(基础兽医学专业论文)sars冠状病毒非结构蛋白nsp14基因的克隆表达及其作用底物的制备.pdf_第1页
(基础兽医学专业论文)sars冠状病毒非结构蛋白nsp14基因的克隆表达及其作用底物的制备.pdf_第2页
(基础兽医学专业论文)sars冠状病毒非结构蛋白nsp14基因的克隆表达及其作用底物的制备.pdf_第3页
(基础兽医学专业论文)sars冠状病毒非结构蛋白nsp14基因的克隆表达及其作用底物的制备.pdf_第4页
(基础兽医学专业论文)sars冠状病毒非结构蛋白nsp14基因的克隆表达及其作用底物的制备.pdf_第5页
已阅读5页,还剩55页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

英文缩写 e d b s a c d n a e d l a h k b k a n m l n o d p c r s d s s e c 英文全称 b a s ep a i r 英文缩略表 b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd n a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d h o u r k il o b a s e k a n a m y c i n m i n u t e o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c ti o n s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e s e c o n d 中文全称 碱基对 牛血清白蛋白 互补d n a 乙二胺四乙酸 小时 千碱基 卡那霉素 分钟 光密度 聚合酶链式反应 十二烷基磺酸钠 秒 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 s a r ss e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e 严重急性呼吸综合症 i p t g i s o p r o p y l t h i o b d - g a l a c t o s i d e异丙基硫代一b d - 半乳糖 y9 0 3 9 5 3 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文,是在导师指导下,独立进 行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指 导、帮助和做出重要贡献的个人或集体,均在文中明确 说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论 文的规定,同意学校保留和按要求向国家有关部门或机 构送交论文纸质本和电子版,允许论文被查阅和借阅。 本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或 其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名:童j 查, 导师签名:越基盘 日期:型立 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 严重急性呼吸综合征( s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e , s a r s ) 是一种严重危害人类健康的疾病。本研究通过对s a r s 冠状病 毒非结构蛋白n s p l 4 基因进行克隆,原核表达得到了n s p l 4 蛋白,并 为n s p l 4 蛋白功能的检测制备了底物。 试验一、s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆。根据 g e n e b a n k 公布的s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 的基因序列设计引 物,用p c r 的方法把n s p l 4 基因从s a r s 冠状病毒的e d n a 片段中扩增 出来,将目标基因连接到原核表达载体( p e t 3 0 a ) 中,构建重组质粒。 重组质粒经p c r 和酶切反应进行了初步鉴定,并将初步鉴定后的质粒 进行测序。测序结果表明,克隆的n s p l 4 基因序列与发表基因完全一 致,成功构建了原核表达载体p e t 3 0 a e x o 。 试验二、对非结构蛋白n s p l 4 进行了诱导表达和纯化。把构建的 原核表达载体p e t 3 0 a e x o 转化大肠杆菌b l 21 ( d e 3 ) ,诱导产物经 s d s p a g e 电泳后,发现目的蛋白以包涵体的形式存在。对非结构蛋 白n s p l 4 的表达和纯化条件进行了优化。使用多步洗涤的方法对包涵 体进行了初步纯化,使用稀释法对包涵体进行了重新折叠,使用镍柱 纯化的方法对重折叠后的产物迸一步纯化,s d s p a g e 电泳结果表明: 得到了纯度较高的非结构蛋白n s p l 4 。 试验三、对非结构蛋白n s p l 4 作用底物进行制备。通过转录得到 了r n a ,得到了非结构蛋白n s p l 4 作用底物。 本研究结果为进一步明确非结构蛋白n s p l 4 的功能奠定了基础。 关键词:s a n s 冠状病毒;非结构蛋白n s p l 4 ;表达;包涵体;作用底物 刘杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制各 c l o n i n g ,e x p r e s s i o na n ds u b s t r a t ep r e p a r a t i o n o fn s p l 4g e n eo fs a r sc o r o n a v i r u s a b s t r a c t n e p u r p o s eo f e x p e r i m e n t i st oc l o n ea n de x p r e s st h en s p l 4g e n eo f s a r sc o r o n a v i r u s ( s a r s c o v ) ,t og e t t h e n s p l 4 p r o t e i n o f s a r s c o v b y p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n i tw a sap r o m i s i n gc a n d i d a t ep r o t e i nf o rf u r t h e r s t u d i e s e x p e r i m e n ti :t h ec l o n i n go f n s p l 4g e n eo f s a r s c o v o nt h eb a s i s o ft h er e p o r t e dn u c l e o t i d e ss e q u e n c eo fn s p l 4g e n eo fs a r s - c o v ,t h e p r i m e r sw e r ed e s i g n e d ,t h e nt h eg e n ew a sc l o n e df r o mt h ec d n as e g m e n t o fs a r s c o vb yp c r t h et a r g e tf r a g m e n tw a sd i g e s t e dw i t hb a m h ia n d x h o i t h e nt h eg e n ew a si n s e r t e di n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r p e t 3 0 at o c o n s t r u c tr e c o m b i n a n tv e c t o rp e t 3 0 a - e x o t h er e c o m b i n a n t v e c t o rw a st e s t e db yp c ra n dw a sd i g e s t e dw i t hb a m h ia n dx h o i ,t h e nt h e s e q u e n c ew a st e s t e d n s p l 4g e n ew a si d e n t i f i c a t i o nw i t hp u b l i s h e dg e n e s t h ev e c t o ro fp r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n so fn s p l 4g e n ew a ss u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d e x p e r i m e n ti i :1 1 1 en s p l 4o fs a r s c o vv c a se x p r e s s e da n dp u r i f i e d t h ec o m p e t e n te c o l ic e l l sw e r et r a i l s - f o r m e db yt h er e c o m b i n a n tv e c t o r a n di n d u c e db yi p t g n l et a r g e tp r o t e i nw a se x p r e s s e di nt h ef o r mo f i n c l u s i o nb o d y ,a n dt h ec o n d i t i o n so fe x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o nw e r e p r o b e d t h e nt h e i n c l u s i o nb o d yw a sw a s h e da n d r e f o l d e d ,o p t i m a l r e f o l d i n gc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e db yr a p i dd i l u t i o n t h en s p l 4i nt h e f o r mf u s i o np r o t e i nw a so b t a i n e dt h a tw a st e s t e db ys d s - p a g e e x p e r i m e n ti i i :p r e p a r a t i o no fs u b s t r a t eo f n s p l 4o fs a r s c o v w e o b t a i n e ds u b s t r a t eo f n s p l 4o fs a r k s c o vb yt r a n s c r i b er n a i tw a sa p r o m i s i n gc a n d i d a t ep r o t e i nf o rf u r t h e rs t u d i e s 山东农业大学硕士学位论文 k e y w o r d s :s a r se o r o n a v i r u s ;n s p l 4 ;e x p r e s s i o n ;i n c l u s i o nb o d y ; a c t i v es u b s t m t e 3 宴杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制各 引言 严重急性呼吸综合症又称为非典型肺炎( s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r y s y n d r o m e ,s a r s ) ,严重的危害着人类的健康。首先出现在中国的广东省, 其后世界上许多实验室展开对其病原体的分离鉴定工作,经过努力其病 原体被找到,经研究发现是一种新型的冠状病毒,被世界健康组织命名 为“s a r s 冠状病毒( s a r s c o y ) ”。 1 严重急性呼吸综合症( s a r s ) 1 1s a p s 流行病学 s a r s 于2 0 0 2 年1 1 月首先出现在中国广东,随后有3 2 个国家报告发 现了s a r s 病例,且主要分布在亚洲、欧洲、美洲等地( l i uy ,2 0 0 4 ) 。 截至2 0 0 5 年,全球累计发病人数为8 4 3 9 例,死亡率达9 3 。中国内地共 发现s a r s 病例5 3 2 7 例,香港特别行政区是仅次于中国大陆的s a r s 暴发 最严重的地区。s a r s 传染性强,大多数s a r s 发生在青壮年,儿童较成人 更少受到s a r s 的传染威胁。主要通过短距离飞沫传播、接触病人呼吸道 分泌物及密切接触传播。人群普遍易感,医护人员是本病的高危人群。 潜伏期约在二至十二天之间,通常在四到五天。传染性主要在急性期( 发 病早期) ,尤其以刚发病时为最强。当非典型肺炎病人被隔离及采取抗 病毒、提高机体免疫力等治疗措施后,机体开始识别病毒并出现针对s a r s 的特异性免疫反应来抵抗和中和病毒。随着机体的康复,s a r s 病毒逐渐 被机体所清除,其传染性也随之消失。 1 2s a r s 的临床症状 患者的临床症状主要表现为高烧( 3 8 ) 、干咳、气短或呼吸困难、 发冷、头痛、食欲不振、身体不适、皮疹和腹泻等。并没有一般流感的 流涕、咽痛等症状,也没有通常感冒常见的白色或黄色痰液,偶有病人 痰中带血丝,病人出现呼吸急促的现象,个别病人出现呼吸窘迫综合症, 非典型肺炎病人白细胞正常或下降( v e n k a t e s hs ,2 0 0 4 ) 。通常高烧患者 应用抗生素都会有明显效果,但此病用抗生素大多无效。大多数非典型 肺炎病人可自愈,个别病情恶化凶险,约有7 的病人需做人工呼吸。 2 冠状病毒 4 山东农业大学硕士学位论文 2 1 冠状病毒的概述 最早分离出的冠状病毒是1 9 3 7 年从鸡中分离到的禽传染性支气管炎 病毒冠状病毒。之后,1 9 5 1 年分离出鼠肝炎病毒:1 9 6 5 年t y r r e l l 和 b y n o e 采用人胚鼻和气管培养法,从普通感冒患者鼻洗液中分离出一株病 毒( b 8 1 4 ) :1 9 6 6 年h a m r e 等采用人二倍体细胞分离出人2 2 9 e 病毒; 1 9 6 7 年,m c i n t o s h 等用人胚气管培养呼吸道感染患者标本,分离到一批 病毒,代表株为0 c 4 3 。1 9 6 8 年j u n ea l m e i d a 和t y r r e l l 等通过电镜形 态学观察,发现这些病毒颗粒的外膜上存在日冕或皇冠状的突起,根据 形态学上的这一特征建议命名为冠状病毒。1 9 7 5 年国际病毒命名委员会 正式定名这类病毒为冠状病毒科。s a r s 冠状病毒属于巢状病毒目,冠状 病毒科,冠状病毒属,属于r n a 病毒,易感染脊椎动物,与人和动物的 许多疾病有关,具有胃肠道、呼吸道和神经系统的嗜性。冠状病毒是r n a 病毒中基因组最大的,形态学上最显著的特征是在病毒的包膜外,有明 显的棒状膜外子粒。图1 所示为冠状病毒的病毒粒子结构模式图。 p c o l e in d r o t e i n 图1 冠状病毒结构模式图:病毒粒子结构图例。s ,突起糖蛋白: m ,膜糖蛋白;h e ,血凝素脂酶糖蛋白:n ,核衣壳磷蛋白。 成熟的冠状病毒粒子直径约为6 0 至2 2 0 n m 不等。r n a 基因组与n ( 核衣 壳) 磷蛋白相结合以形成一可变的长螺旋核衣。当从病毒粒子释放时,核 衣壳是直径为1 4 到1 6 衄延伸的管状链。研究表明在有些冠状病毒中,螺 刘杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制各 旋状核衣壳包裹于直径为6 5 r i m 的球形的并且可能形式上是二十面体的 “内部核一t l , 结构”内。核心由m ( 膜) 糖蛋白( 并且可能还有n 蛋白) 组成。 病毒核心包裹于脂蛋白包膜中,在病毒从细胞内膜出芽时形成。两类显 著的突起排在病毒粒子外部。由s 糖蛋白组成的长突起存在于所有冠状病 毒;短突起,包括h e ( 血凝素一脂酶) 糖蛋白,仅存在于某些冠状病毒,在 g a r s 冠状病毒中缺失。包膜还含有m 糖蛋白,其横穿过脂双层三次:m 蛋 白质既是内部核心结构又是包膜的成分。包膜还含有e ( 包膜) 蛋白质,其 数量远少于其它病毒包膜蛋白质。 2 2 冠状病毒的分类 冠状病毒代表株为禽传染性支气管炎病毒。按其抗原性可分为4 个 群:第1 群:猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、犬冠状病毒、 猫传染性腹膜炎病毒、猫肠炎冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、人冠状病 毒:第1 i 群:大鼠冠状病毒、大鼠涎泪腺炎病毒、牛冠状病毒、小鼠肝 炎病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、兔肠炎冠状病毒、北海鸥病病毒;第 m 群:鸡传染性支气管炎病毒、兔冠状病毒、猴冠状病毒、豹冠状病毒、 火鸡冠状病毒。第群:s a r s 冠状病毒。 2 2 冠状病毒的致病性 人冠状病毒是引起人类上呼吸道感染的病原,常引起成人的普通感 冒。儿童的冠状病毒感染并不常见。但是,5 - 9 岁儿童有5 0 可检出中和 抗体,成人中7 0 中和抗体阳性。冠状病毒感染分布在全世界各个地区, 我国以及英国、美国、德国、日本、俄罗斯、芬兰、印度等国均已发现 本病毒的存在( l a mw k ,2 0 0 3 ) 。在美国华盛顿d c 地区,连续4 年的血 清流行病学研究表明,冠状病毒占成人上呼吸道感染的1 0 一2 4 ( c h a n - y e u n gm ,2 0 0 3 ) 。在美国密执安州的一次家庭检查中,证明冠状 病毒可以感染各个年龄组,0 - 4 岁占2 9 2 ,4 0 岁以上占2 2 ,在1 5 1 9 岁 年龄组发病率最高。这与其它上呼吸道病毒的流行情况不尽相同,例如 呼吸道合胞病毒,大多随着年龄的增加而发病率降低。冠状病毒也是成 人慢性气管炎患者急性加重的重要病原。 2 3 冠状病毒的分子生物学特性 2 3 1 冠状病毒的基因组特征 6 山东农业太学硕士学位论文 冠状病毒为正链r n a 病毒,基因组全长2 7k b 3 1k b ,是目前已知基 因组最大的一类r n a 病毒。病毒基因组含有多个开放性阅读框,并具有典 型的5 帽子结构和3 7 p o l y ( a ) 尾巴结构,其基因组一般结构为57 一聚 合酶一s e m - n - 3 ,分别编码基因组复制所必需的聚合酶、s 糖蛋白、小 分子膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白( w a n gj t ,2 0 0 4 ) 。位于s 和e ,m 和n 之间或n 基因的下游还有一些基因未知序列,编码一些非结构蛋白 ( d o n n e l l yc a ,2 0 0 4 ) 。图2 为冠状病毒基因组结构图。 n5d,237 9 篇蛩黑黧” a c c s e t r m u c t u r y r a p l r o t e a n d m :a 9 r 。兰盖墨鲎避基皇拦兰兰谶吊,s s l = m 一o q c o v8 a 量耍麦i = :置篮口乇墨隰耀f 丑 o g 嚣一 n k 口v l m t e a_ r n a v ir u s c e i i r a d r p畔 p p - - - 一 一 c o n s e r v a “o n 。“h o m o l o g s 。焉二。i 脊。,。 h e l llz 中期 晚期,表明s 蛋白在 s a r s 流行早期经受较大的选择压力,在流行后期突变率趋于稳定。这一 突变分布规律,与病毒功能上的稳定性具有一定的一致性。s a r s 冠状病 毒的遗传变异的研究结果提示,其遗传稳定性有利于机体针对病毒特异 性抗体的生成,从而降低二次感染可能性,并增加了疫苗研究的可行性。 但同时也意味着病毒随传代毒力减低的可能性也减小,这给疾病的治疗 和流行控制增加一定难度。 2 3 8s a r s 冠状病毒的当前研究热点 当前对s a r s 冠状病毒结构蛋白已进行了较为全面的研究,对非结构 蛋白的研究正在展开。s a r s 冠状病毒非结构蛋白的研究臼益成为研究的 热点,研究发现它们可能为病毒感染的诊断提供途径,也可能在决定病 毒毒力方面发挥重要作用,还可能作为药物治疗和疫苗研究的靶标,并 对病毒机制的研究具有重要的意义。其非结构蛋白3 c 样蛋白酶3 c l ”木 瓜蛋白酶样蛋白酶( p l 2 ”) ,r n a 依赖r n a 聚合酶( n s p l 2 ) 等功能的研究 已相继完成,而对n s p l 4 基因的研究正在进行。 刘杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制各 3 大肠杆菌表达系统 与其它表达系统相比,大肠杆菌易于操作,成本较低,是重组蛋白 表达的首选,大肠杆菌系统有多种表达载体,每种载体必备的元件包括: 选择标记、启动子、转录调控序列、核糖体结合位点、翻译的起始密码 子、多克隆位点等( s o d o y e rr 2 0 0 4 ) 。对于一个好的载体,必须考虑几个 问题:一、启动子,二、启动子的控制区,三、好的s d 序列以及s d 序列 与起始密码子间的距离,四、强的转录终止信号,五、载体本身的拷贝 数( l a a g er ,2 0 0 1 ) 。同时还要注意外源基因的起始区的m r n a 的二级结构, 使用大肠杆菌偏爱的密码子等。大肠杆菌中表达的外源蛋白可定位于胞 内、周质和胞外,在胞内直接表达的重组蛋白研究的最早,研究的最为 成功( s h e i b a n in ,1 9 9 9 :s a v a g e a um a ,2 0 0 1 ) 。 3 1 包涵体的形成 胞内表达的最为常见的形式是重组蛋白形成不溶性的包涵体。包涵 体的形成是外源蛋白高效表达的结果,关于包涵体形成的学说众说纷纭, 目前普遍认为,许多蛋白的天然构象不是自发的一步折叠而成,而是在 辅助蛋白的协助下经过许多中间态而逐步形成。按照蛋白质折叠理论, 体内蛋白质聚集以至形成包涵体起源于肽链折叠过程中部分折叠的中间 态之间的特异性的错误聚合,而不是形成于成熟的天然态,或完全解链 的蛋白。包涵体的形成与这些折叠态的溶解性和稳定性有关,除了分子 伴侣和折叠酶,影响包涵体形成的因素还有:蛋白质性质( 如:等电点, 脯氨酸的数量等) 和生长条件( 如:温度,诱导剂的浓度,培养基的组 分,载体的类型等) 。 3 2 共表达分子伴侣 为了避免包涵体的形成,近年来常用的策略是在表达外源基因的同 时,共表达分子伴侣或折叠酶。通常将这些辅助蛋白的基因克隆到相容 性质粒或与外源基因构成双顺反子系统实现共表达。相当多的尝试获得 了成功。例如,共表达g r o e s 和g r o e l 可显著提高可溶性重组蛋白的产量, 同时也提高了可溶性乙酰辅酶a 脱氢酶的产量和组装效率。d n a k 的共表 达能减少人生长激素h g h 的大小并提高其表达产量。但也有一些研究发 现,共表达没有明显的效果,g r o e s 、g r o e l 或d n a k 可能只在某些情 4 山东农业大学硕士学位论文 况下有效。目前还没有种通用的方法来解决包涵体的形成问题。除了 上述从机理方面降低包涵体形成的研究之外,还有一些从实际角度出发, 通过改变包涵体的影响因素加以研究的。例如( 1 ) 在允许的生长温度内 ( 1 6 3 0 ) 降低培养温度,( 2 ) 加不能代谢的糖,如蔗糖、棉籽糖等, ( 3 ) 更换宿主菌,( 4 ) 降低培养液的p h 值,( 5 ) 采用丰富培养基等 ( o o b r o v e t s k ye ,e t a l ,2 0 0 5 ) 。 3 3 寡聚蛋白的重组 除了直接表达重组蛋白,还可以将重组蛋白融合在某些易于高效表 达和纯化的“融合头”,融合表达往往可以获得外源基因的高效表达, 减少蛋白酶的降解,并提供特异简单的纯化方法,通过人工设计的蛋白 酶切割位点或化学试剂断裂解位点,可以在体外去除融合蛋白n 端的“融 合头”。研究发现,重组的融合蛋白有较好的可溶性,目前较好的融合 表达系统,如谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白m b p 、金黄色葡萄球菌 蛋白a 等系统通常都能够产生高效表达的可溶性融合蛋白。 4 本课题的研究意义和目的 s a r s 冠状病毒基因组中的非结构蛋白n s p l 4 基因被认为在s a p s 基因组的保守性方面起重要作用,也可能作为药物治疗和疫苗研究的靶标。 这使我们对非结构蛋白n s p l 4 基因的研究具有了重要的现实意义。通过对 非结构蛋白n s p l 4 基因克隆表达及其底物制各的研究将为n s p l 4 蛋白的功 能的研究奠定基础,同时也将为s a p s 的防制提供新的思路。 刘杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制各 试验研究部分 试验一、s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆 s a r s 的病原为一种新的冠状病毒。该病毒属于最大的趴a 病毒,其 基因组约有3 万个核苷酸。为保证其巨大r n a 基因组的正常复制,该病 毒具有特殊的复制机制。一般认为r n a 聚合酶不具有校正功能,这也是 r n a 病毒基因组复制易产生高频率突变的原因。但从目前的基因组分析 结果看,s a r s c o y 的突变率却小于基因组比它小的一些r n a 病毒( 如丙 型肝炎病毒) 。 根据基因b a n k 中公布的核酸序列,人们经过b l a s t 比较,发现在非 结构蛋白1 b 区的一段序列非结构蛋白n s p l 4 与其它生物的核酸外切酶有 非常高的同源性。因此我们推测s a r s - - c o v 在基因组复制过程中,其非 结构蛋白n s p l 4 与r n a 聚合酶一起行使了类似d n a 聚合酶的校正功能, 以保证其庞大r n a 基因组的相对稳定。 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 模板与菌株 s a r s 冠状病毒( s a r s c o v ) 的非结构蛋白n s p l 4 的c d n a 片段由中 科院微生物所分子病毒实验室提供。克隆载体p g e m t 载体为p r o m e g a 公 司产品,大肠杆菌d h 5 a 为本实验室保存。 1 1 2 试剂 b a m h i 与肋d i 限制性内切酶,p y r o b e s td n ap o l y m e r a s e 为p r o m e g a 公司产品、t 4 d n a 连接酶为t a k a r a 公司产品。所需引物自行设计,上海 博亚生物技术有限公司合成。 1 1 3 仪器 p c r 仪为p e r k i ne l m e r 公司产品,w a t e rp r o 纯水器为l a b c o n c o 公 司产品,冷冻离心机为b e c k m a n 公司产品,台式离心机为e p p e n d o r f 公 山东农业大学硕士学位论文 司产品,恒温摇床为n b s 公司产品,核酸电泳槽、水浴锅,电子天平、 磁力搅拌器、旋涡震荡器等均为国产仪器。 l - 2 方法 1 2 1 克隆载体的构建 原核表达载体的构建策略如下:根据公布的s a r s 冠状病毒非结构蛋 白n s p l 4 的基因序列设计引物,用p c r 的方法把该基因从s a r s 冠状病毒 的c d n a 片段中扩增出来,连接到t 载体中。 1 2 1 1 目的片段的p c r 扩增 利用p c r 方法从s a r s 冠状病毒( s a r s c o y ) 的非结构蛋白n s p l 4 ( e x o ) 的c d n a 片段中把全因扩增出来,该基因的长度为1 5 8 1 b p 。根 据g e n b a n k 中报道的s a r s - - c o v 的非结构蛋白n s p l 4 序列设计57 及3 引物:57 引物5 c g c 坠! 堕6 c ag a aa a tg t a37 ( 下划线部分 为毖棚i 酶切位点) 3 引物5 t t ac t cg a gc t gt a ac c t6 g t3 ( 下划线部分为肠以酶切位点) 。以s a r s 病毒的c d n a 片段为模板进 行p c r 扩增,为增加其特异性,以热启动的方式进行。反应条件如下: 9 5 5 m i n ;9 2 l m i n ,5 4 l m i n ,7 2 1 5m i n ,共3 0 个循环;7 2 1 0m i n 。p c r 扩增产物经1 的琼脂糖凝胶电泳检查,经无水乙醇沉 淀法纯化即可用于下一步反应。 1 2 1 2 琼脂糖凝胶电泳 1x t h e ( 4 0 m m o l lt r i s 一乙酸,l m m o l le d t a ) 缓冲液配成所需浓度 的琼脂糖凝胶溶液,微波炉加热使琼脂糖完全溶解之后,加溴化乙锭 ( 5 m g m le b ) 至终浓度为o 5ug m l ,混匀后倒入根据需要选定并封固好 的电泳胶模中,凝胶厚度在3 5 m m 之间( 快速鉴定时可适当厚些) ,插 入宽度相当的梳子,梳子距底板大约0 5 l r a m 。待凝胶完全凝固后( 约 3 0 4 5 m i n ) ,小心拔出梳子,拆去封条,将凝胶放入装有0 5 t a e 的电 泳缓冲液的电泳槽中,使电泳缓冲液刚没过胶面( 约l m m ) 。然后取适 量待电泳的d n a 样品滴在p a r a f i l m 膜上与1 6 体积的电泳上样缓冲液 ( 0 2 5 溴酚蓝,0 2 5 - - 甲苯青f f ,4 0 s 蔗糖) 混匀,用微量加样器将混 合样品加到加样槽中,以5 v c m 的电压电泳。当溴酚蓝电泳至适当位置 后,用长波紫外灯观察并记录结果或拍照。 刘杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制备 1 2 1 3d n a 片段的纯化 用无菌锋利的刀片在紫外灯下切取含目的d n a 条带的凝胶块,大小 约3 0 0 m g 。将凝胶块放入1 5 m le p 管中,6 0 7 0 孵育至凝块完全溶化。 加入i m l 纯化树脂充分混匀2 0 s e c ,但不能漩涡器混匀。将3 m l 一次性 注射器活塞拔出,将微柱与注射器连接。将制备好的树脂凝胶d n a 混合 物移入注射器桶,插入活塞,将样品轻轻推入微柱中。拔下微柱抽出活 塞( 不能先抽出活塞) ,再将注射器与微柱连接,移入2 m 1 8 0 的异丙 醇于注射器中,插入活塞轻轻推,使异丙醇通过微柱。将微柱置于1 5 m l e p 管中,1 5 0 0 r p m 离心2 m i n 。将微柱移于一新的1 5 m l e p 管中,加5 0 m 去离子水放置l m i n ,1 5 0 0 0 r p m 离心2 0 s e c 。洗脱后的d n a 贮存于一2 0 。c 。 1 2 1 4p c r 产物片段与t 载体的连接 ( 1 ) 加a 尾 总计 1 0 p l p c r 回收产物 1 0 p c rb u f f e r 2 5 m m o l l m g c l2 4 m m o l ld a t p t a q 酶 6 5 1 a l 1 此 1 5 9 l 0 5m 0 5 斗1 7 0 ,3 0 m i n 。 ( 2 ) 与t 载体连接 总计2 0 眦 目的片段 2 连接酶缓冲液 t 4d n a 连接酶 t 载体 8 p l l o g l 1 “l 1 蛆 4 水浴过夜。 1 2 1 5 大肠杆菌感受态细胞的制各 在无菌条件下,挑取冻存于一7 0 。c 冰箱的菌种,划线接种于不含氨苄 青霉素( a m p ) 的l b 琼脂平板上,3 7 c 倒置培养1 6 h 左右。挑取单个菌 山东农业大学硕士学位论文 落,接种到3 m l 不含a m p 的l b 培养液中,3 7 振摇培养过夜。次日无菌 吸取l m l 细菌培养液加入到预热至3 7 的l o o m l 不含a m p 的l b 培养液 中,3 7 剧烈振摇( 2 0 0 r p m ) 培养。培养至o d 。= o 4 o 5 ( 约2 5 3 h ) , 冰浴1 5 m i n ,使培养物冷却至0 。在无菌条件下( 注意,以下操作均需 严格无菌且在冰水浴中进行) ,将细菌培养液转移到2 个无菌的并用冰 预冷的5 0 m t 聚丙烯离心管中。在4 。c 条件下,4 0 0 0 r p m 离一t l , l o m i n ,彻 底弃去上清,回收细菌沉淀,每管加入1 0 m l 冰预冷的7 5 m m o l lc a c l 。、 1 0 m m o l lt r i s c 1 ( p h6 5 ) 溶液重悬沉淀,冰浴l o m i n ,4 c 4 0 0 0 r p m 离t h , l o m i n ,彻底弃上清,每管用2 m l 冰浴冷的c a c i :保存液 7 5 唧o l 几 c a c i 。、l o m m o l lt r i s c tp h6 5 、1 5 ( v v ) 甘油 将菌体沉淀悬起,将 重悬好的感受态细胞分装于无菌微量离心管中,每管1 0 0 ul ,置一7 0 超低温冰箱或于液氮中冻存备用。 l _ 2 1 6 连接产物的转化 将0 1 瞻的连接产物加入2 0 0 p l e c o l i 感受态细菌中,冰浴3 0 m i n ( 在此过程中,可轻轻摇动三次,以防受体菌沉积在管底,但振荡次数 不宜过多,以免影响d n a 在受体菌表面的吸附) ;冰浴后,4 2 水浴中 热冲击9 0 s e c :冰浴中冷却至o ,加入无抗生素的l b 培养基至l m l , 于3 7 振荡培养1 h 后,取2 0 0 肛1 涂于含x - g a l 和i p t g 的抗性l b 平板 上,倒置于3 7 培养箱中培养至克隆出现。培养后,用灭菌牙签取白色 菌落点种另一含氨苄青霉素的培养平板留种,然后将牙签放入含有氨苄 青霉素的l b 液体培养基中,3 7 。c 摇床培养过夜。 1 2 1 7 重组子的小量制备与鉴定 将培养物转入1 5 m l 的微量离心管中,6 0 0 0 r p m 离t l , 3 m i n ,将管倒 置于吸水纸上,尽可能地吸去残留的培养液。用1 0 0 1 2l 冰预冷的溶液i ( 5 0 m m o l l 葡萄糖,2 5 m m o l lt r i s c 1p h8 0 ,l o m m o l le d t a ) 重悬 细菌沉淀。加入2 0 0ul 新配制的溶液i i ( 0 2 m o l ln a o h ,i s d s ) ,颠 倒数次混匀,加入1 5 0 肚l 冰预冷的溶液i i i ( 3 m o l lk a c ,5 m o l l 冰乙 酸) ,颠倒混匀,冰浴5 m i n ,4 。c1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n 。取上清分别加 等量饱和酚、饱和酚:氯仿:异戊醇( 2 5 :2 4 :1 ) 、氯仿:异戊醇( 2 4 : 1 ) 各抽提一次,最后取上清加2 倍体积冷无水乙醇,混合均匀,一2 0 j 9 刘杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制各 放置3 0 m i n ,1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ,弃上清,沉淀用7 0 冷乙醇洗涤两次, 室温干燥,用2 0 ul 含终浓度2 0 ug m l 的无d n a 酶的r n a 酶( 1 0 m g m 1 ) 的t e ( 1 0 m m o l lt r i s c 1p h8 0 ,i m m o l le d t a ) 溶解沉淀。1 琼腊 糖凝胶电泳鉴定质粒,大于t 载体的质粒初步确定为重组质粒,命名为 p g e m - e x o 。 质粒经限制性内切酶酶切:在1 5 m le p 管中,加质粒2 “1 ,踟棚i ( 2 0 u u1 ) 1u1 ,上狞d i ( 1 0 u u1 ) 2 ul ,1 0 b u f f e r 2 1 11 ,d d h 2 01 3 1 1l 。 混匀后,3 7 水浴3 h ,酶切产物于1 琼脂糖凝胶中电泳。 1 2 1 8 质粒d n a 的定量技术 以t e ( p h8 o ) 为空白对照,用b e c k m a n 6 4 0 型紫外分光光度计测 定波长2 6 0 a m 和2 8 0 n m 的核酸溶液光密度( 0 d ) 值。o d 。= l 相当于含质 粒大约5 0 ug m l ,双链d n a 纯品的o d :。0 d 。值为1 8 ,若o d :。o d 。值 明显低于l _ 8 ,则可能有蛋白质或酚污染,需进一步纯化。 1 3 原核表达载体的构建 重组t 载体经限制性内切酶b a l i 与x h o i 双酶切后插入到原核表达 载体p e t 3 0 a ( + ) 中,建成了重组表达载体p e t 3 0 a - e x o 。 1 3 1 酶切 将p g e m e x o 与p e t 3 0 a 同时用b 3 m 2 h i 和x h o i 双酶切。取2 u l1 0 鄙艮 制性内切酶消化缓冲液,加入2 单位限制性内切酶,加入i u g d n a ,l u l 的b s a 加无菌水至反应体系总体积2 0u l 。将各种组分混匀,于3 7 。c 反 应2 小时。 1 3 2 回收 方法同1 2 1 3 1 3 3 连接 将酶切、回收的基因和载体进行连接。连接反应体系为:1 u 1l o x t 4 d n a 连接缓冲液,i p l 酶切后p e t s o a 载体,3 “l 目的片段,l u lt 4d n a 连接酶,用蒸馏水将体积补足1 0u 1 ,1 6 。c 连接过夜。 1 3 4 转化 山东农业大学硕士学位论文 将连接产物加入到制好的感受态细胞中轻柔混匀,冰浴3 0 分钟,热 激9 0 s e c ,冰浴3 - 5 分钟,加入l b 培养基7 0 0 u l ,3 7 摇床4 5 m i n ,将 菌液涂于平皿( l b + 1 0 0 u g m lk a n ) ,于3 7 温箱倒置培养过夜。 1 3 5 克隆的筛选 将平皿上的菌落移至另一l b 平板( 含1 0 0 u g m lk a n ) ,3 7 培养 8 h 后,提取质粒,限制内切酶b a l i 与肋d i 鉴定,将酶切鉴定为阳性 的克隆送上海英骏生物公司测序。 2 结果 2 1s a r s 冠状病毒( s a r s c o v ) 的非结构蛋白n s p l 4 基因的p c r 扩增 利用p c r 方法从s a r s 冠状病毒( s a r s c o v ) 的e d n a 片段中非结构 蛋白n s p l 4 ( e x o ) 基因扩增出来,该基因的长度为1 5 8 1 b p 。p c r 鉴定结 果见图1 。 倒1 非结构蛋自n s p l 4 基因的p c r 扩增 m 分子量m a r k e r 1 非结构蛋白n s p l 4 基因的p c r 扩增产物 从图l 中可以看出,在目的片段前面出现了大量的引物二聚体,为 了保证扩增产物的真实性,使用了高保真酶p y r o b e s td n ap o l y m e r a s e , 为了减少非特异,我们采用了热启动的方式进行p c r 反应。 2 2 表达载体的酶切鉴定 将n s p l 4 基因克隆到表达载体p e t 3 0 a 中,命名重组子为 p e t 3 0 a e x o 。重组予经b a d i 和x h o i 双酶切,鉴定结果如图。 2 1 刘杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制备 图2 重组质粒的酶切鉴定 1 d n a 分子量m a r k e r 2 p e t 3 0 a e x o 的酶切鉴定 从上图中我们可以看出,从重组载体中切出了大小在1 0 0 0 - - 2 0 0 0 b p 之间的片断。可以初步确定为阳性质粒。 2 3 测序结果 把阳性质粒测序,由于基因长度为1 5 8 1 b p ,测序仪每次只能测8 0 0b p , 因此测序分两个反应进行。以下为重组载体的测序结果。 山东农业大学硕士学位论文 1 测序结果( 1 ) 刘杰:s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 基因的克隆表达及其作用底物的制各 2 测序结果( 2 ) 2 4 鲁9迸簧强*囝曰蔷q鞫国园斟窖型镬司舟强q蓦鬣a謇套琶筠昌鼋封委:;:r。;:船r;:;靼;:;一瞻。;。扣r:o。谍;:。;i_=r;:。:臻:;地r:。:琵:;。:。强r。:。;。醇。:丑鲁冀强茸藿霭錾营錾莛蚕毫鹭萋鹫羹鼋芎警堑耋 山东农业大学硕士学位论文 试验二、s a r s 冠状病毒非结构蛋白n s p l 4 的表达与蛋白纯化 分子克隆是目前获取某些蛋白较为常用的手段。但是目前成功表达 的蛋白多为分泌蛋白和分子量较小的蛋白。利用原核表达系统表达长度 超过1 0 0 个氨基酸的胞质蛋白,在任何系统都比较困难,对于分子量大 的蛋白质,目前的策略就是对其氨基端与羧基端分别进行表达。 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 i 质粒和菌株 表达载体p e t 3 0 a - e x o 由实验构建。 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 由本实验室保存。 1 1 2 酶和试剂 i p t g 为p r o m e g a 公司产品,0 4 5 p r o 、0 2 2 p r o 微孔滤膜为m i l l i p o r e 公司产品,p r o t e i na s s a yk i t 为b i o r a d 公司产品,其它分子生物 学试剂和化学药品均为国产分析纯。 1 1 3 仪器 蛋白电泳槽为b i o r a d 公司产品,s o n i p r e p l 5 0 超声破碎仪为m s e 公司产品恒温摇床为n b s 公司产品,台式离心机为e p p e n d o r f 公司产品, 电泳仪为北京六一仪

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论