癌细胞的标记中( 如图1 1 0 ) ，并通过双光子荧光显微成像观察，发现碳点可以到达细胞膜和细胞质，不会到达细胞核。碳点从细胞膜外迁移到细胞质和温度有关，4 。c 时细胞内没有碳点。另外，碳点与细胞膜转运肽( 如t a t 人类免疫缺陷病毒衍生蛋白) 耦合以后更客易进入细胞内，因为多肽能克服细胞膜阻碍，加速迁移，从而提高细胞内标记效率。囤1 1 0 碳点在人体乳腺癌细舱中的荧光成像【州f i g u r el1 0 r e p r e s e n t a t i v e t w o - p h o t o n l u m i n e s c e n c e i m a g e ( 8 0 0 e x c i t a t i o n ) o f h u m a o b r e a s tc a r l c e r m c r 7c e l l s w i t h i n t e m a l i z e d c d o d 2 3 11 242 生物体组织的荧光成像和在体观察对体外单细胞进行观察只能了解生物体外的有限信息，更多复杂的问题需要通过活体研究才能解决。碳点的低毒性、良好生物相容性以及一元激发多元发射等特点，为活体研究提供了便利。y a n g 等 ”悯掺杂了z n s 的碳点来示踪其在淋巴管中的迁移。将碳点注入到老鼠前肢，会顺着手臂缓慢迁移至腋下淋巴结( 2 4 小时后做腋下淋巴结切片可观察到相应碳点的荧光) ( 如图11 1 ) 。量子点则通常很快几分钟就可以迁移至腋下淋巴结。可能是因为碳点粒径较小，表面又有抗蛋白特性的p e g 修饰，减少了碳点与淋巴细胞的相互作用。将碳点溶液静脉注射到老鼠体内做整体循环观测结果友现只有膀胱部位可观测到碳点的荧光。说明静脉注射的碳点主要是通过屎液西南大学磺士学位论文排泄，这与p e g 修饰的其它纳米粒子的排泄路径一致阻1 0 0 j 。另外，器官体外成像分析显示，只有肾脏和肝脏中有碳点荧光，且前者荧光更强。由于碳点粒径较小又可以及时通过肾脏排出体外，从而不会导致很强的背景荧光，而且组成成分无毒，整个实验过程中动物投有表现任何毒性反应。因此碳点是一种非常好的活体荧光标记和成像试剂，在生物医学和光学成像领域中有广阔的应用前景。岛=蚤鬲c卫图1 1 1 碳点的在体观察嗍h g t i r e l l l i m e r d e r m a l i n j e c t i o n o f c t m s d o t s ：( 曲b n 【g h t f i e l d , ( b ) a s - d e t e c t e d f l u o r e s c e n c e ，a n d 0 )c o l o r c o d e d i m a g e si n s e t s ：d i s s e c t e d ( i n t h ec i r c l e da r e a ) a x i l a i 。y l y m p hn o d e ( l n 严1 3 论文的出发点和主要工作量子点虽然具有许多优良的荧光性能，并且在生物医学等领域中有一定的应用价值。但是其自身存在的粒径大、毒性大等缺点限制了它的应用。因此寻求性能更加完善的纳米材料作为替代品显得尤为重要。荧光碳点便是在这种需求中应运而生的。碳点具有与量子点相类似的荧光性能而且粒径小，生物相容性好，毒性低，耐光漂白无光闪烁现象等，克f l i t 量子点的种种缺陷，可望代替量子点进行生物标记和荧光成像等研究。但是碳点的研究才刚刚起步，还有许多问题需要解决，因此还有广阔的研究空间。本文主要研究内窖如下：1 ) 合成荧光性能良好的碳点，用有机聚合物将其表面钝亿以提高荧光量子产率。并对其进行荧光显微成像、荧光光谱、荧光寿命和量子产率计算等表征。还考察了溶剂、口h 值、金属离子对碳点荧光的影响。2 ) 金属离子会影响碳点的荧光，其中二价铜离子对碳点的荧光猝灭最稳定而明显。因此系统研究了c u 2 + 离子对碳点荧光的影响，包括实验条件的优化，习习第1 章文献综述及前言荧光量子产率、荧光寿命的测定，以及结合比的计算等。3 ) c u 2 + 离子对未钝化碳点荧光的猝灭比较明显，检测线性也比钝化碳点好，但是猝灭机理复杂，因此用荧光光谱、吸收光谱和荧光寿命等技术系统研究了c u 2 + 离子对钝化碳点的荧光猝灭机理，结果表明，c u 2 + 对钝化碳点的猝灭为静态猝灭；猝灭常数为9 0 x 1 0 4m - 1 ，c u 2 + 与碳点的结合比为6 ：1 。4 ) 用荧光碳点标记d n a ，并用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术证实标记成功。第2 章荧光碳点的合成与表征第2 章荧光碳点的合成与表征2 1 引言小分子荧光染料用作荧光标记物已有较长历史，但这些标记物存在许多缺点，如荧光强度低、容易光漂白等【lj 。荧光纳米粒子克服了这些缺点，并广泛应用于生物医学等领域，例如用于生物或活体标记以及荧光共振能量转移( f r e t ) 等【2 。】。其中使用最多的荧光纳米粒子便是量子点【8 1 4 】( q d s ) 。量子点是近年来发展起来的一类半导体纳米粒子，它具有独特的光学性质和电学性质 1 , 1 5 - 1 9 l ，优于一般的荧光团、有机或无机染料。但最近的研究表明，量子点具有一定毒性，可能会影响细胞或生物大分子的活性【l8 】；且量子点的粒径较大，如常见的c d s e z n s 型量子点的直径介于1 8 7n m 之间，修饰后粒径甚至可以达到数十纳米【1 9 1 ；此外，量子点还有光闪烁现象。这些都限制了它的应用。因此寻找荧光性能更完善的良性纳米材料具有重要意义。碳纳米材料 2 0 - 2 7 l 一直是化学、物理、材料学中的热点领域。近年来，已有几位化学家成功合成出一种新的碳纳米材料荧光碳点【2 8 4 1 。x u 等2 8 1 从单壁碳纳米管( s w c n t s ) 中电泳分离出具有荧光的碳点。随后，s u n 等【2 9 】以石墨粉为原料，制备出荧光性能较好的碳点，并用于多光子成像 3 0 1 。z h o u 等【3 1 1 以电化学方法处理多壁碳纳米管( m w c n t s ) ，l i u 等f 3 2 1 用硝酸氧化蜡烛灰，b o u r l i o n s 等 3 3 , 3 4 1 热氧化有机物，都制备出荧光性能良好的碳点。作为一种新型的荧光纳米材料，碳点具荧光稳定，无光闪烁旧；激发波长和发射波长可调控【2 9 】；生物相容性好，毒性低【3 2 j ；分子量和粒径均很小【3 l 】；合成方法简单易行，操作安全等优点。本文选用制墨工业的原料油烟制备碳点，可实现大批量合成荧光碳点，得到的碳点荧光性能良好，粒径较小；用p e g l 5 0 0 n 修饰后，提高了荧光量子产率和荧光寿命。这两种碳点，即钝化前后的碳点，水溶性好，稳定性高，在水中可存放半年以上荧光性能不变。2 2 实验部分2 2 1 仪器与试剂f - 4 5 0 0 型荧光分光度计( 日本日立公司) ，f l u o r o l o g 一3 荧光光谱仪( 法国h o r i b aj o b i ny v o ni n c ) ，u v 2 4 5 0 型紫外可见分光光度计( 日本岛津公司) ，q 场发射型透射电子显微镜电镜( j e m2 0 1 0 ，j e o l ，日本) ，i x 7 0 荧光倒置显微镜( 日本o l y n p u s 公司) ，z f - 9 0 型暗箱式紫外透射仪( 上海顾村电光仪器厂) ，c a n o na 6 3 0数码相机( 佳能中国公司) ，p h s 3 c 型酸度计( 上海雷磁仪器厂) ，手动可调式移液器( 上海大龙医疗设备有限公司) ，格兰仕w p 8 0 0 t l 2 3 k 3 型微波炉( 中国1 5西南大学硕士学位论文格兰仕微波炉有限公司，功率8 0 0 w ) ，d f - 1 0 1 s 集热式恒温加热磁力搅拌器( 郑州长城科工贸有限公司) ，z 3 8 3 k 高速台式