（物理化学专业论文）目铈配合物定点水解切断dna的研究.pdf

上海师范大学理学硕士论文 摘要 在生理条什下能瑚效水解切断核酸的人 ：内切酶的研制具有十分皿蛰的研究意义年1 j 应 用价值。国内外的研究报道已经表明了金属离子及其配合物对核酸的磷酸= 醣键只有水解切 、“ 断作用，但对它们的研究还刚刚处于起步阶段，还有许多值得深入探讨的地方本论文系统 研究了寡聚脱氧核苷酸在电极表面的吸附状态的变化以及寡聚脱氧核苷酸铈配合物人工内 切酶对d n a 的定点水解切断作用。 f l 由于众多生物化学变化都发生在荷电界面上，因此研究核酸在带电界面上的吸附行为是 非常有必要的。本文首先以1 3 个碱基长短的d n a 片断和2 6 个碱基长短的d n a 片断为研 究对象，运用原位电化学表面增强拉曼光谱技术研究了1 3 m e r sd n a 和2 6 m e r sd n a 在带 电银电极表面上的吸附状态。测定了1 3 一m e r sd n a 和2 6 - m e r sd n a 在银电极表面上的增强 拉曼光潜，研究了电位变化对d n a 分子的表面增强拉曼光谱变化的影响并推测了这两种 生物分子在银电极表面的吸附状态及其随电位变化的情况 比较了不同链长d n a 的表面增 强拉曼光谱随电位变化而响应的速率，并推测了其原因。 我们所设计的人工内切酶包含两个部分。一是识别部分二是切割部分。为了使人工内 切酶能够定点切断d n a 首先必须要使其识别目标d n a 井牢固地结合到目标d n a 上。我 们所殴计的人工内切酶的识别部分为与目标d n a 碱基互补的一个d n a _ | 片断。为了研究其 与目标d n a 的作h j ，我们采用了离子荧光探针法作为检测手段，这种方法具有灵敏度亮、 快速、简便、实用的特点。实验结果表明合成的人工内切酶能特异性地结合到目标d n a 上。 在此基础上我们首次采用了铽离子荧光探针法检测了三链d n a 的形成。众所周知三链 d n a 是反基因技术及反义技术的核心，它控制着基因的表达及抑制作用，因此三链d n a 也是目前的研究热点之一。我们的实验结果表明铽离子荧光探针法能构检测三链d n a 的形 成与否，同时我们也研究了铽离子与不同类型的三链d n a ( 嘧啶嘌岭嘧啶，嘌呤嘌 、 呤啼啶) 作用后的荧光光谱，探讨了p i l 高低，金属离子的存在对三链i ) n a 形成的影响。，0 ， 在e l 二埘i l f 究基础上。我们通过乙二胺把e d t a 共价连接在舍有l o 个碱基的寡聚脱氧核 苷酸的5 末端上，然后与铈离子配合，合成了限制性人工内切酶，实验结果显示该限制性 人：f ：内切酶具有识别d n a 井定点水解切断目标d n a 的功能，并对其切断机理进行了解释。 i t l 5 l , ，我们还合成了4 甲基2 ，6 - = ( n ，n 二羧甲基) 甲氨基苯酚的铈的双核配合物，并 对该珂己合物对双链d n a 的切断作用进行了初步的探索：由于胶柬是理想的细胞模拟器件， 我们还初步研究了铈离子在胶束体系中对d n a 的切断作用。 关键词：人： 内切酶，。n a ，寡聚脱氧核苷酸删三链。n a ，。n a 西点切断， 表面活性剂，g 甲基2 ，6 二( n ，n 二羧甲基) 甲氨基苯酚( h x l a 矽氙核配；荔，g 面增强 拉曼光潜( s e r s ) , 荧光光潜伸| u 。r e s c e n c e 8 p e c ”u i 们，电泳- 银电极l 7 中图分类号：q 5 2 ，0 6 4 6 2 上海师范大学理学硕士论文 a b s t r a c t s y n t h e s i so ft h ea r t i f i c i a le n d o - e n z y m et h a tc a nh y d r o l y z et h ed n as t r a n da ts p e c i f i cs i t e q u i c k l y i n p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n i sah o tr e s e a r c h d i r e c t i o n m a n yt h e s e sp u b l i s h e d h a v e d e m o n s t r a t e dt h a tm e t a li o n sa n di t sc o m p l e xc a nh y d r o l y z et h ep h o s p h o rd l e s t e ro fn u c l e i ca c i d s ， b u tt h e s er e s e a r c hi s j u s ti nap r i m a r y s t a g e t h e r ea r em a n ys e c r e t e ss t i l li nd a r kt ob ee x p o s e db y u s i nt h i s t h e s i s ，w e s y s t e m a t i c a l l y s t u d i e dt h e a b s o r p t i o n s t a t e c h a n g e o ft h e o i i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ( o d n ) o nt h es i l v e re l e c t r o d es u r f a c ea n dt h es p e c i f i ch y d r o l y s i so f t h e o d n b yt h ea r t i f i c i a le n d o - e n z y m e f o rt h er e a s o nt h a tm a n yb i o c h e m i c a lr e a c t i o n so c c u r r e do ut h e c h a r g e ds u r f a c eo ft h e m e m b r a n e ，i ti sn e c e s s a r yt os t u d yt h ea b s o r p t i o ns t a t eo ft h eo d n o nt h e s ei n t e r f a c e s h e r ew e f i r s ts t u d yt h es u r f a c ee n h a n c e dr a m a n s p e c t r u mo f1 3 - m e r so d n a n d2 6 m e r so d no ns i l v e r e l e c t r o d e ，a n dt h e nw es t u d yt h ei n f l u e n c eo ft h ep o t e n t i a lt ot h ea d s o r p t i o ns t a t eo f t h eo d no n t h es i l v e re l e c t r o d e b yu s i n gt h es u r f a c ee n h a n c e dr a m a n s p e c t r u m ，w eg o t t h el n f o r m a t i o no f t h e o d na b o u th o w t h e ya d s o r p t i o no nt h ee l e c t r o d ea n dh o wt h e yc h a g et h e i ra d s o r p t i o ns t a t e w e a l s os t u d yt h ed i f f e r e n c eo fr a m a n s p e c t r ab e t w e e nt h eo d n s t h ea r t i f i c i a le n d o - e n z y m ew ed e v i s e dc o n t a i n st w op a r t s o n ei sc a l l e dr e c o g n i t i o nf a c t o r a n dt h eo t h e ri sc a l l e ds c i s s o r t oc l e a v ed n as p e c i f i c a l l y , w ef i r s tm a k et h ea r t i f i c i a l e n d o - e n z y m et or e c o g n i z et h es u b s t r a t ea n dc o m b i n ef i r m l yw i t hi t t h er e c o g n i t i o nf a c t o ro ft h e a r t i f i c i a l e n d o e n z y m ew ed e s i g n e dh a st h es a m eb a s es e q u e n c ew i t ht h es u b s t r a t ed n a f o r s t u d y i n gt h er e a c t i o nb e t w e e nt h ee n d o e n z y m ea n dt h es u b s t r a t e 。w ei n s p e c tt h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r u mo f t h i sr e a c t i o nb yu s i n gi o nf l u o r e s c e n c ep r o b e a n dt h i sm e t h o dh a sm a n ym e r i t ss u c h a s h i g hs e n s i t i v i t y ，m a n a g e a b i l i t ya n de t c t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h a tt h ec o m p o u n d s y n t h e s i z e df o rc l e a v i n gd n as p e c i f i c a l l yc a nc o m b i n ew i t ht h es u b s t r a t ed n av e r ye s p e c i a l l y a n df l r n d y o nt h eb a s i so ft h o s er e s e a r c h w es t u d yt h ef o r m a t i o no ftr - h e l i xd n a b yu s i n gt h e i u o r e s c e n e ei o np r o b e t r i - h e l i xd n ai st h ec o r eo ft h ea n t i s e n s ea n da n t i g e n et e c h n o l o g y i t c o n t r o lt h ee x p r e s s i o na n ds u p p r e s s i o no f g e n e o u re x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h a tt b ”c a nd e t e c t t h ef o r m a t i o no f t r i - h e l i xd n a a n dw ea l s os t u d yt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ao f t b ”a f t e ri tr e a c t s w i t hd i f f e r e n tk i n d so f t r i h e l i xd n a a n dt h ei n f l u e n c e so f p ha n dm e t a li o n st ot h ef o r m a t i o no f 3 上海师范大学理学碗士论文 t r i - h e l i xd n aa r ea l s od i s c u s s e d a f t e rt h o s er e s e a r c hw o r k ，e d t ah y d r i d ew e r ea t t a c h e dc o v a l e n t l yt ot h e5 p h o s p h o r o u s t e r m h m so ft i l et o - m e r so d nv i aa l le t h y l e n e d i a m i n el i n k a g et op r e p a r eas e q u e n c e - r e c o g n i z i n g m o i e t y t h e ns e q u e n c e s p e c i f i cc l e a v a g e o f2 6 m e r so d i nw a ss t u d i e d b yc e 4 + c o m p l e x c o m p o u n dw i t hs e q u e n c er e c o g n i z i n gm o i e t y t h ee x p e r i m e n t r e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tt h e a r t i f i c i a le n d o - e n z y m ec a nh y d r o l y s i st h ed n aw i t hs e q u e n c es p e c i f i c i t ya n dt h em e c h a n i s mo f t h i sc l e a v a g er e a c t i o ni sa l s o s t u d i e d b e s i d e st h e s e ，h x t a - 2 c ec o m p l e xi ss y n t h e s i z e da n dt h ec l e a v a g er e a c t i o no f h e l i xd n a b y t h eb i n u c l e a rc o m p l e xi sa l s or e s e a r c h e d m i c e l l ei sak i n do fi d e a ls i m u l a t i o nd e v i c eo fc e l l s w e d i s c u s st h eh y d r o l y s i sr e a c t i o no f d n a b yc e 4 + i nm i e e l | e k e y w o r d s ：a r t i f i c i a le n d o - e n z y m e ，d n a 。o l i g o d e o x y n u c l e i ca c i d ( o d n ) 。t r i - h e l i xd n a 。 s u r f a c t a n t ，h x t a ，b i n u c l e a rc o m p l e x ，s u r f a c e e n h a n c e dr a m a n s p e c t r u m ( s e r s ) ， f l u o r e s c e n c e s p e c t r u m ，e l e c t r o p h o r e s i s ，s i l v e re l e c t r o d e 上海师范大学理学硕士论文 第一章文献综述 一、研究意义 2 0 世纪后2 0 年是化学与生物学互相交融，高速发展的2 0 年，他们互相渗透，并不断 和其他学科互相交叉，相互渗透。国际上于2 0 0 1 年i u p a c 把下属的d i v i s i o ni l l 改名为 o r g a n i c b i o m o l e c u l a rc h e m i s t r y 从而更加突出了对生物分子的化学研究。我国则组织了“攀 登计划”的研究，组建了“生命有机国家重点实验室”等。随着研究工作的深入，人们已经 开始从分子的水平理解生命过程。2 0 0 0 年，人类基因草图的绘制完毕，2 0 0 1 年国际公共领 域人类基因组合作计划和美国c e l e r a 公司公布的人类基因组图谱，则预示着一场以排列人 类基因组d n a 序列的“结构基因组”的研究阶段基本完成，基因组研究翻开了历史新篇章。 一个以破渌，解读，玎发基因组功能信息为主要研究内容的, e t a , 已经开始即进入了后基因 组时代。这不仅是当今生物学领域内最重大的事件之一，而且也是人类历史上最重要的科研 工程之一，它标志着2 1 世纪将是化学生物学的世纪。 目前对于化学生物学虽然还没有一个公认的定义，但从分子的基础去研究和了解生物 大分子之间以及化学小分子与生物大分子之间的相互作用以及这些作用对生命体系的调节、 控制都有很多研究的共同点。化学家相信如果人类3 万5 千个基因相互作用、相互调节控制 了生命过程那么一定也会发现至少3 万5 千个可以调节控制这些基因的化学小分子，也会 带来至少3 万5 千个这些小分子如何调节这些基因的化学问题。它主要运用一些化学手段来 来研究生物学的内容。化学手段包括合成的结构的和分析的被运用于生物和医学问题。 当前化学生物学主要有兰大研究热点。l 、化学遗传学就是采用小分子活性化台物作 为探针探索和控制细胞过程。用化学生物学能够寻找微扰细胞内过程或系统。而其细胞内 靶点尚不清楚的化合物，然后通过对这些分子探针作用模式的生物化学解析，得到有关复杂 的细胞过程的新认识。2 、分子进化及其系统工程的研究。一方面分子进化是研究生命起源 的的m 要内容# 另一方面，研究天然化合物的生物合成途径拥示通过脱钒核糖核酸( d n a ) 、 核糖核算( r n a ) 、蛋白质雨i 糖等生物大分子的突变和选择改变生物表型和性状进化的分子 机制。3 、生物体系的小分子调控中，分子识别和分子间相互作用的化学基础研究。即寻找 自然界巾的生物活性物质在生物体中的靶位点，研究小分子与生物大分子之间的相互作用、 构效关系和作用机制，其中人工核酸切断试剂是这一研究方向中最为活跃的前沿领域之一。 核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础之一。它在生物的生长、发育、繁 殖等正常生命活动有关；另一方面，核酸与生命的异常情况，如肿瘤的发生、遗传病也密切 5 上海师范大学理学硕士论文 相关。闳此剥核酸的研究和应用已经成为了生物学、医学和化学生物学研究的重要内容。限 制性人工内切酶则是其中的重要课题之一。选择性地水解切断磷酸二醣键是基因工程的重要 问脚，1 有巨人的i 忤在廊川前景和经济效黼，但是核酸的磷酸二酗键在生理条件及非酶存在 条件下，稳定性非常高。例如：在p h = 7 及温度为2 5 3 2 的环境中，d n a 和r n a 中磷酸二 酯键的半衰期分别为8 0 0 ，0 0 0 ，0 0 0 年和2 0 0 0 ，0 0 0 ，0 0 0 年。目前，水解切断核酸除用天然酶外 还没有其他有效的办法，但是天然酶的识别序列短，造成切断片断过短，一般仅为4 - 8 个碱 基，碎片过多，无法满足分子生物学和基因工程的 ； 要，也不利于碎片的进一步利用。因此 开发山高效的人工核酸切断试剂，具有非常重要的理论意义和应用价值。 二、研究进展 限制性内切酶之所以能特异切割核酸分子，是因为其中的酶蛋白能够识别核营酸的特 殊序列并与之结合并由酶分子中的化学基团切断核酸中的磷酸= 酯键。人工合成的核酸酶 也同样由两部分构成一是断裂系统s ( s p l i t ) ，为某种核酸切割试剂，主要包括金属和非 金属，多胺和抗生素等 = 是识蹦系统r ( r e o r g a n i z a t i o n ) ，它能识别核苷酸上的序列并与 之结合主要包括寡聚脱氧核营酸( o d n ) ，肽核酸( p n a ) ，多酰胺等物质。所以人工内 切酶可以简写为r s ，理论上它可以在核酸底物的特定部位将其断裂。显示出与限制性内切 酶类似的生物功能因此人工核酸切割试剂也被称为人工核酸酶。图i 1 是人工核酸定位切 断试剂的示意图。 图1 1人工核酸酶定位切断棱酸示意图 f i g u r ei 1 t h es k e t c hm a po f n u c l e i ca c i d sc l e a v a g e db ya r t i f i c i a ln u c l e a s e s l 、断裂系统 核酸的断裂系统按作用机理可以分为自由基氧化机理、水解机理及消去机理三大类。 1 1 按自由基机理氧化切割核酸的试剂 此类切荆试荆主要包括过渡金属配合物和一些抗生素类药物。由于r n a 比d n a 容易 发生水解，有关r n a 的水解大多按水解机理进行所以目前按自由基机理切割核酸的研究 6 上海师范大学理学硕士论文 主要集中在d n a 上，而且研究集中在f e ，c u ，c r 等几种金属上，下面对各种断裂试剂做一 简单介绍。 1 1 i f e ( 1 1 ) 一e d t a h 2 0 2 体系 在足迹图谱技术中e d t a f e ( 1 1 ) h 2 0 2 常作为d n a 断裂工具而用于双链d n a 的非特 异断裂，原理是e d t a 与f e ( i i ) 形成配台物，促使h 徊2 还原生成o h 自由基与d n a 的脱 氧核糖作用，从而导致d n a 链的断裂。1 1 , 2 , 3 1 。 1 1 2 f e ( 1 1 ) 一p e n t a d e n t a t e h 2 0 2 体系 h i r o m a s ak u r o s a k i 4 j 等研究表明f e ( i i ) 【五齿配体】在h 2 0 2 存在下能氧化切断d n a ，是一 个自由基氧化机理，且在配体的苯环上有氟存在时能提高1 1 i 己食物的稳定性及其切断d n a 的活性。 1 i 3 c u ( 1 1 ) 一胆红素，胆绿素体系 s f a r h a na s a d l 5 i 等研究表明一些过渡金属元素特别是铜在和一些生物体内的新陈代谢 中闻物和前体结合后如c u ( i i ) 在胆红索删曼绿素的作用下被还原成c u ( i ) ，同时产生活性 氧自由基，自由基在同d n a 作用后将d n a 氧化切断。 1 i 4 c u ( 1 1 ) 一j 衄清素体系 相似的现象也在多巴胺1 6 l ，血清素等代谢物质、神经传递物质中发现，如n a g h m a h a d i 7 等发现i m 消素在有铜离子存在的条f r f 能诱导d n a 链发生断裂，其机理也是氧化切削机理。 i 1 5 c u ( e n ) 2 2 + o r c u ( e d t a ) 。0 2 体系 q in 0 乙二二胺或e d t a 一己台物在0 2 存在下能够犬大提高切断d n a 的遮率，这也是基 于氧化机理发生的【。】：1 相似的变化也发生在铜1 。l o 菲咯啉配合物与d n a 的作用中f 9 | ，这些 功断反应都平配合物的l l ；i 极i 乜位有关，当电极l 电位达到氧化还原电位时。伴随精铜的氧化还 原，产生自由基，再由自由基去切断d n a 。 1 1 6 大环铜配合物h 2 0 2 体系 计攮年等合成了儿种不同的铜大环配合物，并探讨了他们和小牛胸腺d n a 的作用方式， 发现大环配合物支链的不同会影响他们与d n a 的作用模式。有平插作用，氢键作用及疏水 作用三种。同时发现他们在有h 2 0 2 存在的条件下，都对d n a 有切断作用。 1 i 7 三核铬配合物体系 三核铬配合物 c r o ( 0 2 c c h 3 ) 6 ( h 2 0 ) 3 】+ 在h 2 0 2 存在的条件下，能通过产生的自由基切断 d n a 但是令人感到奇怪的是该配合物在相同的条件下，也能水解单酯和双酯化合物的磷 酸二酯键。l i o l 7 上海师范大学理学硕士论文 1 1 8 抗生素类切割试剂 许多具有抗肿瘤功能的抗生索也能够断裂双链d n a 。如多肽及蛋白质类抗生素博莱霉 索( b l e o m y e l n ) 它与f e ”、c o ”、c u ”、c u + 等离子结合后，由分子钒或h 2 0 2 等活化，在 结合位点断裂d n a ，切割产物包括自由碱基，带3 和5 - 磷酸末端的d n a 碎片以及带3 - 磷酸甘油醛末端的d n a 碎片。另外，蹲莱霉素还具有一定的区域选择性，它对5 - g c 3 和 5 - g t 3 含量高的部位有特殊亲和力。 i i 9 光化学切削试剂 许多光活性的物质可以在光照条件下切割d n a ，如铑配合物卟啉以及金属卟啉、铀 酰盐、双核p t 2 + 离子配合物、寓勒烯和四苯基卟啉磷化合物等它们的主要作用机理是在光 照的条件下生成o h 自由基或单线态氧。从而导致d n a 链的断裂 1 2 i 。 从上面所介绍的儿类切割试剂以及它们的切割机理来看，我们不难发现它们的共同特点 是通过形成活性氧( 如o h 自由基、0 2 、h 2 0 2 等) 作用于d n a 上，氧化d n a 大沟或小沟中 的氢原子，破坏核酸上的核糖环或碱基，从而导致核酸链的断裂。这种断裂核酸的方式存在 较多的缺点：苘先，严重破坏核酸链上碱基和脱氧核糖环，最终产物往往为3 和5 磷酸末 端，游离碱基及其它一些碎片，切割产生的末端不同于酶解产生的末端，因此不能再用连接 酶重新连接。其次由于这类试剂产生的自由基很容易扩教。会造成多个位点切割，用这类 切割系统的定位切割试剂很难进行真正的定位切割。第三，自由基对生物活体有毒副作用 无论是用于进行细胞内研究或作为药物都是不利的。晟后，此类切割试剂往往需要氧化还原 活性的辅助因子，这将增加体系的复杂性。 1 2 按酯水解机理切断d n a 磷酸二醑键的试剂 核酸中磷酸二醑键的水解也可以导致核酸的断裂此类切割试剂主要包括一些核酸酶的 模拟物、= 胺和多元胺、二肽和多元肽、碱土金属m g 及其配合物、稀土金属离子和配合物 等以及少最的c u 、f e 和c o 的配合物。 i 2 i 核酸酶模拟物 核酸酶模拟物就是选择存在于天然酶位点处的催化基团或其它具有类似作用的基团作 为催化基团，然后将它们其价连接到环糊精、冠醚或其它一些电环化合物母体上以模仿天然 酶的空间结构而制作而成。例如为了模拟r n a s ea 的作用机理b r e s l o w l i 研究小组根据 r n a s ea 的活性中心含有两个组氨酸残基的原理，将两个咪唑基团引入到b 环糊精分子中 合成的a ，b 双咪唑环糊糟对叔丁基邻苯二酚1 ，2 - 磷酸= 酗键的水解具有较高的活性，并 且还具有一定的选择性，其作用机理与r n a s ea 也极为相似，较好地显示了r n a s ea 的催 b 上海师范大学理学硕士论文 化效果和催化机理。属于此类的切割试剂还有只含一个咪唑基的酶模拟物，两个甚至四个咪 唑基连接在吖啶环上的酶模拟物等。 但是。到目前为止，此类核酸酶模拟物还存在许多缺陷，首先它的催化活性远低于核酸 酶其次它多以模型化合物为底物，且反应往往在有机溶剂中进行，所以实际上酶模拟物并 不能完全模拟酶的作用。 1 2 2 镁离子配合物 虽然镁离子大量存在于天然酶中，并作为其活性中心存在但是由于镁离子不是很好的 路易斯酸，且镁离子的配合物很少能稳定存在于水溶液中，目前的人工酶模拟物以镁离子为 活性巾心的还很少。m a k o t ok o m i y a m a i 4 等首次合成了以m 9 2 + 为活性中心的核酸切断试剂 将吖啶修饰到配合物的三亚甲基上后，该配合物的水解能力得到大大增强。同时亦有报道称 镁离子和其他金属离子共同存在时对d n a 具有较好的水解切断作用。 i 2 3 钻配合物 能够水解切断d n a 磷酸二酯键的钴的配合物大多以氮杂环烷烃配合物“1 的形式出 现。钻的氮杂环烷烃配台物在水溶液中结合两分子水。其中一分子水与二醐键中的磷相结合， 起稳定钻一氧磷过渡态的作j i _ i ，而另一分子水则以酸他化作用进攻磷酸- - m b 键，从而水解 d n a 。同时亦有报道称，钴的氮杂环烷烃配合物在水溶液中还会以氧桥键形成双核配合物 1 7 1 ，稳定过渡态币酸他化水解的作川由两个钻分别承担。 i 2 4 铜配合物 能够水解切断d n a 磷酸= 酯键的铜配合物多以多胺类配合物的形式出现”9 2 0 j ，其切 断机理与c o 配合物类似，但是在单核铜配合物水解切断d n a 磷酸：酯键时，除了结合水 能够稳定过渡态之外，配体上的噩氨基亦能和磷酸二酯键上的氧原子之间形成氢键，稳定过 渡态口i 。 1 2 5 锌配合物 锌是一种大量存在与天然酶中的金属因此以z n 2 + 为活性中心的人工核酸切割试剂的 报道较多1 2 2 , 2 3 2 4 , 2 5 , 2 6 , 2 7 | 。人们通常以氮杂环烷烃或经过吡啶基修饰的多胺类物质作为配体， 与z n ”结合。该类配合物以双核、三核配合物切断效果较好。报道也较多；单核锌配合物 对d n a 儿乎没有切断效果或较弱。锌离子本身对d n a 没有切割作用，但是它和其他金属 离子能够对d n a 产生协同催化水解的作用。 i 2 6 二胺平多元胺 乙二胺、= 乙撑三胺、三乙撑四胺以及五乙撑六胺等均对聚腺苷酸p o l y ( a ) ，聚尿嘧啶 9 上海师范大学理学硕士论文 p o l y ( u ) 乖l 聚胞嘧i 建p o l y ( c ) 有切割活性，其中又以乙二胺的切割活性最高，但这些物质对聚 鸟嘌呤却没有切割活性，这可能与r n a 的高级结构有关阻”i 。 二：元胺催化水解r n a 的条件是两个胺基的p k a 值相差较大，以保证一个胺基质子化的 同时另一个胺基非质子化，其催化机理可能与生成五配位的磷过渡态有关。多元胺的催化机 理则与二元胺相类似。 1 27 二肽和多肽 最近赵玉芬l ”i 的研究小组发现丝组二肽可以在中性条件下通过水解方式切割线型和超 螺旋型的d n a ，这是第l 例能够以水解方式切割d n a 的小肽。目前对于它的水解机理还 不是十分消楚，但 也i fj 认为丝组二肽对d n a 的切割与形成五配位的过渡态磷化合物有关。 值得_ 提的是，与丝组二肽十分相似的组丝二肽对d n a 没有切割活性有关这方面的研究 才刚刚起步相关报邀不多。 i 2 8 稀士金属离子及配合物 19 5 9 年b a m a n n l 3 毗等人首先报道了三价稀土离子对磷酸二酯键的水解作用，他们研究了 c e ”和l a 3 + 在碱性条件下对核苷酸的断裂作用指出c e ”和l a 3 + 对脱氧核苷酸的断裂作用很 慢，c e 3 + 对单核营酸的水解作用比l a ”快。此后，特别是近十年来，有关稀土离子及配合物 催化水解断裂核酸逐渐成为研究热点。 继b a m a n n 后，k o m i y a m a l 3 1 i 等人研究了l n 3 + 在p h = 8 、3 0 c t 件下对腺营二 倍体( a p a ) 及尿营二倍体( u p u ) 的水解断裂作用，指出t m 的断裂活性最高其它三价离子 的水解活性人小为：t m l u y n d ，e u ，s m c e 。s c o d t b p r d y h o ，e r y b l a 。 倪嘉缵 3 3 - 3 5 1 的研究小组则研究了稀土离子对单核苷酸的断裂作用，指出c d + 对3 ，及5 单核 苷酸的水解作用最强，其余稀土元素的断裂作用大小为重稀士 轻，中稀土。稀土离子对环 核苷酸及长链r n a 的水解断裂作用也有研究1 3 6 4 ”。如k o m i y a m a s 7 垮报道了稀土离子对环 腺1 ，酸( c a m p ) 、环鸟村陂( c g m p ) 及环尿督酸( c u m p ) 的水解断裂作川认为c e ”对环核笛 酸的断裂速度非常快，他们h p l c 的研究表明c a m p 的主要水解产物为3 - a m p ，随着反应 时间增加，再断裂为单核营酸。l u ”的许多配合物也可以切割r n a ，如与一些六亚胺基大 环化合物形成络合物可以高效催化t r n a 或聚腺苷酸( p o l y ( a ) ) 的水解。 稀士离子对d n a 体系的切割速度比r n a 慢。1 9 9 4 年c h i n t ”i 研究小组发现c e 4 + 能快速 将d a p d a 切割为d a 和无机磷。而c e 4 + 与来苏糖、核糖、木糖、戊糖醛和葡萄糖等糖类化 合物可以在中性条什f 络合形成均匀相溶液该溶液能水解切断d n a 。k 0 m i y a m a l ”l 等报道 c 与确萄糖胺的络合物可以使t p t 的水解速度提高1 0 9 倍之多。s c h n e i d e r p l l 等则研究了稀 f o 上海师范大学理学硕士论文 土双核含氮大环配合物对p b r 3 2 2 质粒d n a 的水解断裂作用发现稀土配合物主要使 p b r 3 2 2 质粒d n a 的双螺旋中的一条链断裂，生成缺口d n a 且断裂速度较快。p b r 3 2 2 质牲d n a 的! p 衰期为2 0 0 0 年而使用稀土配合物作为断裂试剂后p b r 3 2 2 质粒d n a 的 半衰期仅为5 0 m i n 。 为了进步提高人工脱氧核酸酶的倦化活性，双金属离子作用的d n a 水解工具也有报 导。根据大部分天然磷酸酯酶在它们的活性位点含有两种甚至多种金属离子，如k o m i y a m a l 4 2 l 等研究了l a ( 1 1 1 ) 离子分别和f e ( 1 1 1 ) 、s n ( i v ) 离子的拭同作用，发现此类双金属试剂对a p a 和t d t 有明显的共同催化作用。另外c e 4 + 也可以与别的三价稀土离子共同作用于核酸底物 而人人提高催化效率，如k o m i y a m a 4 ”发现当c e 4 + 与p r | + 或是n d 3 + 摩尔比为2 ：1 时c e 4 + 水 解切割d n a 的速度会大大加快，而单独的p ，或n d ”均对d n a 无切割作用。 剥于稀土离子水解切割核酸的机理说法还不一致，比如对于c e ( i v ) 离子水解断裂d n a 的机理目前说法：k o m i y a m a 3 2 3 7 4 3 1 认为c e ( ) 离子水解断裂d n a 的机理是键合在c e ( n ) 离子上的o h 进攻d n a 分子中的磷酸醑，同时磷酸醣也可与c e ( i v ) 离子配位，水解反应被 与c e ( n ) 离子键合的另一个水分子的酸性催化作用加速此时的水分子是强酸性的( p k a - - 0 ) 。 一般来说，l a 系离予可有8 - - 9 个水合分子各自( 或几个水分予) 占住一个恰当的位置，从而 起到酸性催化作用。此外，c e ( n ) 离子通过静电作用可稳定d n a 水解反应的带负电荷的过 渡态酸碱催化和静电作用的共同作用使d n a 在温和条件下易于水解。c h i n ”l 贝认为上述 机理没能解释c e ( i i i ) 催化水解需要分子氧，也没有解释c e ( i i i ) 和其它的l a 系离子在反应活 性方面的显著差别。他们认为c e ( 1 1 1 ) 离子在分子氧的作用下氧化成c e ( n ) 离子时产生一个 过氧二阴离子井与两个c e ( n ) 离子配位。然后由此配位化合物进攻磷酸= 酯键，释放出产 物胸苜。但到目前为止，没有检测到过氧磷酸醐中间物。 1 3 以消除机理切割核酸的试剂 1 9 8 1 年h e l e n e 羽tl a v a l 的研究小组同时分别发现了赖色赖三肽( k w k ) 不仅可以识别 d n a 中的脱碱基部位，并且可以在该部位产生切口，其原因可能是由于色氨酸残基团与核 酸之间的碱基堆积作用而占据了脱碱基部位附近的位置。从而使赖氨酸残基接近脱碱基部 位，而脱碱基的核糖存在半缩醛和开环的醛的互变异构，因而该点非常容易被切断。这类试 剂相当少，不具有普遍性i ”i 。 从以上的举例分析来看，与自由基氧化切割核酸的试剂相比，水解类切割试剂有许多优 点：首先，生成的碎片具有3 或5 磷酸末端，且碱基和核糖环不会被破坏因此可以用连 接酶重新连接：其次这类试剂不产生易扩散的自由基t 因此有利于合成高度序列专一性的定 i i 上海师范大学理学硕士论文 位切割试剂；第三，该体系无需还原性的辅助因子，对生物体的毒害较小。也正鉴于以上这 些原因此类切割试剂，包括稀土金属离子及其配合物：铁、铜、钴、锌和镁的配合物类试 荆可以作为定位切制试划的最佳切 l | l 系统之一。 2 、化学识别系统 化学识别系统能够识别核酸上某段核督酸序列并与之特异结合常用的主要有寡聚脱 氧核苷酸、肽核酸、蛋白质、多肽、抗生素、d n a 结合药物、吡啶，咪唑多酰胺等。它们通 过共价键或非共价键与核酸分子上的特定碱基序列、和的二级结构特定区域识别r d n ar n a 结合，形成超级体系，由此确定对d n a 和r n a 的断裂位点和断裂产物。 2 1 寡聚脱氧核苷酸 最常使用的识别系统是寡聚核苷酸，尤其是寡聚脱氧核苷酸( o d n ) 。它的识别原则是核 酸中的碱基互补配位，寡聚脱氧核营酸通过与单链d n a 或r n a 杂交形成双链。与双链d n a 或r n a 形成三螺旋结构，完成对它们的特异识别。随着寡聚核苷酸合成技术的不断发展， 人们可以根据需要合成任意序列的寡聚核营酸识别系统，在预先设计的位点切断d n a 。 m o s e ：4 4 等利用寡聚脱氧核苷酸e d t a f e ( i i ) 配合物通过形成三螺旋结构对双链的质粒 p d m a g l 0d n a 片断成功进行了断裂反应。s i g m a n i ”1 研究小组将f c u ( p h o n ) 2 + 与一段r n a 相连后刚于切割单链或双链的d n a 。k o m i y a m a l 4 6 , 4 7 】等则提出了一种制备带有1 9 个碱基片 断的寡聚脱氧核苷酸的c e o v ) 配合物( d n ai d a c e 0 v ) ) 的简单程序，该程序对寡聚脱氧核 苷酸碱基序列及长度无任何限制，在p h = 7 5 ，3 0 c 时，用制各的d n ai d a c e 0 v ) 去切断一 个含4 0 个碱基的单链d n a ，d n a i d a 中的1 9 个碱基与底物d n a 中互补的1 9 个碱基配位， 而连接在d n ai d a 端的c e ( i v ) 离子定位在底物的a 3 l 和c 3 2 间，对其进行切割。电泳图 显示切制正好发生在a 3 l 与c 3 2 闻，切割效率为6 0 。 2 2 蛋白质和多肽 许多天然存在的蛋白质和多肤能与d n a 的特定部位结合对基因袭达起一定的调控作 用。李i ：卿【”i 等人认为蛋白质对双螺旋核酸专一性识别的一种可能方式可能涉及到双螺旋 d n a 的种特别的拓扑性质称为d n a 片断的碱基空间模型( b a s es p a t i a lp a t t e r n ，b s p ) 。博 莱霉素( b l m ) 是一种天然存在的糖肽临床上常用来治疗头、颈及磷状细胞癌，其结构 通常可分为3 个功能区：n 端主要与金属离子和氧结合并切断d n a ；糖残基被认为是分 子对细胞表面进行识别的功能区：由二噻唑与不同阳离子取代基所构成的c 端则构成d n a 的识别天。e b r i g h t l 4 9 1 等将c a p 与p h e n 共价结合生成具有核酸酶活性的c a p p h e n 作用于 含有c a p 识别位点的d n a 上可在结合位点进行断裂。n a g a o k a i ”1 等人以及d e r v a n l 5 u 的 1 2 上海师范大学理学硕士论文 研究小组则分别将甘甘组三肽与n i 2 + 或c u 2 + 的络合物共价连接到一个具有锌指结构的d n a 结合蛋白或是h i n 重组酶的n 一端，得到的试剂对d n a 的切割也具有序列特异性。i v e r s o n ! ”l 等报邋川单克隆抗体与c o ( 1 1 1 ) ，z n ( i i ) 等结合能断裂与其特异结合的多肽，如能制备山可与 某段d n a 特异结合的单克隆抗体。将其与化学断裂系统结合，即可获得多种d n a 定位断 裂二i ：具。但是蛋白质对d n a 的识别较为复杂，目前已认识到不存在能用于描述所有蛋白 质对d n a 的识别规律。但是上述的实例也表明一种单一的蛋白质结构家族成员对d n a 的识别规律是存在的。 2 3 抗生素 抗生索类药物”1 也能识别d n a 。乙撑距胺型d n a 靶向分子是一类皿要的烷化剂。丝 裂霉素c ( m i t o m y c i nc ，m c ) 作为一种临床上常用的重要抗肿瘤剂，是这类化合物的代表 物，研究表明。m c 所具有的抗肿瘤能力及强细胞毒性均与它和d n a 双链共价交联的能力