（动物遗传育种与繁殖专业论文）蚯蚓粪便微生物多样性的研究及除臭微生物的分离筛选.pdf

摘要 随着我国规模化、集约化畜牧业的发展，畜禽生产中产生的恶臭对环境的污 染不断加剧，不但严重影响着家畜( 禽) 的健康和生产性能的发挥，而且对人类的 健康造成极大的威胁。蚯蚓粪是具有很高孔隙率和比表面积的颗粒状物质，是臭 气高效吸附剂，并且粪便中含有大量微生物，可促进有机质的分解而达到除臭的 目的。8 0 年代，日本、德国等国家已经将蚯蚓粪用于生活垃圾的生物处理中， 取得了预期的效果，而在国内这方面的研究还比较少。本文围绕蚯蚓粪的生物除 臭进行了以下的研究： 1 以牛粪为基料，在常温下饲养蚯蚓，饲养到第l o d 、2 0 d 、3 0 d 时，从混合 物的上层、中层、下层分别采集的蚯蚓粪便。采用丙酮去除粪便中的有机质，运 用s d s 、苯酚、蛋白酶k 结合裂解细胞的方法，成功地从蚯蚓粪中提取出了总的 d n a 。通过电泳和分光光度计对d n a 的完整性与纯度进行了检测，结果发现提取 的d n a 完整性良好，大小为2 3 k b 左右，d n a 的吸光值d 2 6 0 d 2 8 0 = 1 6 1 8 ，完 全满足了对蚯蚓粪微生物菌落结构的p c r - s s c p 分析。 2 运用p c r s s c p 方法对不同阶段的蚯蚓粪微生物菌落结构进行了分析，结 果发现，细菌的多样性变化呈现缓慢上升趋势，真菌的多样性呈下降趋势，而且 最底层的细菌微生物多样性要比其它层面上的微生物指数高，并且多样性指数都 在0 8 以上。 3 通过对蚯蚓粪便微生物的富集、驯化，初步分离到2 0 株除臭微生物菌株， 其中除硫的细菌7 株，真菌4 株，除氨的细菌6 株，真菌3 株。通过试验复筛选 出1 1 株有较强的除臭能力的微生物。从分离出的微生物可以看出，细菌占筛选 出菌株的5 5 。 4 为筛选用于除臭实验的堆肥配方，采用了互不拮抗b 6 与b 1 - 6 为供试菌 株，进行了蚯蚓粪除臭配方的正交试验设计，获得了适合的蚯蚓粪生物除臭配方 的组合为：猪粪8 0 ，稻草2 0 ，菌料比1 ：1 0 0 0 ( m e ：g ) 。 5 按正交试验确定的蚯蚓粪除臭配方，将复筛实验中筛选出来的除臭菌株， 且互不拮抗的除h 2 s 和除n h 3 的菌株分别进行三个菌株组合，进行猪粪的除臭试 验，结果发现：在培养1 8 d 时，除h 2 s 平均释放量为2 1 3 1 3 m g k g ，与c k 相比释 放量降低了4 6 2 6 。除n i - 1 3 的平均释放量为1 4 6 7 4 m g k g ，与c k 相比释放量降 低了4 6 3 1 。 将三个菌株组合的除臭效果与单个菌株的除臭效果相比较，在相同的培养时 间下，三个菌株组合的效果都要优于复筛试验中的单个菌株的效果。 6 对纯培养微生物进行了分子生物学技术鉴定，结果表明：b 1 、b 5 、b i - 2 、 b i - 4 为芽孢杆菌属，b 3 、b 2 为产碱杆菌属，f 3 为青霉属，b i - 6 未定义，分离 得到的菌株中芽孢杆菌占优势，占总数的5 7 2 ，同时含有产碱菌属。 关键词：蚯蚓粪；聚合酶链反应一单链构象多态性( p c r s s c p ) ；微生物多样性； 生物除臭；分离：筛选 r e s e a r c ho fm i c r o b i a ld i v e r s i t ya n di s o l a t i o no f d e o d o rm i c r o o r g a n i s mo fe a r t h w o r mc a s t s h a n g l iq i n d i r e c t e db y ：b a il i n a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fi n t e n s i v ea n i m a lh u s b a n d r y , o d o re m i t t e df r o m a n i m a lh u s b a n d r yn o to n l ya f f e c t e dt h eh e a l t ha n dp r o d u c t i o np e r f o r m a n c eo f l i v e s t o c k ，b u ta l s ot h r e a t e dt h eh e a l t ho fp e o p l e e a r t h w o r mc a s t ，w h i c hh a sh i 曲f a c t o r o fp o r o s i t ya n d s p e c i f i cs u r f a c ea r e a i s ，i sd e e m e d t ob eae f f e c t i v ea d s o r b i n ga g e n t o fo d o r e a r t h w o r mc a s tc a nd e o r d o rb yd e c o m p o s e dt h eo r g a n i cm a t t e r i n19 8 0 s ， e a r t h w o r mc a s tw a su s e dt od e a l tw i t ht h ed o m e s t i cw a s t ei ng e r m a n ya n dj a p a n u 1 1 t i un o w ，r e s e a r c hi nt h i sa r e ai ss t i l lr e l a t i v e l ys m a l li nd o m e s t i c i nt h i sp a p e r r e s e a r c ho nb i o l o g i c a ld e o d o r a n to fe a r t h w o r mc a s tw a sc a r r i e do u ta sf o l l o w s ： 1 晰t 1 1c o wd u n ga ss t o c kb l e n d , t h em i x t u r eo fu p p e r , m i d d l ea n dl o w e rc l a s s e s o fe a r t h w o r mc a s tw e r ec o l l e c t e dr e s p e c t i v e l yi nk e e p i n gt ot h ef i r s t10d ，2 0 d ，3 0 d a m o n gd n a e x r t a c t e dm h e t o d s ，t o t a ld n aw a ss u c c e s s f u l l ye x t r a c t e df r o mt h ef e c e s o ft h ee a r t h w o r mb yu s i n ga c e t o n et or e m o v ef e c e so r g a n i cm a t t e ra n dp r o e t i n a s e k ，s d s ，p h e n o lt ol y s e st h ec e i l s i n t e g r i t ya n dp u r i t yo fd n a w a sc o n f i r m e db y s p e c t r o p h o t o m e t e ra n de l e c t r o p h o r e s i s t h ed n a ，w h i c hi nl e n g t hw a s2 3 k ba n dt h e a b s o r p t i o n o fw h i c hi sb e t w e e n1 6a n d1 8 ，w a ss u i t a b l et ob ea n a l y s e db y p c r s s c p - 2 w i t hp c r - s s c pm e t h o d s ，m i c r o b i a ld i v e r s i t yo ft h ee a r t h w o r mc a s to f d i f f e r e n ts t a g e sw e r ea n a l y z e d i r i sf o u n dt h a tt h ed i v e r s i t yo fb a c t e r i al i n eu pb e f o r e 2 0d ，b u t ，谢t ht h el a p s eo ft i m ea n dt h eb a s em a t e r i a lw a ss l o w l yc o n s u m e d ，t h e d i v e r s i t yo fb a c t e r i ap r e s e n t e di nt h es l o wu p w a r dt r e n da n dt h ed i v e r s i t yo ff u n g i p r e s e n t e di nad e c l i n i n gt r e n d t h ed i v e r s i t yo ft h eb o t t o mb a c t e r i a lm i c r o b i a lw a s h i g h e rt h a nt h a to fa n yo t h e rm i c r o b i a la tt h el e v e lo fi n d e x ，a n de x c e e d e d0 8 3 t h r o u g ht h ee n r i c h m e n ta n dd o m e s t i c a t e do fm i c r o b i a l ，2 0d e o d o r a n t m i c r o b e sw a si s o l a t e d ，i n c l u d i n gs e v e nb a c t e r i a s w h i c hc o u l dd e c o m p o s eh 2 s ，f o u r f u n g iw h i c hc o u l dd e c o m p o s eh 2 s ，s i xb a c t e r i a sw h i c hc o u l dd e c o m p o s en h 3 ，t h r e e f u n g iw h i c hc o u l dd e c o m p o s en h 3 w i t hf u r t h e rs c r e e n i n ge x p e r i m e n t ，1 1s t a i n s d e o d o r a n tm i c r o b e sw a si s o l a t e d i h eb a c t e r i aa c c o u n t e df o r5 5p e r c e n to ft o t a l i s o l a t e dm i c r o b e sf r o mt h er e s u l t 4 w i 也an o n a n t a g o n i s t i cb 6a n db1 6a st e s t e ds t r a i n ，o r t h o g o n a lv a r i a n c e a n a l y s i sw a sc a r d e do u tt os c r e e nt h ec o m p o s tf o r m u l ao fd e o d o r a n ta s s a y 乃e p r o p o r t i o no fm a t e r i a lo fc o m p o s t ：8 0p e r c e n to fp i gm a n u r e ，s t r a w2 0p e r c e n t , t h e r a t i oo fm i c r o b e sa n dm a t e r i a l1 ：1 10 0 0 5 a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t , n o n a n t a g o n i s t i ct h r e e s t r a i n sm i c o r b e so fd e c o m p o s i n gh 2 sa n dn h 3w e r em i x e dt od e o r d o ro fc o m p o s t e x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a t ：18 di nc u l t u r e ，h 2 se m i s s i o n st h e a v e r a g e e m i s s i o n si s213 13m g k g ，t h ea v e r a g ee m i s s i o n sd e c r e a s e d4 6 2 6 ，c o m p a r e d w i t ht h ec k , r e s p e e t i v e l y n h 3e m i s s i o n st h ea v e r a g ee m i s s i o n sw a s14 6 7 4 m g k g t h e a v e r a g ee m i s s i o n sd e c r e a s e d4 6 31 ，c o m p a r e d 硒mt h ec k , r e s p e c t i v e l y c o m p a r e dt h ed e o d o r a n te f f e c tb e t w e e nt h r e es t r a i n sa n ds i n g l es t r a i ni ns a r n e t i m e ，h 2 se m i s s i o n sa n dt h eg r a d eo fo d o ro ft h r e es t r a i n sw a ss u p e r i o rt ot h a to fa l la s i n g l es t r a i n 6 1 1 1 em i c r o b e sw a sc o n f m n e dw i t l lm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n o l o g y n l er e s u l t s h o w e dt h a tb 1 、b 5 、b 1 2 、b 1 - 4b e l o n g e dt ob a c i l l u sa n db 3 、b 2b e l o n g e dt o a l c a l i g e n a c e a ea n df 3b e l o n g e dt op e n i c i l l i u ma n db 1 - 6d i dn o tb e l o n gt oa n y k n o w e dg e n u s b a c i l l u sa c c o u n t e df o r5 7 2 o fc o n f i r m e dm i c r o b e sa n db e l o n g e dt o p r e d o m i n a n tm i c r o b e st od e o d o r k e yw o r d ：w o r m c a s ；p c r s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，( s s c p ) ； m i e m o r g a n i s md i v e r s i t y ；b i o l o g i c a ld e o d o r i z a t i o n ；i s o l a t i o n ；s c r e e n i n g 蹦川i 联业人子驯工手世比义 附件一 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得匹t ) l l 农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：简两每移 洄8 年厂月“e l 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：髑矶牺 导师签名：0 缈 h 2 每6 疑1 b 沁弘6 具毛b 蚯蚓粪便微生物多样性的研究及 除臭微生物的分离筛选 1 文献综述 1 1 微生物多样性的研究进展 1 1 1 微生物多样性的概念 微生物的多样性是指在一个集合群落中，众多不同类型微生物的变化及它们 之间相对的丰度【l 】。对微生物多样性的研究不仅将极大地推动生命科学的发展， 也将有利于发现新的有用微生物资源，进一步造福人类。与宏观生物不同的是， 由于微生物本身所具有的个体微小、形态结构简单等特点，致使微生物的多样性 在形态和分化上表现并不突出，而主要表现在物种和基因水平上，因此要对自然 环境中的微生物多样性有一个客观的认识是一个非常艰巨的任务。对微生物资源 的认识、保护是整个生物圈保护中必不可少的内容，所以人们一直在努力探索研 究、开发微生物资源，以便更加客观、真实地认识它们，从而更好应用微生物为 人类造福。近年来，对微生物多样性的研究日益受到人们的重视。 1 1 2 传统微生物多样性的研究方法 传统的生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离 培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体 培养基上分离微生物【2 - 3 1 。随着人们对微生物的原位生存状态研究，越来越发现 常规的分离培养方法很难全面地评估微生物群落多样性。简单提取和平板培养计 数不能得到微生物在生态系统中的生活特征和生态功能的信息。 另外，据国外研究者报道，环境中存在的大量微生物中，仅1 甚至不到l 的微生物可通过培养方法在培养皿上进行培养和进一步分离，而绝大多数细菌要 求非常严格的营养条件或是难以培养【4 羽，因此，用新的研究方法和实验技术对 微生物进行全面和系统的研究显得尤为重要。 1 1 3 分子生物学技术在环境微生物研究中的进展 利用1 6 sr r n a r d n a 序列分析技术，研究者可以在不对微生物进行纯化培养 的情况下对其进行全面的研究，利用1 6 s r d n a 的原位核酸杂交和p c r 技术甚至可 以在原位对特定的污染环境或污染处理系统中的微生物进行检测和分类鉴定【3 】， 并进步对微生物群落的结构和功能进行研究从而为污染环境的微生物修复和 环境污染物微生物处理系统的研究提供重要的微生物学研究依据。 由于分子生物学技术可以通过直接从环境样品中提取微生物d n a 或直接在 原位对微生物进行研究，而不需要对微生物进行分离培养，因而能够动态研究微 生物群落的多样性，能够真实地反映微生物的存在状态，因此，近年来越来越多 的研究者开始应用分子生物学技术对环境微生物进行了的研究，尤其是对废水处 理系统、堆肥和肠道中的微生物多样性和功能微生物种进行研究，并且也取得了 一些成果，为相关领域的环境微生物研究乃至工艺研究都打下了一定的基础。 1 1 4p c r s s c p 技术在微生物多样性研究中的运用 1 1 4 1p c r s s c p 原理 对s s c p 的运用可追塑到1 9 8 9 年，日本的o r i t a 7 等研究发现，单链d n a 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相 互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少的影响其空间构象， 使构象发生改变，空间构象有差异的单链d n a 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻 大小不同，因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) ，可以非常敏锐地将 构象上有差异的分子分离开，因此该方法称为单链构象多态性( s i n g l e - s t r a n d c o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 。将待测d n a 片段进行p c r 扩增后再进 行s s c p 分析，就是所谓的p c r s s c p 分析法【8 】p c r 与s s c p 方法的结合也提 高了突变检测的简便性和灵敏性。h a y a s h 9 】等对该技术进行了详细的描述，此后 该技术被应用于微生物鉴定、微生物区系、微生物多样性等研究领域【1 1 1 。 在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，d n a 单链的迁移率除与 d n a 链的长短有关外，更主要的是取决于d n a 单链所形成的构象。在非变性条 件下，d n a 单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这种构象由d n a 单 链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用( 主要为氢键) 来维持。相 同长度的d n a 单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳 迁移率也不同。由此可见，p c r - s s c p 分析技术是一种d n a 单链凝胶电泳技术， 它根据形成不同构象的等长d n a 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变 化来检测基因变异。由于不同长度的1 6 sr r n a 或1 8 sr r n a 基因片段必然代表 2 不同的微生物，一种1 6 sr r n a 或1 8 sr r n a 基因片段就至少代表一种微生物的 存在，所以这些凝胶上的d n a 片段可以用来反映微生物菌落组成情况。 p c r s s c p 技术的基本过程为：( j ：) p c r 扩增靶细胞；将特异的p c r 扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链d n a 分子；将 适量的单链d n a 分子进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后通过银染显色分 析结果。 1 1 4 2 单链s s c p 技术与异源双链s s c p 技术 用于微生物群落多样性分析的p c r s s c p 技术一般指单链s s c p 技术，其在 监测步骤中涉及到反意义链的去除，即在反向引物( 反意义链) 的5 端进行标 记，然后用某种方法去除p c r 产物中的反意义链，使产生的图谱为单链s s c p 图谱，从而减小微生物群落动态分析的复杂性。反意义链的去除有两种方法，一 是用入核酸外切酶( 1 a m b d ae x o n u c l e a s e ) 将5 端磷酸标记的反意义链水解掉 u 2 ；另一种方法是通过链酶亲和素( s t r e p t a v i d i n ) 将生物素标记的反意义链 钓取出去1 3 】。传统s s c p 技术多用于单个碱基变异的多态性分析，通常不涉及到 反意义链的去除，所以生成的图谱为异源双链s s c p 图谱【1 4 】。 把p c r s s c p 技术运用于微生物群落动态分析的基本程序为：模板d n a 的 制备；利用细菌通用引物扩增细菌1 6 sr r n a 基因( 或利用真菌通用引物p c r 扩增真菌1 8 sr r n a 基因) ；括增产物的入核酸外切酶酶切；扩增产物的变性以 保持其单链状态；进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 1 1 4 3p c r - - s s c p 技术的优缺点【1 2 1 4 】 作为一种新的d n a 序列变异手段，p c r - - s s c p 法与传统的检测基因突变的方法 相比确有独到之处： ( 1 ) 可以检测任何( 包括己知的和未知的) d n a 位点上的多态性和突变，且检测 灵敏性高，能够检测出i b p 的小缺失和点突变，这大大提高了基因突变的检测范 围； ( 2 ) 无需事先知道待测d n a 片段的序列，只要能够根据已有的资料设计p c r 引 物即可进行p c r - - s s c p 分析； ( 3 ) 省去了核酸杂交等复杂的实验步骤，操作简单，不需特殊仪器，整个过程 可在一到两天内完成； 3 ( 4 ) 可在测序前对d n a 样本进行筛选：适合于同时对大量样品进行筛选，特别 适用于混合细胞群体中d n a 变异的检测； ( 5 ) p c r - - s s c p 分析对d n a 原始材料纯度要求不高，且所需量较少，为该技术在 研究和实际操作中的应用提供了极大方便。 同时，也因为p c r - - s s c p 技术是新近发展起来的一种分子生物学分析方法，所 以不可避免会存在一些缺陷： ( 1 ) 不能对d n a 序列变异进行精确的定位，而只能对其进行初筛，需要结合序 列分析才能确定变异的位置及内容。对大于3 0 0 b p 的d n h 片段，随着d n a 片段长度的 增加，检测的敏感性逐渐降低； ( 2 ) 虽然从理论上讲p c r - - s s c p 法可以检测任何位点上的碱基变异，但实际应 用中可能会遇到相当比例的假阴性结果：在通常的条件下有些突变可能未被检出， 因而该技术不能证明没有突变； ( 3 ) p c r s s c p 分析结果受多种因素如电泳温度、电泳缓冲液浓度、凝胶浓 度、甘油的浓度和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的浓度等的影响。不同的实验条件甚 至可能导致完全不同的结果； ( 4 ) 在室温、通风冷却条件下电泳，少量片段的条带难以分离。 1 1 4 , 4p c r - s s c p 技术和其他分子生物学方法的比较 很多分子生物学方法都可以监测微生物群落动态 1 5 , 1 6 , 1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 ，如d g g e 、 t g g e 、l 讧l p 、a r d r a 等。各种分子生物学方法的区别在于p c r 产物的分离【2 i 】。 由于每种方法都有各自的优缺点，应因地制宜选择合适的方法。d g g e 和t g g e 技术需要与之配套的电泳设备( 电泳温度维持在6 0 。c ) ，价格昂贵瞄】，此外，其 所需要的长链引物对( 大约6 0 碱基对) 使得在第一个p c r 循环的退火环节中产 生非目的片段【1 7 1 。由r f l p 分析微生物多样性的问题是，图谱的谱带比扩增d n a 的谱带要多，因此会过高估计群落成员数目，末端荧光标记的t - r f l p 技术虽然 解决了这个问题，不幸的是，利用自动测序仪来完成t - r f l p 费用很昂贵。a r d r a 方法最大的缺点是工作量大，目前，应用该方法进行微生物群落结构分析，还没 有人设置重复。s s c p 技术的优点是操作比较简便，价格低廉，虽然它存在灵敏 性随p c r 产物d n a 长度的增加而下降的缺陷，但只要选择合适的引物，扩增合 适长度的d n a 片段，即可弥补此方面的不足【2 3 , 2 4 2 5 婀。 4 这种方法本来是用于临床鉴定基因突变的，近年来已经被应用于多种环境的 微生物群落动态分析中，主要可分为人工创制的微生物群落和自然群落两大类。 1 9 8 9 年o r i t a 等首先采用s s c p 技术，逐渐广泛应用于各个研究领域【7 】。l e e 等( 1 9 9 6 ) 以1 6 sr r n a 基因的v 3 区为靶，分析了模式菌株的特征条带以及不同模式菌株混 合后异源双链s s c p 带型变化情况，通过对构建的模式群落分析，认为不同微生物 在模式群落中能够产生特征条带，可以反映一个“群落”的多样性，而且可以检 测到占“群落 1 5 的菌株的存在【2 7 】。 1 1 4 5p c r s s c p 技术对微生物多样性研究应用的实例 ，f r a n k 等( 2 0 0 0 ) 人通过对根系微生物的分析表明s s c p 可以很好地分析微生 物群落的动态变化，并应用此方法研究了种植对土壤微生物群落的影响【2 5 1 。 z u m s t e i n 等( 2 0 0 0 ) 以荧光p c r - - s s c p 技术对运行了长达两年的流化床厌氧反应 器中的真细菌和古细菌的群落动态情况分别进行了跟踪监测，能够检测到4 5 株 真细菌和7 株古细菌参与了反应器酒糟厌氧发酵的过程，在外部参量恒定的条件 下，真细菌的群落种类组成变化很快，而古细菌却相对稳定【2 8 】。d e l b e s 等( 2 0 0 1 ) 采用p c i 卜s s c p 技术研究了一厌氧反应器在崩溃( 标志是乙酸的大量积累) 和恢 复时期真细菌和古细菌的群落动态情况【2 9 1 。b r a n d a o p f( 2 0 0 2 ) 将s s c p 技术和限 制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 技术相结 合对已知微生物样本进行分析，结果证实此方法快速、灵敏，是一种很好的微生 物分类工具【3 0 】。 p a s c a lp e u 等【3 1 】( 2 0 0 6 ) 用培养方法和p c r - s s c p 法连续六个月对某一农场 的猪粪水( p i gs l u r r y ) 微生物群落动态进行的研究表明：在前两个星期的厌氧状 态下，猪粪水中占优势的细菌种群变化极大，此后却相对趋于稳定；在猪粪水的 整个流动过程中，一些非培养的细菌类群如梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u m ) 等和污泥 中发现的可培养的菌种如乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) 优势；古细菌在整个监测过程 中均缓慢的适应其生存的环境以致于其多样性增加。用这两种方法检测了猪粪水 和池塘污泥产甲烷菌( m e t h a n o b r e v i b a c t e r ) 的群落变化情况，表明在猪粪水中检 测出的微生物类群在池塘污泥中却检测不到，这也许就是这两种方法的检测极 限。也可能正好说明了不同环境中微生物群落的差异。 1 2 生物除臭的研究进展 5 随着社会的发展和人们环保意识的增强，人们对环境质量提出了更高的要 求，有关环境污染的诉讼事件也不断增加。工农业恶臭物质由于不仅可以使人产 生不快和厌恶感，而且还危害人们的健康甚至生命，因而国外有些国家较早地对 恶臭实行专项立法，把恶臭作为一种公害。 国外早在5 0 年代末就对恶臭污染及其治理方法等方面进行大量的研究，并积 累了相当的理论知识和实践经验。1 9 9 3 年，我国制订了恶臭污染物排放标准 ( g b l l 4 5 5 4 - 9 3 ) ，标志着我国政府对臭气污染治理的重视【3 2 1 。此后国内对臭气 治理的研究也开始增多，但由于过去对农村环境恶臭的危害认识不足，养殖恶臭 气体不是研究的重点，但最近几年城市郊区养殖污染的危害日益严重，引起了人 们对养殖业恶臭污染的重视，相关的研究也逐渐增多。 总结国内外恶臭污染治理的方法和经验，可以看出常见的脱臭方法主要有液 体吸收法、直接燃烧或催化氧化法、臭氧氧化法、酸碱吸收法、电离法、吸附法、 生物法、掩蔽法、光催化氧化法等。但是在这些方法当中，最为经济有效和最常 用的方法是生物除臭法，它是在水、微生物和氧存在的条件下，利用微生物的代 谢作用氧化分解发臭物质，以达到净化气体的目的。生物除臭是2 0 世纪5 0 年代开 发的一种除臭技术，在2 0 世纪8 0 年代末9 0 年代初得到了迅速的发展，并逐渐发展 成除臭技术的主流。这种方法除臭效果好、材料易得、设备投资和维持费用低 3 3 , 3 4 】，因此最适合我国的养殖场、粪便、垃圾和污水处理场采用。 生物除臭法就是利用微生物来分解、转化臭气以达到处理目的，因此也叫微 生物除臭法。生物处理法中起主要作用的微生物主要是一些硝化细菌、亚硝酸菌、 反硝化细菌、硫细菌等。最早利用微生物处理恶臭的研究当属1 9 5 7 年美国人 r d p a n e r a y 的发明专利“利用土壤微生物处理h 2 s 废气 3 5 】。 1 2 1 臭气的危害 随着我国规模化、集约化畜牧业的发展，畜禽生产中产生的恶臭对环境的污 染不断加剧。不但严重影响着家畜( 禽) 的健康和生产性能的发挥，而且对人类的 健康造成极大的威胁。据不完全统计，我国猪、牛、鸡、鸭、鹅等畜禽粪便总 数以亿吨计算，成为我国城乡的一大污染源：尤其是夏、秋季，养殖场、养殖户 周围的环境污染严重影响了当地居民的生活和生产。由资料说明，牛粪恶臭成分 有9 4 种，猪粪有2 3 0 种，鸡粪有1 5 0 种。恶臭物质主要包括挥发性脂肪酸( v f a ) 、 6 酸类( a c i d s ) 、醇类( a l c o h l s ) 等等有机成分，此外，还有n h 3 和h 2 s 等无机成 分。而n h 3 和h 2 s 是养殖业主要的恶臭物质【3 6 1 。根据j h a r t u n g 等( 1 9 9 4 ) 报导，猪场 中臭气浓度较大的物质为h 2 s 、n h 3 、v f a ( 挥发性脂肪酸) 【3 7 1 。美国学者n a t a l i e a n d e r s o n 等认为，畜禽废弃物是大气中最大的氨气和硫化氢来源。而畜禽粪便产 生氨的多少取决于许多个参数，故氨散发的影响因素很难预测【3 8 3 9 1 。 ( 1 ) 研究表明，h 2 s 的危害主要有以下几个方面： ， 1 、h 2 s 是具有特殊腐蛋臭味的气体，对粘膜，结膜产生刺激，严重引起发炎： 2 、h 2 s 结合粘膜中n a + 形成n a 2 s ，具更强烈刺激性，进入血液结合细胞色素 氧化酶f e ”，导致细胞不能正常呼吸，缺氧死亡【3 6 ，4 0 】； 3 、家畜长时间处于h 2 s 中，体质减弱，肥育率下降，高浓度h 2 s 导致中枢麻痹甚 至死亡。 ( 2 ) 研究表明，n h 3 的危害主要有以下几个方面【3 6 加】： 1 、n h 3 的水溶液呈碱性，对黏膜有刺激性，严重时可发生碱灼伤，故可引起 眼睛流泪、灼痛，角膜和结膜发炎，视觉障碍： 2 、n h 3 进入呼吸道可引起咳嗽、气管炎和支气管炎、肺水肿出血、呼吸困难、 窒息等； 3 、n h 3 由肺泡进入血液，可与血红蛋白结合，使血红素变为正铁血红素，降 低血红蛋白的携氧能力、血液碱储和血红素的氧化性能，从而出现贫血和组织缺 氧； 4 、n h 3 将增强大气中氮的沉降，导致周围土壤、作物及森林的潜在酸化和 水体的富营养化等环境问题。 长期以来，为解决养殖业的这一问题。国内外也曾试验推广过不少粪便处理 方法，如干燥法、热喷法、沼气法等。但这些方法有的需要投入大量的设备和能 源，有的处理周期长，而它们的共同缺点是无法解决处理前粪便的臭味问题，所 以在许多养殖场未能得到广泛的推广，问题始终未能得到真正的解决。 1 2 2 生物除臭的原理 微生物处理恶臭气体就是利用微生物把能生物降解的恶臭气体吸入到体内 进行生物降解，通过微生物自身的代谢作用把恶臭气体转化为微生物维持生命活 动所需能源和养分，同时把代谢产物排出体外的一种过程【4 1 1 。微生物很难在气 7 相环境下发生降解行为，恶臭气体微生物降解行为发生的前提是恶臭气体成分已 经转移到存在微生物的固相或气相液膜中，恶臭气体的迁移转化过程可以用气体 吸收双膜理论来解释，即可以把微生物处理恶臭气体的过程划分为以下三个阶段 【4 2 】 o 第一个阶段：将部分臭气由气相转变为液相的传质过程； 第二个阶段：是溶于水中臭气通过微生物的细胞壁和细胞膜被微生物吸收， 不溶于水的臭气先附着在微生物体外，由微生物分泌的细胞外酶分解为可溶性 物质，再渗入细胞【4 3 】； 第三个阶段：是臭气进入细胞后，在体内作为营养物质为微生物所分解、利 用，使臭气得以去除。 微生物消化吸收恶臭物质后产生的代谢物再作为其微生物的养料，继续吸 收消化，如此循环使恶臭物质逐步降解。 恶臭物质的氧化作用需各种微生物参与，同一恶臭物质不同的氧化阶段需不 同的微生物。当恶臭气体为h 2 s 时，专性的自养型硫氧化菌会在一定条件下将h 2 s 氧化成s 0 4 2 。：当恶臭气体为有机硫如甲硫醇时，则首先需要异养型微生物将有机 硫转化成h 2 s ，然后h 2 s 再由自养型微生物氧化成s 0 4 2 。 h 2 s + 0 2 + 自养硫化细菌+ c 0 2 合成细胞物质+ s 0 4 2 + h 2 0 c h 3 s h ，c h 4 + h 2 s，c 0 2 + h 2 0 + s 0 4 2 。 恶臭气体为n h 3 时，n h 3 先溶于水，然后在有氧条件下，经亚硝酸细菌和硝酸细 菌的硝化作用转化为h n 0 3 ，在兼性厌氧的条件下，硝酸盐还原细菌将硝酸盐还原 为n 2 。 硝化n h 3 + 0 2 - h n 0 2 + h 2 0 h n 0 2 + 0 2- h n 0 3 + h 2 0 反硝化h n 0 3 ，h n 0 2心0 - n 2 0 一2 吸附、吸收在微生物体内的v o c s ( 挥发性有机化合物) 一部分转化微生物所 需要的营养物质，供给微生物生长繁殖所需，另一部分有机物质被氧化分解为c 0 2 和h 2 0 等简单无机物和部分有机产物，同时释放出大量的能量。生物脱臭的基本过 程可用下式表达： 恶臭物质+ 0 2- 细胞代谢物+ c 0 2 + h 2 0 8 1 2 3 生物除臭的特点 生物除臭的特点有以下几点： 1 、微生物生长适宜的温度一般为20 30 ，接近常温，一般勿须加热， 能耗低； 2 、微生物繁殖所需的能量来源于氧化分解过程中产生的氧化能，不需要其 它营养物质，降低了运行成本【划； 3 、采用微生物分解发臭物质，不需要大量的化学药剂和燃料，环境负荷小； 4 、生物脱臭技术应用范围广，对高、低浓度的臭气都有较好的脱臭效果，所 以设备和运行费用低，维护管理方便【4 5 】； 5 、微生物主要将恶臭物质氧化分解成c 0 2 、h 2 0 、h 2 s 0 4 、刖0 3 等物质，产 生二次污染的可能性低p 4 4 5 1 。 1 2 4 生物除臭法在工农业中的应用 1 2 4 1 除臭微生物的筛选 在生物除臭的系统中，菌种处于非常重要的地位，因为它将直接影响臭气的 去除、转化效率。近几年来，人们在除臭微生物的分离、筛选、应用方面做了许 多研究。 陈书安( 2 0 0 2 ) 为治理禽畜废弃物产生的恶臭对环境的污染，采用合适的分 离方法从环境中分离了诸多除臭微生物，并且通过初筛和复筛相结合的方法成功 地筛选出具有减少氨气释放量6 4 以上、硫化氢释放量5 0 以上、降低2 个臭味 等级的微生物f 1 m 。结果表明，选择合适的筛选方法是筛选除臭微生物的关键。 初筛和复筛相结合可以快速、有效地筛选除臭微生物。除臭微生物f 1 显示了良好 的应用前景。 罗永华( 2 0 0 3 ) 等从广州市李坑垃圾填埋场附近的土壤样品中分离到具有明 显除臭效果的四株菌，根据垃圾恶臭的主要成分研制了微生物除臭菌剂。该微生 物除臭剂对氨气、硫化氢、总烃、臭气浓度、细菌总数的去除率分别可达到8 3 3 、 8 0 7 、6 2 5 、8 6 8 、8 7 0 ，应用在广州的棠下、员村环卫站的垃圾转运、压 缩的处理过程中，取得了满意的除臭效果【4 7 1 。 赵晨曦等( 2 0 0 5 ) 从新鲜鸡粪中分离出丝状真菌、细菌、放线菌和酵母菌等微 生物菌种1 3 6 株，经过初筛和复筛试验后得到5 株同化恶臭能力强、耐高温的嗜 9 粪微生物菌株。将此5 株微生物菌株混合应用于鸡粪发酵处理，可降低氨气释放 量为6 6 5 8 ，减少氮素损失5 1 0 ，最高发酵料温达到6 8 5 c ，水分降低至 3 1 2 5 ，取得了满意的鸡粪无害化处理除臭效果【4 引。 魏良等( 2 0 0 5 ) 从鸡粪及其污染的土壤中分离到5 l 株菌株，通过初筛和复 筛实验，从中筛选出1 0 株具有较好除臭能力的菌株，两两组合进行鸡粪的除臭 实验，n h 。的平均释放量为0 0 3 1ug k g ，与对照组相比，释放量降低了5 2 5 ： 三个菌株组合，n h 。的平均释放量与对照组相比，释放量降低了5 4 9 t 4 9 1 。 可以看出，复合菌株的除臭能力明显强于单个的菌株，这暗示我们在不断拓 宽筛选范围以及筛选高效除臭菌株的同时，更应该重视菌株之间的有效组合，这 样才能在实际生产发挥应用的作用。 1 2 4 2 除臭微生物的应用 。 k a n a g a w a 等( 1 9 8 9 ) 的实验中证明采用排硫干菌处理h 2 s 具有较好的处理效 果，然而在同样条件下采用灭菌后的培养基处理h 2 s ，虽然也有部分去除但处 理速度很低，因此，认为h 2 s 的氧化主要是由微生物来实现的【5 0 】。b u i s m a n ( 1 9 9 1 ) 在一篇从事s 2 。化学氧化和生物氧化机理的论文中报导：1 5 0 m g l 左 右的s 2 。的生物氧化速率是化学氧化速率的7 倍。1 0 m g l 的硫化氢是为化学氧 化速度的7 5 倍【5 l 】。 p a r k ( 2 0 0 1 ) 研究了以多孔陶瓷、硅藻土、活性淤泥混合为填料的生物滤 器的除恶臭( n h 3 、h 2 s ) 的能力，试验条件为空速