脊髓灰质炎病毒Sabin2株结构蛋白VP1在昆虫杆状病毒表达系统中的表达.doc

【基础研究】脊髓灰质炎病毒 sabin2 株结构蛋白 vp1 在昆虫杆状病毒表达系统中的表达刘金花董关木安祺曹守春孔艳【 摘要 】 目的 在昆虫杆状病毒表达系统中表达脊髓灰质炎病毒（poliovirus，pv）sabin2 株结构蛋白 vp1。方法从sabin2 疫苗原液中 rt-pcr 扩增 pv 结构蛋白 vp1 基因，克隆入 pfastbac1 质粒，转化含杆状病毒穿梭载体 bacmid 的 e. coli dh10bac，获得重组杆状病毒表达质粒 bacmid-vp1，在脂质体介导下转染 sf9 昆虫细胞，获得重组杆状病毒 rbac-vp1。将第 2 代 rbac-vp1 感染 sf9 细胞，间接免疫荧光法检测 vp1 蛋白的表达，并优化感染条件。结果 重组杆状病毒表达质粒 bacmid-vp1 转 化子可扩增出 3 203 bp 的目的片段；第 2 代 rbac-vp1 的滴度为 6 107 pfu ml，其感染的 sf9 细胞在荧光显微镜下可见绿色荧 光，以不同 moi 的 rbac-vp1 感染 sf9 细胞，vp1 蛋白表达量差别不大，而在 96 h 内，随着感染时间的延长，vp1 蛋白的表达量逐 渐升高。结论 在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达了 pv sabin2 株结构蛋白 vp1，为脊髓灰质炎亚单位疫苗的研制奠定了基 础。【关键词】 脊髓灰质炎病毒；sabin2 株；vp1 蛋白；杆状病毒【中国图书分类号】 r373 2 2 q786 【文献标识码】 a 【文章编号】 1004-5503（2011）06-0625-04expression of structural protein vp1 of poliovirus sabin2 strain in insectbaculovirus expression systemliu jin-hua，dong guan-mu，an qi，cao shou-chun，kong yan（national institutes for food and drug control，beijing 100050，china）【abstract】 objective to express the structural protein vp1 of poliovirus（pv）sabin2 strain in insect baculovirus expression system methods vp1 gene was amplified by rt-pcr from the bulk of pv vaccine prepared with sabin2 strain，and cloned into vector pfastbac1 the constructed recombinant plasmid pfast-vp1 was transformed to e coli dh10bac carrying baculovirus shuttle plasmid bacmid，and the obtained recombinant plasmid bacmid-vp1 was transfected to sf9 insect cells in mediation of liposome to prepare recombinant baculovirus rbac-vp1 the sf9 cells were infected with rbac-vp1 of passage 2 and determined for expression of vp1 by ifa，based on which the condition for infection was optimized results the target gene fragment at a length of 3 203 bp was amplified from the transformants of bacmid-vp1 the rbac-vp1 of passage 2 reached a titer of 6 107 pfu ml，with which the infected sf9 cells showed green fluorescence under fluorescent microscope the expression levels of vp1 in sf9 cells infected with rbac-vp1 at various mois showed no significant difference，which increased gradually with the increasing time for infection within 96 hconclusion the structural protein vp1 of pv sabin2 strain was successfully expressed in insect baculovirus expression system，which laid a foundation of development of poliovirus subunit vaccine【key words】 poliovirus（pv）；sabin2 strain；vp1 protein；baculovirus脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒（poliovirus，pv）感染引起的以肢体麻痹为主的急性肠道传染病， 主要影响 5 岁以下儿童，目前尚无特效治疗方法，只 能采用疫苗预防。由于口服脊髓灰质炎减毒活疫苗 存在疫苗相关麻痹型脊髓灰质炎（vaccine-associated paralytic poliomyelitis，vapp）和疫苗衍生脊髓灰质炎 病毒（vaccine-derived poliovirus，vdpv）的风险，而 用减毒株生产的灭活疫苗，其抗原性及免疫原性均 不理想，严重制约了疫苗的大规模生产，因此有必 要开发新型疫苗。pv 属于小 rna 病毒科肠道病毒属，病毒基因组为单股正链 rna，基因组长约 7 500 bp，由 5端 非编码区、多聚蛋白编码区、3端非编码区和 3端 poly（a）尾 4 个部分组成。其中，多聚蛋白编码区编 码产生 1 个多聚蛋白前体，分为 p1、p2 和 p3 区，p1 区可经蛋白酶水解产生衣壳蛋白 vp1、vp2、vp3 和 vp4，5 个拷贝的 vp1、vp2、vp3 和 vp4 构成了五聚 体，12 个五聚体构成二十面体核壳1。pv 的多数中 和抗原位点位于结构蛋白 vp1 上2 ，为此，本文在 昆虫杆状病毒表达系统中表达了 pv sabin2 株结构 蛋白 vp1，为脊髓灰质炎亚单位疫苗的研制奠定了 基础。基金项目：国家科技支撑计划（2008bai54b03）作者单位：中国食品药品检定研究院（北京 100050）通讯作者：董关木，e-mail：gmdongnicpbporgcn1. 材料与方法1. 1 菌株、质粒及细胞感受态 e. coli dh10bac 购自美国 invitrogen 公 司；pgem-t easy 载体系统购自 promega 公司；感受 态 e. coli dh5 购自天根生化科技（北京）有限公 司；杆状病毒表达载体 pfastbac1 和 sf9 昆虫细胞由 本院细胞室樊金萍惠赠。1. 2 sabin2 疫苗原液由北京天坛生物股份有限公司惠赠。1. 3 主要试剂转染试剂 cellfectin reagent、昆虫细胞培养基 sf-900sfm 和 1. 3x sf900 购自美国 invitrogen 公 司；la taq 热启动 dna 聚合酶购自 takara 公司； 逆转录试剂盒购自 promega 公司；限制性内切酶购 自 new england 公司；fitc 标记的山羊抗兔 igg 及 碱性磷酸酶标记的山羊抗兔 igg 购自 sigma 公司； 抗型脊髓灰质炎病毒兔血清由本院病毒三室惠赠。1. 4 vp1 基因的扩增及克隆根据 genbank 中登录的 pv sabin2 vp1 基因序 列（x00595）设计两条引物，序列如下：上游：5-ag- gcctatgggaattggtgacatga-3（ 下划线部分为 stu酶切位点），下游：5-ctcgagttaataagtcg- ttaatccc-3（下划线部分为 xho酶切位点），扩 增片段大小为 921 bp，引物由上海生工生物工程技 术服务有限公司合成。提取 sabin2 疫苗原液中病毒 基因组 rna，逆转录合成 cdna。以合成的 cdna 为 模板，使用 la taq 热启动 dna 聚合酶扩增 vp1 基 因，反应条件为：94 3 min；94 30 s，56 30 s，72 1 min，共 30 个循环；72 5 min。pcr 产物经 琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收 vp1 基因片段，与 pgem- t easy 载体连接，转化感受态 e. coli dh5，挑取阳 性单克隆，提取质粒 pgem-vp1，送 invitrogen 公司测序。1. 5 重组杆状病毒表达质粒的构建用 stu及 xho双酶切质粒 pgem-vp1，回收 vp1 基因片段（903 bp），连接至经相同酶酶切的 pfastbac1 质粒的多克隆位点，连接产物转化感受态 e. coli dh5，挑取阳性单克隆，提取质粒 pfast-vp1， 转化含杆状病毒穿梭载体 bacmid 的感受态 e. coli dh10bac，与 bacmid 发生位点特异性转座，通过卡 那霉素、庆大霉素、四环素抗性及蓝白斑筛选，挑取4 个克隆，应用 m13 引物（上游：5-cccagtcacgacgttg taaaacg-3，下游：5-agcggataacaatttcacacagg-3）进行 pcr 鉴定，扩增片段大小为 3 203 bp（2 300 bp 903 bp），反应条件：93 3 min；94 55 s，55 45 s，725 min，共 30 个循环；72 7 min。将鉴定正确的重组表达质粒命名为 bacmid-vp1。1. 6 重组杆状病毒的制备用转染试剂 cellfectin reagent 将鉴定正确的重 组杆状病毒表达质粒 bacmid-vp1 转染对数生长期 的 sf9 细胞，27培养 4 d，待细胞出现典型细胞病变 时收获培养上清，即为第 1 代重组杆状病毒 rbac- vp1。用第 1 代 rbac-vp1 感染 sf9 细胞，获得第 2 代 重组杆状病毒，采用噬斑形成法检测病毒滴度：将病 毒 10 倍系列稀释后接种于 6 孔板中的 sf9 细胞，病毒吸附 2 h 后，加入第 1 层琼脂糖覆盖物，27培养5 d，再加入第 2 层含中性红的琼脂糖覆盖物，7 10 d后观察噬斑并计数，按下式计算病毒滴度。病毒滴度（pfu ml） 噬斑数 稀释倍数 （1 每孔 接种病毒量）1. 7 vp1 蛋白在 sf9 细胞中表达的检测采用间接免疫荧光法。将第 2 代 rbac-vp1 以10 moi 感染 24 孔板中的 sf9 细胞，待细胞出现典型细胞病变时（3 4 d），弃去培养基，加入 80冷丙酮固定 20 min；pbs 洗涤 3 次，每次 5 min，加入抗型脊髓灰质炎病毒兔血清（1 100 稀释），37孵育 2 h；pbs 洗涤 3 次，每次 5 min，加入 fitc 标记的山羊抗兔 igg（1 80 稀释），37孵育 1 h；pbs 洗涤 3 次，荧光显微镜下观察。1. 8 感染条件的优化将第 2 代 rbac-vp1 分别以 1、3、5、7、10 moi 感 染 sf9 细胞，感染后 96 h 收集细胞；以 1 moi rbac- vp1 感染 sf9 细胞，分别于感染后 48、72、96 h 收集细 胞。使用 ripa 组织 细胞裂解液裂解细胞，13 000 g 离心 5 min 去除细胞碎片，取上清，经 sds-page 分 离蛋白，电转膜至 pvdf 膜上，5 bsa 封闭过夜；加 入抗型脊髓灰质炎病毒兔血清（1 100 稀释），37 振荡孵育 2 h；tbst 洗涤 3 次，每次 5 min，加入碱性 磷酸酶标记的山羊抗兔 igg（15 000 稀释），37 振荡孵育 1. 5 h；tbst 洗涤 3 次，每次 5 min，tbs 洗 涤 1 次，5 min，加入 bcip nbt 显色液显色。2.结果2. 1 vp1 基因的鉴定vp1 基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可 见 921 bp 的特异片段，大小与预期一致，见图 1。测 序结果表明，目的基因片段与 genbank 中登录的sabin2 vp1 基因相比，核苷酸序列同源性为 99. 3，氨基酸序列同源性为 99. 3。bp1m bp10 0007 5005 0002 5001 0009212 501：vp1 基因 pcr 产物；m：dna marker dl15000图 1 sabin2 vp1 基因 pcr 产物的电泳图fig 1. electrophoretic profile of pcr product of vp1 gene of sabin2 straina，c：可见光（a：空白对照，c：rbac-vp1 感染的细胞）；b，d：荧光（b：空白对照，d：rbac-vp1 感染的细胞）图 3 vp1 蛋白在 sf9 细胞中表达的间接免疫荧光检测（ 200）fig 3. ifa of vp1 expressed in sf9 cells（ 200）2. 2 重组杆状病毒表达质粒的鉴定pcr 结果表明，4 个克隆中有 3 个可扩增出3 203 bp 的目的片段，见图 2。mr12345678m9mr95 00072 00055 00043 00034 00026 000bp1234m bp33 10015 00010 0007 5005 0002 5001 0002503 20317 0001 5：rbac-vp1 moi 分别为 1、3、5、7 和 10；6 8：感染时间分别为 96、72 和 48 h；9：空白对照；m：蛋白质 marker图 4 不同感染条件下 vp1 蛋白表达量的 western blot分析fig 4. analysis of expression levels of vp1 under various conditions by western blot1 3：阳性克隆的 pcr 产物；4：阴性克隆的 pcr 产物；m：dna marker dl15000图 2 重组杆状病毒表达质粒的 pcr 鉴定fig 2. identification of recombinant baculovirus expression vector by pcr3.讨论由于脊髓灰质炎疫苗在全世界范围内的大规模 应用，脊髓灰质炎病例自 1988 年以来减少了 99以2. 3 重组杆状病毒的滴度经检测，第 2 代 rbac-vp1 的滴度为 6 107 pfu ml。2. 4 vp1 蛋白在 sf9 细胞中的表达荧光显微镜观察显示，rbac-vp1 感染的 sf9 细 胞可见绿色荧光，而空白对照细胞未见荧光，见图3。 表明 rbac-vp1 感染的 sf9 细胞可表达 vp1 蛋白。2. 5 感染条件优化western blot 结果表明，以不同 moi rbac-vp1 感染 sf9 细胞，vp1 蛋白表达量差别不大；而感染后 收获时间不同，vp1 蛋白的表达量有明显差异，在96 h 内随着感染时间的延长，vp1 蛋白的表达量逐 渐升高。见图 4。上3。目前世界上应用的脊髓灰质炎疫苗有两种：口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（oral poliovirus vaccine，opv）和灭活脊髓灰质炎疫苗（inactivated poliovirusvaccine，ipv）。opv 在全世界范围内的大规模应用 大大降低了脊髓灰质炎的发病率，但其存在疫苗相 关麻痹型脊灰和疫苗衍生脊灰病毒循环的风险，因 此必须停止使用，以彻底根除脊灰4。目前国际上 使用的 ipv 均是采用经甲醛灭活的野毒株生产的传 统灭活疫苗，而 sabin 株灭活后制备的 ipv 其抗原 性会发生变化，致使其免疫原性较差5。昆虫杆状病毒表达系统是一种成熟的表达系 统，杆状病毒基因组具有可容纳大量外源基因的能dcba力，可在细胞培养基中高密度大量表达外源蛋白，而且杆状病毒的宿主范围窄，不感染人类，该表达系统 能对病毒结构蛋白进行多种修饰。1989 年 urakawa 等6及 1992 年 br覿utigam 等7分别利用昆虫杆状 病毒表达系统成功合成了脊髓灰质炎病毒样颗粒（virus-like particles，vlps），urakawa 等6用纯化的 vlps 免疫小鼠，诱导小鼠能产生中和抗体。本实验 在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达了 pv（sabin2 株）vp1 蛋白，并对感染条件进行了优化，结果表明， moi 对 vp1 蛋白的表达量无明显影响，而感染后收 获时间对 vp1 蛋白的表达量影响明显，且随着感染 时间的延长，vp1 蛋白表达量升高，可能是由于 rbac- vp1 感染 sf9 细胞后，在细胞内不断复制繁殖，随着 病毒量增多，vp1 蛋白的表达量也增高。本实验为脊 髓灰质炎亚单位疫苗的研制奠定了基础，下一步将 进一步研究表达的 vp1 蛋白的作为亚单位疫苗的 安全性、抗原性及免疫原性。参考文献1 金奇 医学分子病毒学m 1 版 北京：科学出版社，2001：499-5012 信洪武，郭志刚，韩进德 脊髓灰质炎病毒蛋白质及其抗原性研 究进展j 中华实验和临床病毒学杂志，1995，9（1）：93-963 who weekly epidemiological recordj wer，2009，84（14）：109-1164 roberts l polio eradication rethinking the polio endgame j science，2009，323（5915）：7055 tano y，shimizu h，martin j，et al antigenic characterization of a formalin-inactivated poliovirus vaccine derived from live-attenuated sabin strainsj vaccine，2007，25（41）：7041-70466 urakawa t，ferguson m，miuor pd，et al synthesis of immuno genic，but non-infectious，poliovirus particles in insect cells by a baculovirus expression vector j j gen virol，1989，70（pt6）：1453-14637 br覿utigam s，snezhkov e，bishop dh formation of poliovirus- like particles by recombinant baculoviruses expressing the individ ual vp0，vp3 and vp1 proteins by comparison to particles derivedfrom the expressed poliovirus polyproteinj virology，1993，192（2）：512-524（收稿日期：2011-03-25）中国生物制品大会暨第十一次全国生物制品学术研讨会征文通知为了促进中国生物制品事业的发展，为专业研究人员提供交流与合作机会，中国生物制品大会暨第十一次全国生物 制品学术研讨