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发酵法产邻苯二酚菌株的筛选及固定化细胞的条件优化 摘要 邻苯二酚是一种应用极为广泛的化学中间体，它所涉及的领域包括化 学、农业、医学药品、轻工业、食品等，目前用于各个领域的邻苯二酚主 要是依靠化学合成途径来生产，而近年来发酵法转化芳香烃化合物合成邻 苯二酚日益引起人们的关注。 从土壤中筛选到以苯甲酸钠为唯一碳源的产生邻苯二酚的菌株4 4 株， 其中以x 1 6 菌株产生邻苯二酚的能力最强。经形态特征及1 6 sr d n a 序列同 源陛比较，初步鉴定x 1 6 为假单胞菌p s e u d o m o n a s ps p 。经培养条件的初 步优化，发酵液中邻苯二酚的含量达到1 0 i i i m l ；同时以海藻酸钠、明胶、 聚乙烯醇以及海藻酸钠和聚乙烯醇的混合物对x 1 6 菌株进行细胞固定化研 究，通过单一材料细胞固定和混合材料细胞固定的条件的初步优化，并对 其固定效果的比较，发现海藻酸钠和聚乙烯醇混合的固定效果最好，发酵 液中邻苯二酚的含量达到1 4 m g m l 。 提取x 16 的粗酶液进行检测其邻苯二酚1 ，2 一双加氧酶和邻苯二酚2 ， 3 一双加氧酶降解邻苯二酚的活性，分别从p h 、温度、金属离子及作用时间 等方面对邻苯二酚1 ，2 一双加氧酶和邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶进行初步研究， 对今后研究邻苯二酚1 ，2 一双加氧酶和邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶打下基础。 关键词：邻苯二酚筛选鉴定固定化双加氧酶 s c r e e n l n ga n di m m o b i l i c a t l 0 np s 伽d 彻m s ps p f o rp r o d u cin gc a t e c h o l a b s t r a c t c a t e c h o li sa l l i m p o r t a n t a n d a p p l i e d e x t e n s i v ec h e m i c a l i n t e r m e d i a t h ef i e l d sw h i c hi sa p p l i e dc o n t a i nc h e m i s t r y , a g r i c u l t u r e m e d i c i n e ，l i g h ti n d u s t r ya n df o o d s t u f fe t c a l t h o u g hm o s to fc a t e c h o l i sp r o d u c e db yt h ew a yo fc h e m o s y n t h e s i s ，t h em e a n s o f t r a n s f o r m i n g s o d i u mb e n z o a t et oc a t e c h o lb yz y m o t e c h n i c si sm o r ea t t r a c t i v e r e c e n t l y t o t a l4 4m i c r o o r g a n i s m sw e r ei s o l a t e df r o ms e v e r a ls o i ls a m p l e s b a s e do ns o d i u mb e n z o a t ea sas o l ec a r b o ns o u r c e t h ex 16h a st h e h i 曲e s ta c t i v i t yt op r o d u c i n gc a t e c h 0 1 t h es t r a i nx 16w a si d e n t i f i e d a sp s e u d o m o n a s ps p a c c o r d i n gt oi t sc h a r a c t e ra n d16 sr d n as e q u e n c e a n a l y s i s t h ec a t e c h o lp r o d u c t i o no fp s e u d o m o n a s ps p x 16w a ss t u d i e di n d e t a i l t h eo u t p u to fc a t e c h o lr e a c h1 0 m e c m la f t e ro p t i m i z a t i o no fc u l t u r e c o n d i t i o n s a tt h es a m et i m es o d i u ma l g i n a t e ，p v a ，g e l a t i na n ds o d i u ma l g i n a t e m i x e dw i t hp v aw e r eu s e dt ot h es t u d yo fc e l l si m m o b i l i z a t i o n t oo p t i m i z a t e d t h ec o n d i t i o na n dc o m p a r i s o ni m m o b i l i z a t i o ne f f e c to ft h es i n g l em a t e r i a l sa n d t h em i x i n gm a t e r i a l st h a tt h es o d i u ma l g i n a t em i x e dw i t hp v aw a st h eb e s t m a t e r i a l ，t h eo u t p u to f c a t e c h o lr e a c h1 4 m g m l a f t e ru l t r a s o n i cd i s r u p t i o n ，m e a s u r et h ea c t i v i t yo fc a t e c h o l1 , 2 - d i o x y g e n a s e a n dc a t e c h o l2 , 3 - d i o x y g e n a s ei np h ，t e m p e r a t u r e ，m e t a li o n sa n dr e a c t i o nt i m e e t c w h i c hb u i l tt h ef o u n d a t i o nf o r t h en e x tr e s e a r c h k e yw o r d ：c a t e c h o ls c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o n i m m o b i l i c a t i o n d i o x y g e n a s e 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： p 、瞅 学位论文使用授权说明 ) 月j 7 日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 臼卸时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 敝辄r 哦新鹕：诫媵睁7 肘日 戋辞法产部，：二蕾h | 捌的姊篙，a 固定化由_ 胞的鲁r 件优化 第一章前言 最早发现邻苯二酚的时间是1 8 3 9 年，科学家们从干馏儿茶素中提炼到邻苯二酚， 故邻苯二酚也n q ) l 茶酚。在过去人们采用过高温裂解褐煤或者从木质素等天然物质制取 过邻苯二酚，例如在造纸过程中产生的纸浆废液用酸沉淀过后的木质素，将其与苯胺盐 酸盐在2 0 0 c 3 0 0 c j i 热数小时可得到邻苯二酚。这是最早的邻苯二酚的制作工艺，现 在还有一些国家仍然在使用这种方法生产邻苯二酚“1 。 邻苯二酚作为一种化学中间体，由于其结构的特点，具有很强的还原能力。且应用 十分广泛，它的应用领域涉及到化学工业、农业、医学药品、轻工业、食品、化妆品等 众多行业，通过邻苯二酚的加工制作之后，可以用于医药如黄连素、肾上腺素、左旋多 巴、心得平，农药如残杀威克百威：残杀威、呋喃丹，香料如香兰素、胡椒醛、邻苯二 酚单假醚、黄樟素，其他方面如橡胶抗氧化剂，显影剂、防腐剂、光稳定剂、特种墨水 等产品的生产。 1 1 邻苯二酚的理化性质 邻苯二酚俗称儿茶酚，焦儿茶酚，1 ，2 - 苯二酚，焦儿茶素，英文名为c a t e c h o l ，纯品 为无色结晶，具有苯酚的气味，略带甜味和苦味，且易见光分解变成棕色，易升华。“3 分子式：吼0 2 分子量：1 l o 1 1 熔点：1 0 5 c沸点：2 4 5 。c 相对密度( 水= 1 ) ：1 3 4相对蒸气密度( 空气= 1 ) ：3 7 9 蒸气压( k p a ) ：1 3 3 ( 1 1 8 3 )燃烧热( k j m 0 1 ) ：2 8 5 4 9 。 稳定性和反应活性：稳定 禁配物：酰基氯、酸酐、碱、强氧化剂、强酸 避免接触的条件：光照、空气 溶解性：溶于水，易溶于乙醇、乙醚水、乙醇、乙醚、苯、氯仿、吡啶、液碱中 危险特性：遇明火、高热可燃。受高热分解放出有毒的气体。与强氧化剂接触可发生化 1 ：翻 嘲 产部摹二韵1 r 株的翻l 捌覆田定化细臆的条件优化 学反应 毒性：有毒，使用时要戴手套和口罩 1 2 邻苯二酚的生产现状及市场 目前，邻苯二酚的生产主要集中在欧洲，如意大利和法国，其他地区的只有日本生 产形成规模化。法国的罗纳普朗克公司是全球最大的邻苯二酚生产基地，而且在美国也 拥有一定规模的生产基地，每年的生产量达到1 8 万t ，占总生产量的9 0 ，意大利的 埃尼公司每年生产量达3 0 0 0 t ，日本雨部兴产株式会社每年能生产5 0 0 0 t 的邻苯二酚。3 。 在国外，邻苯二酚的消费量很大，而且主要是用来生产呋喃酚、兰香素、抗氧化 剂、阻聚剂，主要应用情况见表卜1 瑚 表卜1 邻苯二酚的应用情况 t a b l e 1 1t h ea p p l i c a t i o ns i t u a t i o no fc a t e c h o l 上世纪7 0 年代，我国开始邻苯二酚的工业生产，但是一直以来发展都十分缓慢， 由于技术工艺落后，生产成本过高而且纯度不够，到了1 9 9 3 年，我国的生产能力还只 有3 0 0 t a ，而实际产量只有2 0 0 t a 左右，我国主要生产邻苯二酚的单位是吉林和龙市 第四化工厂和吉化公司清源化工厂，其中吉林和龙市第四化工厂每年生产1 5 0 t ，而吉化 公司清源化工厂每年只能生产5 0 t 。而我国需求邻苯二酚的量很大，在农药方面，生产 残杀威需要6 7 0 t a ，生产呋喃酚需要5 0 0 0 t a ，在香料方面，生产兰香素需要1 0 0 0 t a ； 医药方面需要5 0 t a 左右。所以我国所需求的邻苯二酚大部分是从国外进口。我国邻苯 二酚主要用于生产医药的中间体和香料、农药，另外还用于染料的制取、电镀材料、感 光材料、特种墨水、防腐剂、抗氧化剂等方面。“h 埘 2 毫辞法产部摹二翻r r 捌l 的姊葺：a 固定化血i 胞的毒- 件优化 1 3 邻苯二酚的生产方法 1 3 1 化学工艺法生产邻苯二酚 1 3 1 1 传统的化学工艺法一“” 1 r h o n e p o u l e n c 法 该生产方法是由法国r h o n e p o u l e n c 公司开发研制，并于1 9 7 3 年实现工业化。特点 是以苯酚为原料，以h c i o 。为催化剂，以h 。p o , 为助催化剂合成邻苯二酚。虽然苯二酚选 择性可达9 0 9 6 ，但苯酚转化率仅为5 ，其中邻苯二酚对苯二酚为1 5 ：1 。该法由于使用 了h c i o 。、h 3 p o , 等，后处理工艺复杂，严重环境污染。 2 u b e 法 u b e 公司研制的以硫酸和6 0 硫酸与甲基异丁基酮即时生成的酮过氧化物为催化剂， 以苯酚为原料生产邻苯二酚。与7 0 年代末期实现工业化。该法的优点在于反应温度较 低，只有7 0 。c ，苯酚的转化率较低，小于5 。但是苯二酚选择性可达9 0 。其中邻苯二 酚对苯二酚为1 5 ：1 。同时，在该方法中使用的催化剂的量比较少，在产物分离时可 对产物直接进行蒸馏，不需要去除催化剂。除硫酸外还可以使用c f ，s 0 ，h 及焦磷酸等。 u b e 法和r h o n e p o u l e n c 法的反应工艺大同小异，其共同的缺点都是苯酚转化率太低， 苯酚的循环量太大。 3 b r i c h i m a 法 该法是以铁盐和钴盐作为催化剂，反应温度可以控制在4 09 c ，采用6 0 h 。0 。水溶液。 苯酚的转化率约为1 0 左右，苯二酚的选择性约为8 0 ，邻苯二酚对苯二酚为2 ：3 。但 该法由于要使用高浓度的h 2 0 ：，因此生产成本较高。 4 e n i c h e m 法 e n i c h e m 法由e n i c h e m 公司首先在意大利工业化。该法以t s - 1 为催化剂，用苯酚和 h 2 0 。合成苯二酚。反应温度控制在6 0 9 0 之间，使用的溶剂为水和丙酮。在苯酚h ：0 ：( 摩 尔比) 为3 ：1 时，苯酚的转化率可达到2 5 ，苯二酚的选择性约为9 0 ，产物中邻苯二酚 对苯二酚为为1 ：1 。反应结束后只需将催化剂滤出，产物可以通过常规减压蒸馏法分 离。 1 3 i 2 现代化学工艺法1 ” 3 戋崩 涪，讳摹= 1 r 棒的姊毪& 嘀定化细的毒? # 优化 1 3 1 2 1 邻氯苯酚碱性水解法 这是传统的生产方法。生产工艺主要有三步，i 在温度达到1 9 0 时，以c u s 0 4 为 催化剂，将原料溶于7 5 的n a o h 溶液中充分反应；2 用5 0 的h 。s o , 中和；3 最后用乙 酸乙酯萃取邻苯二酚，并蒸馏回收溶剂，得工业级邻苯二酚。 1 3 1 2 2 邻异丙苯取代法 该法原料紧缺，分离提纯很难。主要生产原理见图“” 珏+ 嚣 1 3 1 2 3 二磺酸酚碱熔法 该法反应要求高，分离提纯难。主要生产原理如图所示“”， ”o h l c ， i o h s 。烈西o 。n n 呤三h h s 0 3 n 0 1 3 1 2 41 ，2 环己二醇催化脱氢法 在反应温度为3 2 0 、以n i 硅藻土为催化剂的条件下，通过i ，2 - 环己二醇的脱氢， 得到邻苯二酚，催化剂以n a + 为助剂浸渍，可以提高催化剂的活性。 1 3 1 2 5 苯酚羟基化 1 3 1 2 5 1 苯酚双氧水氧化法 在以双氧水为氧化剂，借助一定催化剂，如无机酸及其盐催化剂、无机酸和有机酸 的复合催化剂、有机溶剂催化剂、s 0 2 催化剂、有机金属络合物催化剂黏土及沸石类催 化剂等的作用，进行酚类氧化，能够生成邻苯二酚。双氧水直接氧化苯酚生成邻苯二酚 的同时有对苯二酚和焦油生成，但邻苯二酚和对苯二酚之间不会相互转化，二酚经过深 度氧化之后生成焦油，虽然二酚的直接氧化产物是苯醌，但同时也有焦油产生。 4 6 。 + 。， 珏 兰e 法，鄂| 【二1 分棒的爿l 茸a 定化鼻胞的蠢件崩 化 1 3 1 2 5 2 苯酚过氧羧酸氧化法 以羧酸的过氧化物为氧化剂与苯酚反应，加入适当的催化剂，可以发生邻位羟基化， 从而得到邻苯二酚和对苯二酚的混合物，经过分离纯化可以得到邻苯二酚。这种方法合 成邻苯二酚的缺点是由于邻苯二酚和对苯二酚的进一步反应，从而使产物中副产物增 多，增加纯化的难度，而且使用苯酚的量过大，转化率不高，导致原料浪费严重。 1 3 1 2 5 3 苯酚过氧化酮氧化法 苯酚与酮的过氧化物在硫酸或硫酸盐等酸性催化剂的作用下，经过双氧水的氧化发 生邻位羟基化，生成邻苯二酚，该法的特点是酮类可以回收并循环使用，在国外已经有 工业化生产装置。 1 3 1 2 5 4 臭氩直接氧化法 m a k a l e t sb i 等人以过渡金属为催化剂，在压力为0 5 0 5 3 0 3 m p a ，温度为9 0 - 1 5 0 的条件下，利用臭氧直接氧化苯酚来生成邻苯二酚，其反应过程中同样生成邻苯二酚 和对苯二酚，不过他们通过调节反应体系的p h 来控$ , j - - 者的比例，臭氧氧化法的关键 是要找到合适的催化剂，增加产生邻苯二酚的选择性。 1 3 2 生物发酵法合成邻苯= 酚 1 3 2 1 生物发酵法合成邻苯二酚的研究现状 目前，用于生产邻苯二酚的工艺都是化学法，而生物发酵法来产生邻苯二酚还在研 究过程中，但是现在已经在世界各个实验室中有深入的研究，在欧美地区、韩国、日本 已经取得惊人的进展，特别是在韩国和日本，已经出现强劲的势头“”。他们分别从菌种 的筛选、产生邻苯二酚的关键酶、降解邻苯二酚的关键酶以及固定化发酵等几个方面着 手研究。 通过菌株的筛选鉴定，发现细菌、放线菌、霉菌、酵母等菌株通过芳香烃化合物的 诱导都能合成邻苯二酚以及其衍生物。 c h u a nl uw a n g 等。”从土壤中筛选到的野生菌株假单胞菌b a - 0 3 2 3 在3 m g m l 的在以 苯甲酸钠为碳源的液体培养基中3 0 c 通风培养2 0 h ，能产生邻苯二酚1 6 m g m l 。而在加 有甘油的静止细胞培养基中利用静止细胞发酵生产在较短的时间内邻苯二酚的产量达 5 j u 哮法，- 讳摹= ：砑曹糠的翻i 琏a 啊定化细胞的毒r 件优化 到1 9 m g m l 。同时他还进行菌株的分子改性，通过插入一个片断在基因中间，使菌体的 产量迅速得到增大，达到2 3 m g m l 。 p e t e ra w i l l i a m s 等利用p s e u d o m o n a s pu t i d a mt - 2 的突变菌株证明了m e t a 代谢 途径和o r t h o 代谢途径的存在。同时他们还克隆到邻苯二酚合成酶和降解邻苯二酚的两 种双加氧酶。 m a r i a n og q u i n t a n a 等利用工程菌g s e u d o m o n a s pu t i d au v 4 ，以海藻酸钙为固 定化材料，研究了利用固定化细胞合成邻苯二酚，其固定化细胞颗粒可以连续批次发酵 达到2 4 次。 s a nd r a h a d d a d 等利用r h o d o c o c c u ss p s t r a i n l 9 0 7 0 阐述了生物体以降解苯甲酸 来合成邻苯二酚路径。为我们研究如何控制苯甲酸合成邻苯二酚提供了充足的理论依 据。同时，他们还克隆到了苯甲酸双加氧酶的基因片段，并将其成功的表达嘲1 。 随着更深入的研究，生物发酵法合成邻苯二酚的各个代谢途径，合成关键酶以及 降解的关键酶都逐渐被科学家们研究透彻，生物发酵法合成邻苯二酚的工业化就快要拉 开序幕了。 1 3 2 1 生物发酵法合成邻苯二酚的途径“1 ” 生物体利用苯甲酸和苯甲酸的衍生物的代谢途径主要是：菌体在利用以苯甲酸和苯 甲酸的衍生物为碳源的情况下，体内的苯甲酸双加氧酶( b e n z o a t ed i o x y g e n a s e ) 把苯 甲酸和苯甲酸的衍生物氧化生成邻苯二酚，与此同时，体内的邻苯二酚1 ，2 - 双加氧酶 和邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶分别通过o r t h o 路径和m e t a 路径，把邻苯二酚分解成菌体 能够利用的碳源物质，从而进入三羧酸循环，供生物体用于其他新陈代谢。由于芳香烃 物质都有毒性，对菌体有一定的毒害作用，为了使菌体在以芳香烃为碳源的发酵液中正 常生长，加入适量的甘油，可对菌体起到保护作用1 。 1 3 2 2 合成邻苯二酚的关键酶 合成邻苯二酚的关键酶是苯甲酸双加氧酶簇，在不同细菌中，由不同的基因编码， 有的细菌是在染色体上，而有的是在质粒上。r h o d o c o c c u ss p s t r a i na t c c l 9 0 7 0 中是 由b o p 基因簇调控，b o p 基因簇有b o p x ，b o p y ，b o p z ，b o p l 及b o p k5 个开放阅读框， 在p s e u d o m o n a sp u t i d a s t r a i np r s 2 0 0 0 中由b e n 基因簇调控，其包括 b e n a ，b e n b ，b e n c ，b e n d ，b e n k5 个阅读框，p s e u d o m o n a sp u t i d am t 一2 则是由p w w o 质粒 占 点醇法p 部，：= h r 糠的姊a 日定化i * 的条件* 上的x y l 基因簇控制，x y l 包括x y l x ，x y l y ，x y l z 及x y l l 4 个开放阅读框，在 a c i n e t o b a c t e rs t r a i na d p i 中由其中的b e n 基因簇控制，其包括 b e n k ，b e n m ，b e n a ，b e n b ，b e n c ，b e n d 六个开放阅读框嘲。 1 3 2 3 降解邻苯二酚的关键酶 1 3 2 3 i 邻苯二酚1 ，2 - 双加氧酶( 0 1 2 0 ) ”3 邻苯二酚1 ，2 - 双加氧酶是第一个被发现的催化苯环开环的双加氧酶，邻苯二酚1 ， 2 一双加氧酶催化邻苯二酚中两个羟基之间的苯环开环，所以邻苯二酚1 ，2 - 双加氧酶也 被成为内二元醇双加氧酶，邻苯二酚1 ，2 - 双加氧酶将邻苯二酚降解成顺，顺一己二烯二 酸，其在2 6 0 n t o 处有吸收峰。在增氧产碱菌i m p l 3 4 中，t f d o 、t f d e 、t f d f 共同组成一 个多顺反子，形成操纵子结构“帕。 1 3 2 3 ，2 邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶( c a t 0 2 a s e ) “”。1 邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶也叫变几茶酚酶，它能催化邻苯二酚中两个羟基外侧的苯 环开环，将邻苯二酚降解成黄色的2 一羟粘糠酸二醛( s ) ，所以邻苯二酚2 ，3 一双加氧 酶也被叫做外二元醇双加氧酶。2 一羟粘糠酸二醛在3 7 5 n m 处有吸收峰。不同细菌中的邻 苯二酚2 ，3 一双加氧酶在理化性质、与底物结合的能力都大不一样o ”。 在单胞菌属中，恶臭假单胞菌m t 一2 中含有一个1 1 5 k b 的t o l 大质粒，其上的x y l e 基因能够编码邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶，通过检测发现，x y l e 基因有3 个密码框，9 2 1 个碱基对，其编码的邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶具有4 个相同的且分子质量为3 5 km r 的亚 基，亚基上含有亚铁蛋白。在降解苯胺的假单胞菌由a l n e 基因编码，它与恶臭假单胞 菌中编码邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶基因有4 4 1 的同源性。而洋葱假单胞菌中则依靠t o m 质粒上的t o m b 基因编码邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶。 在柯氏单胞菌属中，j s7 6 5 编码邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶的基因有三个开放阅读框， c t e s t o s t e r o n ib 3 5 6 中编码邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶的基因与x y l e i i 有关，其活性受 氯邻苯二酚的抑制。 其他的菌属中如产碱杆菌a e u t r o p h u s3 3 5 的基因所编码的邻苯二酚2 ，3 一双加氧 酶对二羟芳香烃物质都有降解能力，其基因上有一个开放阅读框，编码3 0 9 个氨基酸残 基。无色杆菌a x y l o s o x i d a n sk f 7 0 1 编码邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶的基因与恶臭假单胞 菌的基因有只有2 2 的同源性。紫球菌依靠o h p d 基因编码，嗜热芽孢杆菌中的邻苯二酚 7 置霸坤产 - j ：睇曹捌l 的瑚 避蕊固定化细胞的条件优化 2 ， 双加氧酶具有较高的热稳定性，它是由质粒p f d a l 3 上的p h e b 基因编码。 1 3 2 4 生物细胞的固定化研究 固定化技术现在被广泛应用于生物细胞，主要是指利用物理和化学方法将细胞限定 于有限空间，但又不失去活力，而且能够反复使用的一种技术固定化材料的选择须具备 以下几点： 1 固定化材料必须对生物细胞无毒害作用：2 固定化材料应该便宜且容易得到：3 固定化过程必须温和，不对细胞产生损害：4 载体要有稳定的结构，在所使用的环境中不 容易被破坏：5 固定化材料要有良好的通透性，底物、产物和代谢物都能够自由扩散。 现在被广泛应用于生物细胞固定化的材料主要有：海藻酸钠、聚乙烯醇、琼脂、明 胶、聚丙烯酰胺、卡拉胶、壳聚糖等，固定化材料的选取是根据不同的细胞来进行选择， 固定的方法也各不一样，主要的方法有：( 1 ) 吸附固定，分为表面吸附和细胞凝聚两种； ( 2 ) 载体固定，包括有机载体和无机载体；( 3 ) 包埋固定，分为凝胶包埋和微胶囊包 埋；( 4 ) 共价结合固定；( 5 ) 交联法固定删吖嘲。 海藻酸钠是一种具有良好通透性和硬度的固定化材料，海藻酸钠固定细胞主要是依 靠与c a c l 。交联后，形成具有一定硬度和弹性的海藻酸钙小球，小球的硬度随c a 2 + 的浓 度的加大而加大，但固定化细胞的通透性也随之降低嘟1 。最近韩国d s j 0 0 用羧甲基纤 维素和海藻酸钙形成真正的微胶囊用于固定藻类细胞嘲。 聚乙烯醇固定细胞的方法比较多，主要有冰冻法、饱和硼酸交联法、硼砂和n a c l 交联法，而且聚乙烯醇具有很好的柔韧性和通透性，是固定化技术中常用的一种材料。 目前使用最多的固定化技术是利用两种或两种以上的固定化材料进行固定，此方 法的优点是能够充分利用各种固定化材料的优点，使固定化细胞达到最优化。 1 3 2 5 生物发酵法合成邻苯二酚的优越性“” 相比化学工艺生产邻苯二酚，生物发酵法生成邻苯二酚具有反应条件缓和、原料价 格低廉且来源广泛、副产物少、易分离、生产安全且环保等优点。 1 4 邻苯二酚纯化 关于邻苯二酚纯化的报道较少，各个公司对邻苯二酚的纯化都相当保密。用化学工 艺合成邻苯二酚后，需要在严格的反应条件以及高温高压下通过精馏才能得到纯的邻苯 8 广口 掌q e 掌论文 生 法产部摹= 日r 糠的姊嚣a 定化_ * 的条件优化 二酚，而生物发酵转化合成邻苯二酚，其发酵液中成分较单一，所以分离邻苯二酚也就 相对要容易的多。李改枝等“”曾报道过用磷酸三丁酯从邻苯二酚水溶液中萃取邻苯二 酚，并研究了在有机相中p h 对邻苯二酚萃取的影响，刘磷等报道过用多酚氧化酶和 硅藻土耦合系统，在与苯甲醚共存的条件下，利用多酚氧化酶对酚类有特异的催化作用， 硅藻土与反应物特异性吸附，从而分离邻苯二酚，雷学军等“7 1 报道过从西番莲等植物中 提取邻苯二酚，周燕等从水冬瓜的成分中，用正丁醇和石油醚萃取得到邻苯二酚。据 雷学军等从西番莲中提取邻苯二酚的方法，发现西番莲中含有的成分与发酵液有一个共 同的特点就是成分都比较单一，不受其他副产物的影响，所以将其方法改进之后可以用 来从发酵液中纯化提取邻苯二酚，具体步骤如下： 发酵液 l 离心取上清液 l 用4 h c j 调p h 至7 0 用乙醚萃取 i 取乙醚层萃取液 i 用4 n a o h 调p h 至1 2 取碱液层液相 l 用4 h c i 调p h 至8 2 通人n 月乙醚萃取 i 取乙醚层萃取液 i 回收乙醚 邻苯二酚粗品 l 加甲苯结晶 纯邻苯二酚 9 生 法，部摹二叠九| 捌的茸翻渡固冀：化细曩啪蠢节1 七_ 化 1 5 本研究的实验技术路线： 1 0 薯崔i 法产嘲i 摹：；韵1 r 株的韩选及砷定化自电的条件优化 2 1 材料 2 1 1 土壤样品来源 第二章材料与方法 从南宁市附近的水稻田、玉米地、菜地、汽车修理厂、花圃、河流、下水道等地采 集土样或水样。 2 1 2 菌株和质粒 试验所用菌株与质粒列于表2 1 。 表2 一l 供试菌株和质粒 t a b l e 2 1b a c t e r i a ls t r a i n sa n dp l a s m i d su s e di nt h i ss t u d y 2 2 培养基 所有培养基用去离子水配制后，于1 2 1 ，1 5 mp a 压力下蒸汽灭菌2 0 分钟，如需 要液体培养基在接种前加入适量的抗菌素或其他溶液，固体培养基用微波炉溶化后冷却 至5 0 左右倒平板，如需要加如适量的合适的抗菌素或其他溶液。 ( 1 ) l b 培养基：用于大肠杆菌的液体培养基 每升含有：1 0 o g 胰蛋白胨( o x o i d ) 、5 o g 酵母浸出粉( d i f c o ) 5 o g 、n a c lp h7 0 ( 2 ) l a 培养基：用于大肠杆菌的固体培养基，l b + 1 ( w v ) 琼脂 ( 3 ) 筛选培养基：用于筛选产邻苯二酚菌株及其发酵，灭菌后混合使用 1 1 裳酵* ，部革= 苗捌的姊& 圈定化自 的条件优化 a ： 6 9 苯甲酸钠、3 9 9n a 2 h p 0 4 2 h 2 0 、3 5 9k h 。p 仉、l gn a c l 、2 9 酵母粉、2 m l3 0 甘油、p h6 7 、8 5 0 r a l 去离子水 b ：0 5 9m g s 吼7 h 2 0 、0 5 m gf e s 吼7 h 2 0 、0 5 m gc a c l 2 、0 5 m gz n c l 2 、0 5 m gc u s q 5 h 2 0 、 p h 自然，1 5 0 n 】1 去离子水，使用时把a 和b 混合后使用 需要时加入2 的琼脂配成固体培养基。 ( 4 ) 固定化培养基：用于固定化细胞研究 6 9 苯甲酸钠、2 m l3 0 甘油、0 4 9 ( s h 4 ) 。s o 、0 5 9 酵母膏、0 6 9m g s 0 4 7 h 2 0 、 0 0 6 9c a c l ：、p h 7 0 、1 0 0 0 m l 去离子水 ( 5 ) s o e 培养基：用于电脉冲转化细胞用 2 0 9 胰蛋白胨、5 9 酵母提取粉、0 5 9n a c i 、l o m mm g c lz 、m i o m mg s 0 4 、2 0 r a m 葡 萄糖、p h7 0 ，1 0 0 0 m l 去离子水 2 3 菌种保存： ( 1 ) 长期保存： ( 2 ) 短期保存： 将加入适当抗生素的新鲜的0 6 m l c o l i 或p s e u d o m o n a ss p 菌 液与0 4 m l5 0 ( v v ) 灭菌甘油充分混合后，置于- - 2 0 或- - 8 0 存放。 ec o l i 一一将加入适当抗生素的新鲜的菌液或直接从平板上划线 培养于含适当抗生素的l a 平板，4 c 存放约四周。p s e u d o m o n a ss p o 将加入适当抗生素的新鲜的菌液或直接从平板上划线培养 于含适当抗生素的筛选培养基平板，4 c 存放约六周。 2 4 生长条件 假单胞菌在3 2 c ，1 天( 固体培养) ；或3 2 c ，振荡( 2 0 0 r p m ) 培养1 天左右( 液 体培养) 大肠杆菌在3 7 c 培养箱中培养过夜( 固体培养) ；或3 7 1 2 振荡( 2 0 0 r p m ) 培养过 夜( 液体培养) 。 2 5 溶液、缓冲液和试剂 所有的溶液都用去离子水配制，使用前经过灭菌或者溶液的成分单独灭菌。般溶 1 2 冀，皇法产部牟：二置r r 期l 的姊翊l a 田，i 化生_ 总的条件优化 液灭菌采用高压湿热灭菌，1 2 1 维持1 5 分钟，或者经过灭菌的微孔滤膜( 孔径为0 4 5 l i m ) 过滤灭菌。 ( 1 ) 邻苯二酚标准溶液的配置： 称取6 m g 邻苯二酚配置成l o o m l 母液，装入棕色瓶中4 保存，吸取l m l 稀释成 o o l m g m l 一0 0 6 m g m l ； ( 2 ) 4 一从p 的配制： 1 94 氨基安替比林、2 0 9n a 。c 0 3 、0 8 9n a o h 、去离子水l o o o m l ，p h 自然，装入 棕色瓶中4 存放备用； ( 3 ) 1 t eb u f f e r ：1 0 枷t r i s h c l ( p h 8 o ) 、i o m m e d t a ( p h 8 0 ) ； ( 4 ) s o l u t i o ni ：1 0 l i l mg l u c o s e 、2 5 i l 姒t r i s h c l 、1 0 m me d t a ； ( 5 ) s o l u t i o ni i ：o 2 mn a o h、i s d s ； ( 6 ) s o l u t i o nl i i ：3 mk a c ( p h 4 8 ) ； ( 7 ) l y s i sb u f f e r ：4 0 r a mt r i s a c ( p h 7 8 ) 、2 0 r a mn a h c 、l m me d t a 、i s d s ： ( 8 ) i 0 x t b e ：9 0 0 m mt r i s h c l ( p h 8 o ) 、9 0 0 m mb o r i c a c i d 、2 0 r a me d t a ( p h 8 0 ) ； ( 9 ) t h e ：4 0 r a mt r i s a c e t a t e ，l m me d t a ( p h 8 0 ) 饱和； ( 1 0 ) l o a d i n gd y e ：1 5 ( w v ) f i c o l l ( 聚蔗糖) 、o 1 ( w v ) 溴酚蓝、4 0 r a mn a 2 e d t a ( p h 8 0 ) ( 儿) t r i s h c l ：1 mt r i s 用h e l 调节至适当的p h 值； ( 1 2 ) t r i s 饱和苯酚：苯酚用l o o m mt r i s h c l ( p h 8 o ) 饱和； ( 1 3 ) n a c l 饱和苯酚：苯酚用3 ( w v ) n a c l 进行饱和； ( 1 4 ) 苯酚氯仿：l ：l 饱和苯酚与氯仿混合 ( 1 5 ) p c r 应所用d n a 聚合酶及其缓冲液购自t a k a r a 和m b i 公司，限制性内切酶及其缓 冲液：大部分限制性内切酶及缓冲液购于美国p r o m e g a 公司。酶切反应按说明书进行。 2 6 常用抗生素及其使用浓度 3 戋酵诖 产讳摹二砑r 捌0 的姊遗a 圈定化细胞的条件优化 表2 2 抗生素及使用浓度 t a b l e2 - 2t h ea n t i b i o t i c sa n di t su s i n gc o n c e n t r a t i o n 2 7 仪器 ( 1 ) 上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂生产的7 5 6 m c 紫外可见光分光光度计； ( 2 ) 超净工作台( 苏净集团安泰公司生产) ： ( 3 ) 水浴锅( 购自b b r a u n 生物技术公司) ； ( 4 ) 高速冷冻离心机：最大转座1 5 k r m i n ，购自h i t a c h i 公司； ( 5 ) 高压蒸馏灭菌锅； ( 6 ) 常压稳压电泳仪，购自北京东方特力； ( 7 ) 干热灭菌电热烘箱； ( 8 ) b i o - r a d 成像系统； ( 9 ) b i o - r a d 电脉冲仪； ( 1 0 ) 培养箱( 上海市跃进医疗器械一厂生产) ； ( 1 1 ) - 8 0 冰箱，购自f o r m as c i e n t i f i c 公司； ( 1 2 ) - 2 0 c 冰箱s i m e n s 公司生产； ( 1 3 ) 制冰机( s a n y o 公司生产) ： ( 1 4 ) p h u 型酸碱性( 进口产品) 光学显微镜； ( 1 5 ) 9 6 孔培养板：浙江黄岩五洲医用塑料厂生产： ( 1 6 ) p c r 仪：p e 公司4 8 0 型 ( 1 7 ) 高速真空干燥机：e p p e n d o r f 公司生产 1 4 广w 学习l 掌t 论：t 生醇* _ 产邻l = r 糠的确避& 固定化自臆的蠢# 优化 ( 1 8 ) 高速离心机：e p p e n d o r f 公司生产 2 8d n a 的提取 2 8 1 质粒d n a 的制备 2 8 1 1 大量制备质粒d n a s o l u t i o ni ：l o m mg l u c o s e 、2 5 r a mt r i s h c l 、l o m me d t a ： s o l u t i o ni i ：0 2 mn a 0 h 、i s d s ； s o l u t i o ni l l ：3 mk a c ( p h 4 8 ) ： ( 1 ) 接一环新鲜菌体到含适量抗生素的l b 液体培养基，摇床( 2 0 0 r p m ) 培养过夜 达o d w = o 6 。 ( 2 ) 取过夜培养液，接i 2 0 体积量接种于不含抗生素的盛于大体积( o 5 1 l ) 三角瓶的液体培养基，3 7 。c ，摇床( 2 0 0 r p m ) 培养3 4 小时至o d 。= o 4 。 ( 3 ) 加氯霉素至终浓度1 7 0i ig m l 后，继续在3 7 。c ，摇床( 2 0 0 r p m ) 培养1 2 1 6 小时( 扩增质粒) 。 ( 4 ) 4 c 离心( 4 5 0 0 r p m ) 1 5 分钟，收集菌体。 ( 5 ) 悬浮菌体于l o o m l 冰冷的1 x t e 中。 ( 6 ) 同( 4 ) 收集菌体。 ( 7 ) 将菌体悬于溶液i ( 5 0 0 m l 菌体，约l o m l 溶液i ) ，并转入中型离心管； ( 8 ) 加新鲜配制的溶菌酶，置3 7 。c 水浴1 0 分钟( 5 0 0 m l 菌体；1 0 0i il 溶菌酶，酶 母液l o m g m l ，l o m mt r i s h c lp h 8 0 ) 。 ( 9 ) 加溶液i i ，混匀，室温下放置5 1 0 分钟。( 5 0 0 m l 菌体，2 0 r a l 溶液i i ) ( 1 0 ) 加冰冷的溶液m ，混匀，冰上置1 0 分钟，形成白色沉淀。( 5 0 0 m l 菌体，1 5 m l 溶液) 。 ( 1 1 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，吸取上清液于另一新离心管中。 ( 1 2 ) 加等体积异丙醇，混匀，室温放置1 0 分钟。 ( 1 3 ) 室温1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟。 ( 1 4 ) 弃去上清液，7 0 乙醇洗d n a 沉淀，干燥，溶于适当体积的1 x t e 中。 2 8 1 2 碱变性法提取质粒d n a 1 5 生醇法产嘲，摹二翻r r 拥的姊篁滚硼定化细胞的鲁 件优化 s o l u t i o ni ：1 0 m mg l u c o s e 、2 5 m mt r i s - h c l 、1 0 m me d t a ： s o l u t i o ni i ：0 2 mn a o l - i 、i s d s ； s o l u t i o n ：3 mk h c ( p h 4 8 ) ； ( 1 ) 接一环细菌到l o m l 含适当抗生索的l 8 液体培养基中，3 7 c 或3 2 c 振荡培养 过夜( 2 0 0 r ) ； ( 2 ) 取1 5 m l 的菌液于e p 管中，1 0 0 0 0 r p m 离心6 0 秒钟，倒掉上清培养液，收集 菌体： ( 3 ) 将悬浮在1 0 0 1 1l 的溶液i 中，置于冰上5 分钟； ( 4 ) 加入2 0 0 ul 的溶液，颠倒混合几次，置于冰上5 分钟； ( 5 ) 再加入1 5 01 1l 冰冷的溶液缓慢倒置混合几次，然后再置于冰上1 0 分钟； ( 6 ) 1 3 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，取上清液移入另一干净的e p 管中； ( 7 ) 加入等体积苯酚氯仿抽提一次，彻底混匀后离心1 0 分钟( 1 0 0 0 0 r p m ) ； ( 8 ) 取上层清液于另一干净的e p 管中，加入等体积氯仿，彻底混匀以后，1 0 0 0 0 r 离心5 分钟； ( 9 ) 取上层清液于另一干净的e p 管中，加入1 1 0 体积的n a a c 溶液和3 倍体积 无水乙醇，混匀后置于- 2 0 。c 沉淀d n a3 0 分钟，或者加入等体积的异丙醇，室温沉淀d n a l o 分钟； ( 1 0 ) 1 3 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，去尽上清液，然后用7 0 乙醇洗沉淀2 3 次( 加 入7 0 的酒精，离心，去上清) 。 (