抗体微球偶联物的制备方法研究.doc

抗体-微球偶联物的制备方法研究?558?黑龙江医药heilongiangmedicinejournalvol24no.42011穿膜肽一抗体一微球偶联物的制备方法研究王启辉,刘金华,周洁,冷静1.广西医科大学免疫学教研室;2.广西医科大学第一附属医院泌尿外科(南宁530021);3.广西中医学院(南宁530001)摘要目的:探讨制备穿膜肽一抗体一微球新型药物传送系统的可行性.方法:采用n一琥珀酰亚胺基一3一(2一吡啶二硫)一丙酸酯(spdp)交联法将穿膜肽一增强型绿色荧光蛋白融合蛋白(cppsegfp),牛血清白蛋白微球(bsans),乙肝高效价免疫球蛋白(hbig)分别采用一次偶联法和二次偶联法两种交联方案进行共价交联,采用还原和非还原sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)和免疫荧光法评价穿膜肽,抗体,微球问的交联.结果:两种交联方案刺备的穿膜肽一抗体一微球偶联物,sdspage还原电泳均可见在低分子量端形成三条蛋白条带,非还原电泳均未见条带;在不同激发波长的荧光显微镜下,均可见微球表面分别发出绿色荧光和红色荧光.结论:应用sp-dp交联剂,无论是一次偶联法还是二次偶联法均能够将穿膜肽,抗体,微球有效地进行偶联,为进一步研究穿膜肽一抗体一微球新型药物传送系统的特性奠定了基础.关键词:抗体;穿膜肽;牛血清白蛋白;微球;蛋白偶联;spdp中图分类号:r392文献标识码:a文章编号:lo062882【2011)0455804studiesoilpreparationmethodofccpsantibody?-nanospheresconjugateswangqihui,etaldepartmentofimmunology,guangximedicaluniversity(nanning530021,china)abstract:objective:toexplorethefeasibilityofapplyingnsuccinimidyl一3一(2一pyridyldithio)propionate(spdp)conjugationtechnologytothepreparationofanewdrugdeliverysystem:ccpsantibodynanospheresconjugates.meth-otis:ccpsantibodynanosphoresconjugateswerepreparedbytwodifferentmethodsofspdpcrosslinking.ccpsan-tibodynanospheresconjugatesweretestedbysdspageassayandimmunofluorescentassay.results:ccpsantibodynanospheresconjugatespreparedbytwodifferentmethods.whichwerereducedwithdttallshowedthreeproteinbandsatlowmolecularweishtend.therewasbrightestreactioninimmunofluorescent,conclusion:thesedataimplicatedthatcon.junctionofcellpenetratingpeptides,antibodiesandnanospheresbytwodifferentmethodsofspdpconjugationtechnologywassuccessfulandthiswouldprovideabasisforfurtherstudiesonthenewdrugdeliverysystem:ccps?antibodynanospheresconjugates.keywords:antibody;cpps;bsa;nanospheres;conjugation;spdp穿膜肽(cellpenetratingpeptides,cpps)是一种能够促进多种物质通过细胞膜的小分子多肽,具有携带小分子蛋白,药物分子,核酸,抗体,脂质体和微粒等多种物质进入细胞的功能.蛋白微球是目前较成熟的一类微球,具有载药量大,缓慢释放药物等特性.单克隆抗体能够实现药物的特异性靶向杀伤作用j.因此我们设想建立穿膜肽一抗体一白蛋白微球药物传送系统,以实现药物缓释,靶向,促进药物内化进入肿瘤细胞,从而达到提高药物对肿瘤细胞的杀伤效率,降低不良反应的目的.本研究初步探讨了采用蛋白偶联技术制备穿膜肽一抗体一微球偶联物这一新型药物传送系统的可行性,为其进一步抗肿瘤效应研究提供实验基础.1材料与方法1.1试剂与仪器穿膜肽一增强型绿色荧光蛋白融合蛋白(cppsegfp),本课题组构建制备;牛血清白蛋白微球(bsans),本课题组以牛血清白蛋白(bsa)为材料,采用基金项目:国家自然科学基金(30700836)作者简介:王启辉(1975),男,硕士,讲师,工作单位广西医科大学,主要从事免疫应用研究.email:通讯作者:周洁,副教授,email:zhoujieuser163.eom黑龙江医药heilongjiangmedicinejournalvo1.24no.42011?559?交联固化法制备;乙肝高效价免疫球蛋白(hbig,成都蓉生药业有限责任公司);异型双功能交联剂n一琥珀酰亚胺基一3一(2一吡啶基二硫)丙酸脂(spdp,sigma公司);二硫苏糖醇(dtr,德国merck公司);罗丹明标记羊抗人igg(北京博奥森生物技术有限公司);amiconultra一15超滤离心管(10kdamwco,miuipore公司);高速台式低温冷冻离心机(美国sigma公司);核酸蛋白分析仪(美国biorad公司);小型垂直电泳槽(美国biorad公司).1.2方法1.2.1穿膜肽一抗体一微球偶联物的制备:应用异型双功能交联剂spdp进行蛋白间的连接,分别采用了以下两种连接方案进行穿膜肽一抗体一微球偶联物的制备.一次偶联法:cppsegfp,bsans与hbig的偶联取hbig2mg,cppsegfp1.5mg,bsans蛋白微球5mg,分别溶于2mlpbs(ph7.5,0.01tool/l)中,以l:20的比例缓慢加入20mmol/lspdp溶液(无水乙醇溶解,现用现配),室温搅拌反应30分钟,将hbig,cppsegfp反应混合物分别加入amieonultra一15超滤离心管,分别以醋酸盐缓冲液(ph4.5,0.01mol/l),pbs(ph7.5,0.01mol/l)为洗涤液离心洗涤3次(4,3500g/rain,15min/次),bsans反应混合物,以ph7.5pbs离心洗涤4次(10000rpm/min,lmird次),以去除剩余spdp,分别得到hbigpdp,cppsegfppdp,bsanspdp的spdp衍生物,4c保存备用;在得到的hbigpdp醋酸盐溶液中加人适量dtr(使反应体系中dtr终浓度为50mmol/l),室温轻搅3o分钟,加入amiconultra一15超滤离心管,以pbs(ph7.5,0.01mol/l)为洗涤液离心洗涤3次(4qc,3500g/min,15min/次),去除剩余dtt,得到hbigpdpsh溶液,立即与cppseg-fppdp,bsanspdp(用pbs悬浮)溶液混合,4c搅拌2024h,用pbs离心洗涤4次,沉淀,最终得到cppseg.fpbsanshbig蛋白偶联物.二次偶联法:先制备cppsegfpbsans偶联物,然后再与hbig偶联同上法分别制备cppsegfppdp,bsanspdpi将bsanspdp超声分散在2ml醋酸盐缓冲液(ph4.5,0.01mol/l)中,加入适量nyr(使反应体系中d1rr终浓度为50mmol/l),室温轻搅30分钟,以ph7.5pbs离心洗涤4次(10000rpm/min,1min/次),以去除剩余ddt,得到bsanspdpsh,立即与cppsegfppdp混合,4c搅拌2024h,用pbs离心洗涤4次,取沉淀,得到cppsegfpbsans偶联物;将cppsegfpbsans分散于2mlpbs中,以1:20的比例缓慢加入20mmol/lspdp乙醇溶液,室温搅拌反应3o分钟,pbs离心洗涤4次,去除剩余spdp,得到cppsegfpbsanspdp,同上法制备hbigpdpsh后,立即与cppseg.fpbsanspdp混合,4c搅拌2o一24h,用pbs离心洗涤4次,取沉淀,得到cppsegfpbsanshbig蛋白偶联物.1.2.2穿膜肽一抗体一微球偶联物的初步鉴定sdspage电泳鉴定和分析偶联物:分别取穿膜肽一抗体一微球偶联物溶液(5#l),抗体(1g/l),微球(5g/l)及cppsegfp(1g/l)各201.tl,与含足量dtr的加样缓冲液反应后上样;以穿膜肽一抗体一微球偶联产物,抗体与不含d1r的加样缓冲液反应作对照,进行非还原型和还原型sdspage电泳,以鉴定穿膜肽一抗体一微球偶联物的连接状况.间接免疫荧光法检测偶联物:取穿膜肽一抗体一微球偶联物,牛白蛋白微球,分别与等量罗丹明标记羊抗人igg混合,4c冰箱中反应30min,pbs离心洗涤3次后,置荧光显微镜下观察.2结果2.1穿膜肽一抗体一微球偶联物的sdspage电泳结果两种连接方案的电泳结果基本相同.加dti还原的两种连接方案的穿膜肽一抗体一微球偶联物均在分子量较小一端有三条电泳条带,分别与抗体及cppsegfp加dtr还原组的三条条带位置相同,根据蛋白质标准品分子量大小推测其中较大及较小分子量条带应为抗体被dtr分解为轻链和重链所对应的条带,而中间的条带应为cppsegfp对应的条带;由于微球为颗粒状,体积较大,不能进入聚丙烯酰胺凝胶,故未见微球条带;未还原的穿膜肽一抗体一微球偶联物未见电泳条带;未还原的抗体在分子量较大端形成一条较粗的电泳条带,符合抗体分子量大小所在位置;另外,微球,抗体,穿膜肽三者混合物加dtr的条带与穿膜肽一抗体一微球偶联物加dtr的条带位置相同,但未加dtr的三者混合物则出现两条条带,分别对应于未还原抗体和cppsegfp的条带,与未还原的偶联产物结果不同.以上结果提示三种蛋白偶联是成功的,且微球,抗体,穿膜肽三者之间的连接不是通过吸附或离子键连接,见图1.bljlti,图1穿膜肽一抗体一蛋白微球偶联产物的sdspage电泳图m.蛋白质标准品;1.cppsegfp+dit;2.hbig+dtr;3.微球+dti;4.偶联产物(一次偶联法)+dit;5.偶联产物?560?黑龙江医药heilongjiangmedicinejournalvol24no.42011(一次偶联法)一dq3;6.偶联产物(两次偶联法)+dtr;7.hbigdit;8.偶联产物(两次偶联法)一dit;9.穿膜肽,抗体,微球混合物+dqt;10.穿膜肽,抗体,微球混合物一dtr2.2间接免疫荧光检测结果在不同激发波长的荧光显微镜下,两种连接方案的微球表面分别可见绿色荧光和红色荧光,绿色荧光为融合蛋白cppsegfp上的报告蛋白egfp被激发所致,说明偶联物上偶联有cppsegfp,而红色荧光为羊抗人iggfitc被激发所致,说明偶联物上偶联有人igg,而白蛋白微球未见荧光,见图2.间接免疫荧光检测结果表明微球上既有hbig,也有cppsegfp,说明偶联是成功的.nitlabc图2穿膜肽一抗体一蛋白微球偶联产物的免疫荧光检测结果(400)1.一次偶联法;1i.二次偶联法;iii.微球对照a.光学显微镜;b.荧光显微镜(激发波长:45049onto);c.荧光显微镜(激发波长:510560nm)3讨论蛋白质交联指将小分子物质(如药物,半抗原等)或大分子物质(如酶,蛋白毒素,微球等)以共价键的方式连接于蛋白质分子,在制备人工抗原,免疫标记物,载体释放药物,抗体导向药物和免疫毒素等生物医学领域有着广泛的应用.随着相关研究领域的不断发展,蛋白质交联方法也不断改进和完善,常用的交联方法及交联剂有20余种,蛋白质问的交联可以用戊二醛法,碳化二亚胺法,甲苯一二异硫氰酸盐法等,但这些方法在生成偶联物的同时,不可避免地产生自身交联产物或多聚物,致使偶联物产量低,活性减弱.为克服这一不足,人们发展了一系列异型双功能交联试剂用于蛋白质问的交联,以实现控制交联,提高交联反应的选择性和交联产物的均一性,如spdp,smpt,smcc,mbs等?.其中spdp交联反应条件温和,副反应少,不易发生蛋白质自身的交联,且能够定量的于蛋白质分子中引入保护的巯基,并能够方便地测定其含量,是一种经典的,较理想的用于蛋白质问偶联的交联剂,已成功应用于多种肿瘤特异性的免疫毒素,免疫微球等抗体导向药物系统的制备.其交联原理是spdp与蛋白质中的伯氨基反应,分别引人吡啶二硫基,将其中一种含吡啶二硫基的蛋白质用dtr还原成巯基,然后在含吡啶二硫基的蛋白质与含巯基的蛋白质之间,通过巯基与二硫键的交换,进行蛋白质问偶联.以往spdp多用于两种蛋白质之间的偶联,用于三种蛋白质之间的偶联极少,因此我们选用spdp作为交联剂,初步探讨了穿膜肽一抗体一微球三种蛋白质偶联物的制备方法.制备的穿膜肽一抗体一微球药物传送系统将可能实现缓释给药,定向给药,促进药物内化进入靶细胞,提高生物利用度和治疗指数的作用.本研究通过sdspage蛋白电泳,间接免疫荧光法对穿膜肽一抗体一微球偶联物进行了初步鉴定.sdspage电泳结果表明,加dty还原的两种连接方案的偶联产物,均在分子量较小一端有三条电泳条带,分别对应于抗体及cppsegfp加dti还原组的三条条带,而未还原的穿膜肽一抗体一微球偶联物未见电泳条带,说明微球,抗体,穿膜肽三者已偶联在一起.免疫荧光染色结果表明,两种连接方案的微球表面分别可见绿色荧光和红色荧光,结果表明微球上既有hbig,也有cppsegfp,说明偶联是成功的.以上结果表明,无论是一次偶联还是两次偶联,均能成功进行穿膜肽一抗体一微球三种蛋白质间的偶联.一次偶联法为通过spdp修饰,分别对cppsegfp,bsans引入吡啶二硫基,而对hbig引入巯基,然后将cppsegfp,bsans偶联到hbig上.两次偶联法为先用spdp对cppsegfp和bsans进行偶联,形成cppsegfpbsans两种蛋白质偶联物,再用spdp对cppsegfpbsans引入吡啶二硫基,然后再与hbigpdpsh偶联.两种连接方案相比较,一次偶联法操作较简便省时,只需一次偶联反应即可获得偶联产物,但由于把cppsegfp,bsans偶联到hbig上,由于微球的体积较大,有可能对抗体产生空间位阻作用而影响抗体的活性,且可能形成一定量的cppsegfphbig,bsanshbig副产物,产物均一性较差;两次偶联法进行了二次偶联反应,形成的副产物少,产物均一性好,但操作较繁琐费时,且由于spdp交联效率约为3040%,进行两次偶联,原材料消耗较大,而cppsegfp,bsans进行了两次修饰,也可能对cpps的活性和微球的释药性产生影响.除此两种连接方案外,也可采取将抗体,穿膜肽偶联到微球上或将穿膜肽与抗体偶联,然后再与微球偶联,而简化操作步骤,但都存在上述一些问题.究竟采用何种连接方案,应根据对偶联产物中的抗体,穿膜肽活性的影响,以及对微球释药性的影响来综合取舍,选择一种合适的交联方案.由于单克隆抗体较难获得,且抗体间具有相似的化学黑龙江医药heilongjiangmedicinejournalvol24no.42011?561?外源蛋白在cho细胞株中高效表达的策略魏韬,王菡,代海兵(1.牡丹江医学院基础医学院机能学教研室(黑龙江牡丹江157011);2.牡丹江医学院临床医学院检验实验室(黑龙江牡丹江157011)摘要目的:随着基因工程技术的不断发展,目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质.真核细胞中cho细胞与其他表达系统相比具有许多优点,是目前重组糖基蛋白生产的首选体系.本文着重阐述外源蛋白在cho细胞中高效表达的策略.关键词:外源蛋白;cho细胞;高效表达;策略中图分类号:q786文献标识码:a文章编号:10062882(2011)0456103在哺乳动物细胞中高效表达外源蛋白依赖于许多因素,如转录和翻译控制因子,rna加工,基因拷贝的数目,mrna的稳定性,外源基因在染色体上的整合位点,重组蛋白对宿主细胞的潜在毒性和宿主细胞的基因组偏好性等.为重组蛋白选择一个合适的表达系统,由许多因素决定,这些因素包括:细胞生长的特点,表达的水平,胞内或胞外表结构,因此本研究采用较易获得的乙肝高效价免疫球蛋白作为模型抗体,微球也采用较经济的未包裹药物的空载微球作为模型微球,并且为便于观察结果,在穿膜肽上融合了报告蛋白egfp,但仍具有穿膜活性.尽管本研究采用spdp交联法成功实现了穿膜肽一抗体一牛白蛋白微球的偶联,但尚未对其穿膜活性,抗体的靶向性及该药物传递系统的杀伤活性进行检验,这有待进一步研究解决.参考文献1fonsecasb,pereiramp,kelleyso.recentadvancesintheuseofcell-penetratingpeptidesformedicalandbiologicalapplica?tionsj.advdrugdelivrev,2009,61(11):953964.2noguchih,matsumotos.proteintransductiontechnology:8noveltherapeuticperspectivej.actamedokayama,2006,60(1):111.3jonesc,burtonma,graybn.albuminmicrospheresasvchi-clesforthesustainedandcontrolledreleaseofdoxorubicinj.jpharmpharmacol,1989,41(12):813816.4zhouj,zengf,gaox,eta1.preparationofarsenictrioxidealbuminmicrospheresandthereleasecharacteristicsinvitroj.jhuarlaongunivscitechnologmedsci.2005,25(3):310312.5embletonmj.drugtargetingbymonoclonalantibodiesj.brjcancer,19g7,55(3):227231.6khandarejj,minkot.antibodiesandpeptidesincrncertherapyj.critrevtherdrugcarriersyst,2006,23(5):401435.7周洁,郭晓云,冷静,等.穿膜肽一egfp融合蛋白的表达,纯化与鉴定j.基础医学与临床,2010,30(9):902906.8zhouj,zengf,ganx,eta1.preparationofarsenictrioxidealbu.minmierospheresanditsreleasecharacteristicsinvitro.aetaunivmedtong/i,2005;25(3):310312.9洪孝庄,孙曼霁.蛋白质连接技术m.北京:中国医药科技出版社,1993:151.【10hermansongt.bioconjugatetechniquesm.2nded.sandie