（分析化学专业论文）用于细胞生理特性研究的新型荧光探针的研制与应用.pdf

山东师范大学硕士学位论文 摘要 生命活动是由各种生物活性物质参与，相互关联、相互制约的众多化学反应 的总结果。许多生物活性物质与氨基酸、蛋白质或其它有机基团结合，发挥各种 各样的生物学作用、特殊的生理功能和高度的生化效应。其中，氢离子和活性氧 自由基是两种重要的生物活性物质。 氢离子浓度作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，在许多细胞内的过程 中起到关键的调节作用。许多报道认为一些疾病与细胞质或者酸性细胞器内的 p h 异常有关。因此，精确测量细胞内的p h 非常重要。目前，许多方法可用于 检测p h 这些方法包括微电极、核磁及荧光光谱方法。其中，荧光法由于其非 破坏性、高的灵敏度和专一性、以及广泛可用的荧光染料在测定p h 时比其他方 法更具优越性。而且，荧光显微成像技术通过使用荧光p h 探针能够描绘出活体 细胞内氢离子的时空分辨。 目前，两类荧光p h 探针得到开发应用：一类是用于检测p h 范围大约是 6 8 7 4 的细胞质内p h 的探针：另一类是用于检测酸性器官如溶酶体、内涵体等 的探针，这些酸性器官p h 范围大约是4 5 6 o 由于细胞内p h 的微小变化可能 导致细胞的功能紊乱，因此理想的p h 荧光探针应当灵敏的响应细胞内p h 的微 小变化，并且能够避免来自生物细胞本身的干扰。然而，目前可用的p h 荧光探 针有以下缺点：低的灵敏度，有的激发在紫外区。激发在紫外区会损伤活体样品 并且引起细胞内生物分子自发荧光的干扰。另外，用于检测酸性器官内的尤其是 理想的p h 探针几乎没有，这被认为是细胞生物学及医学发展的瓶颈。因此，我 们研究的焦点在于设计具有好的选择性、高的灵敏度、好的光稳定性以及工作 p h 在酸性范围的近红外p h 荧光探针。 另外，在生物的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基承o s ) ，如超氧阴 离子自由基( 0 2 。) 、羟基自由基( h o ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、氧化氮( n o ) 、过氧亚硝 基( 0 n 0 0 1 等，这些自由基在生理学上起重要作用。在氧化胁迫下细胞内氧化水 平的快速升高能够引起生物分子的损伤，导致各种疾病，比如癌症、机体炎症、 组织过氧化、蛋白质交联变性、d n a 损伤等。目前测定自由基的方法主要有电子 自旋共振法( e s r ) 或电子顺磁共振法( e p r ) 、高效液相色谱法( 玎? l c ) 、化学发 光法( c l ) 、荧光法以及电化学方法等。然而，由于生物体内活性氧自由基的半衰 山东师范大学硕士学位论文 期非常短，稳态浓度极低，所以真正适用于检测生物活体内r o s 的方法还是较少 的。目前，荧光成像方法具有好的灵敏度、选择性，并且充分利用了共聚焦激光 扫描显微镜方法( c l s m ) 的优点。c l s m 是一种具有高分辨率的荧光显微成像方 法，它能够给出探针所检测自由基在细胞及组织的荧光成像。荧光成像方法挑战 了传统的荧光方法，实现了自由基的“实时、可视、定量”检测。目前迫切需要 科研工作者开发对r o s 能够专一识别、快速响应的荧光探针用以动态观测研究某 些器官中活性氧自由基的产生、代谢、相互转化及其动态损伤生物机体的过程。 本论文主要以提高探针的响应速度、灵敏度以及选择性为主要出发点，以荧 光检测和共聚焦显微成像技术为研究手段，基于氢离子、超氧阴离子自由基分别 引起探针荧光变化的机理，开展了两方面的工作。 ( 一) 以三碳花菁和3 氨基苯酚为原料设计合成了一个双重的近红外p h 荧光探 针a p c y a p c y 具有高的灵敏度，好的光稳定性，优越的细胞膜穿透性以及 强的p h 依赖。p h 滴定实验表明酸性条件下在4 0 6 5p h 范围荧光强度增强1 0 倍有余，p k a 为5 1 4 在碱性条件下，工作p h 范围是1 0 5 1 1 8 ，p k a 为1 1 3 1 探针用于h e p g 2 细胞的荧光成像结果进一步表明了该探针在监测活体细胞内 矿潜在的重要价值。 ( 二) 以荧光素和三苯基溴化锗为原料，设计合成了用于检测超氧阴离子自由基 的荧光探针。该探针能够快速响应超氧自由基，并且具有较好的选择性、灵敏 度及光稳定性。另外，作为一种有机锗化物，该探针毒性很低甚至无毒，能够 很好的用于生物体系。 关键词：活性氧，超氧阴离子自由基，氢离子，近红外荧光探针，激光共聚焦扫 描显微镜 分类号：0 6 5 7 3 i i 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ep r o g r e s so fl i f ei sat o t a lr c s u l to fm a l l yr e l a t i v ec h e r n i c a lr e a c t i o n sw “c ha n u m b e ro fb i 0 1 0 舀c a la c t i v es u b s t 卸c e st a k ep a ni n m a l l ya c t i v es u b s t a l l c e sc a l l c o m b i n ew i t h 锄i n oa c i d ，p r o t e i no ro m e rb i o l o 百c a lm o l e c u l e s ，a n dp l a yi m p o r t a l l t b j o l o 舀c a la c t i o n ，s p e c i a lp h 蜘o l o 舀c a lf l m c t i o n 锄dh i 曲b i o c h e f n i c a le f t s 州t h t h ep r o 可e s so fb i o c h e m i s 扛ya n dm 0 1 e c u l 越b i o l o g ya n d 血eu s i n go fc h e m i s t r y p h ”i c sa n db i 0 1 0 9 y ，t i l ec d u r s eo fc h e i 】i c a lr e a c t i o ni i lo 唱a 1 1 i s mw a s 伊a d u a l l y e l u c i d a t e d b u tm o r c 孤dm o r ee x p c r i m e n t a le “d c e s 鲫g g e s tt h a tt t l er e s u l t s o b t a i n e d r o mt h er e a c t i o no c c u r r e di nt e s tt i 】_ b e sc a n n o tr e f l e c tt b ei n s t a l l c ei nl i “n g o b j e c t s o “i sn e c e s s a r yt oe x p l o r c 1 er e a l t i m ec h m g e so fa c t i v es u b s t 锄c e si 1 1o r d c r t oc o m p r e h e n dt h e1 i f c 舢n o n go ft h e m ， ra 1 1 dr o sa r e 咖i m p o r t a n ta c t i v e s u b s t a n c e s h + c o n c e n 仃a t i o n ，觞a ni m p o r t a mm e t a b 0 1 i ca n dc e l l u l a rp a m m e t e r ，p l a ”ac e n 叽1 l o d u l a t i n gm l ei nm a n yc e l l u i a re v e m s 锄c h 鹊c e l l 乎| o w 血，c a l c i 啪r c g u i a t i o 玛 e n z y m a t i ca c t i v i t y ，r c c e p t o 卜m e d i a t e ds i 印a lt m s d u c t i o n ，e n d o c y t o s i s ，d l e n l o t a x i s ， a n do t l l e rc e l l u l a rp r o c e s s e s r 印o n sh a v es u g g e s t e dac o n n e c t i o nb 鲍v e e ns o m e p a t h 0 1 0 百c a ls t a t e s ，n o t a b l yc a n c e r s ，r e l l a lf 缸l u r e ，n e l l r a lc e r o i dl i p o f h s c i n o s e s ，越d c h r o l l i co b s n l j c t i v ep u h n o n a r yd i s e 船e 趾da b n o m a lp hv a l u e si nc ”叩1 船mo ra c i d i c o r g a l l e l l e s a sar e s l l l t ，t l l ep r e c i s em e a s u r e r n e n tf b ri n n a c e l l u l a rp hi so f 口e a t i m p o n a n c e am u n b e ro fm e t h o d sa r ec u r r e m l ya v a i l a b l ef o r 血em e a s i l r 锄e n to fp h i i l c l u d i n gm i c r o e l e c t r o d e s ，n u c l e a rm a 印e t i cr e s o n a n c e ( n m t ) a n dn u o r e s c e n c e s p e c 打o s c o py a m o n gt h e s em e m o d s ，f l u o r c s c e n c es p e c t m s c o p yo 盘r ss i g n i f i c a i l t a d v a i l t a g c sd u et oi t sn o n d e s t m c t i v ec h a r a c t e r lh i 曲s c i l s i t i v 时a i l ds p e c i f i c i 啊a n dm e a v a i l a b i l 埘o faw i d em g eo fi n d i c a t o rd y e s m o r e o v 盯，f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p i c i m a g i l l gt e c 王1 1 1 i q u ea l l o w su st om a pm es p a t i a la 1 1 dt e m p o 糟id i s t r i b u t i o no f 矿w i t h i n 1 i v i n gc e l l s n o w a d a y s ，t w oc l a s s e so fn u o r e s c e n p hp r o b e sh a v e b e e nd e v e l o p e d ，m a ti sp r o b e s 旬rc y t o s o lw h j c hw o r ka lap ho f6 8 7 4 ，a n dp r o b e sf o ra c i d i co 唱a n e l l e ss u c h 船 l y s o s o m e sa i l de n d o s o m e sw 1 1 i c h 劬c t i o no v e rm ep h 姗g eo f4 5 - 6 na sm i n o r v a r i a t i o i l so fi 1 1 廿a c e l l u l a rp hm a yi n d u c ec e l l u l a rd y s f l l l l c t i o i l d e s i r 曲l ep hn u o r e s c e n t p r o b e ss h o u l db ea b l et os e n s i t i v e l yr s p o n dt oam i n o rc h a i l g eo fp h ，a 1 1 dc a l la v o i d i n t e r f b r i n gf b mn a t i v ec e l l u l a rs p e c i e s h o w e v e r ，1 i m i t a 石o i l so ft h ec 婀即t l ya v a i l a b l e p hp r o b e si n c l u d e1 0 ws e n s i t i v i t y ，a n d o re x c i t a t i o np r o f i l e si nm eu l t r a v i o l e tr e 百o n i i l 山东师范大学硕士学位论文 w h i c hc a nd a m a g e 酊v i n gs a r n p l e sa n dc a u s ei 1 1 t e r 向j n ga u t o 日u o d 踟c e 疔o mn a t j v e c e u u l a rm o l e c u l e s n e a r - i n 如r e df l u o r e s c e n c ep r o b ew a s 埘d e l yl l s e di i lb i o l o 西c a l s c i e i l c ef i e l db e c a u s eo fm e i rs p e c i a lp h o t o p h y s i c s 锄dp h o t o c h 锄i c a lc h a r a c t e r s ，l l i 乒 s c i l s i t i v i t y ，而d er e s p o n s er a i l g ea i l d 印p r 叩r i a t ec o n d i t i o n a d d i 石o n a l l y ，v e r yf 押 a c i d i cn u o r e s c e mp r o b e sa r cc o l l s i d 盯e dt 0b ed e s i r a b l eo n e sf o rs t i l d y i n ga c i d i c o r 髟m e l l e s ，w h i c hi sr e a l l yab o 砌e n e c ki i lc e l lb i o l o 舀c a lo rm e d i c “s t u d i e s 1 h u s ，l t l e f o c u so fo u r 咖d yi st od 髂i 印n e 小i i l 姗dn u o r e s c e n tp r o b e 谢也g o o ds e l e c t i v i 饥 m 曲s e n s i t i v i 9 0 0 dp h o t o s t a b i l i t ya n dw o r k i n gw i 吐血t i i ea c 诫cp hr a i l g e h la d d i t i o n ，v “o u sr e a c t i v eo x y g e s p e c i e s ( r o s ) a r eg 锄e r a t e di l ll l l ec o u r s eo f b i 0 1 0 百c a lm e t a b o l i s m ，s u c h 鸹唧e m x i d e ( 0 2 。) ，h y d m g e i lp e r o x i d e 饵2 0 2 ) ，h y ( 1 r o x y l r a d i c a l ( h o ) ，n i t r i co x i d e o ) 孤dp e r o x y n i n e ( o n o o _ ) ；m e s er o sp l a yav i t a lr o l e i 1 1p h y s i o l o g y t h e ya r ei m p o 砌i l ti n e d i a t o r sf o rt h ep a m o i o 垂c a lc o n d i t i o n so fv a r i o l i s d i s e a s e s ar a p i dr i s ei ni 曲a c e l l u l a r0 x i d a n tl e v e l su n d e ro x i d a 士i v es t r e s sc o l l l dc 肌s e d a m a g et ob i o l o g i c a lm o l e c u l e sa l l dr e s m ti i lv a r i o u sd i s e a s e ss u c ha sc a r c i n o g e n 嚣i s ， 枷a n l i l l 鲥o t l ，i s c l e i n i a - r e p e 出i o n 畸u r y t 0d a t e ，s e v e m im e m o d sf o rr o s d e t e c t i o n i 1 1 c l u d ee l e c 仃d ns p i l lr e s o n a i l c es p e c n d s c o p y ( e s r ) o re l e c 仃0 1 1p a r a m a g n e t i cr e s o l l a i l c e s p e c t r o m e 仃y( e p r ) ，肿l c ， c h e r n i l u 谢n e s c e n c e ( c l ) ， n u o r e s c e n c ea n d e l e c n d c h e m i s t r ym e m o d h o w e v e r ，m es h c n1 i v ea i l d1 0 wc 叽c e l l 眦i o no fr o sm e a l l m ed e t e m 血a t i o nd i 伍c u l t ，e 印e c i a l l ym ed e t 锄i i l a t i o ni i lv i v oa i l di s 如a tp r e s e i l t ， f l u o r e s c e i l c e 砷a g i i l gm e t h o d sh a v e9 0 0 ds e 璐i t i v i 吼s e l e c 晰时锄dt a l 【e 血l la d v a m a g e o fb e n e f i t sp r o v i d e db yc o n f o c a ll a s e rs c 锄m i l l gm i c m s c o p y ( c l s m ) c l s mi sa t y p e o f1 1 i 曲一r e s o l u t i o nn u o r e s c e n c e1 1 1 i c m s c o p ym a tc a i l 百v et l l en u o r e s c e n c ei l a g eo f c e l l sa n dh s s u e s ，w h e r er o sa r ed e t e c t e d b y 丑u o r e s c e n tp r o b e f l u o r e s c e n c e 妇a 百n g m 劬o dc h a l l e n g e st l l e 仃a d i t i o n a l u o r e s c 饥tm e 也o da n dr e a l i z e s 山ed e t e c 血go fr o s i 1 1v i v oa n di ns i t u t l 眦i sa n 懿i g e n tn e e d 白rd e s e a r c h e r si od e v e l o p 趣t - r e s p o n d p r o b e st o 廿a pr o s f o ri n v e s t 谵撕o no ft h em e c h a m s m so f 也ep r o d u c t i o n ，m e t a b o l i s i i l 觚dt r a 伍c l d n g t h e r e f o r e ，c o n s id e 血gm ea p p l i c a b l ep r o b e s ，i ti so f g r e a ti i n p o r t a i l c et o i m p r 0 v er e a c t i o nr a t ea n ds e l e c t i “t yt oa v o i dp o t e n t i a ls i d em a c t i o n sw i t ho 山e rr o s u n d e rs 0 功ec o n d i t i o n s i fn o v e lf l u o r e s c e n c ep r o b e st h a to v e r c o m et h ea b a v ep r o b l 哪 w e r ea v a j l a b l e ，t l l e yw o u l dc o n 啊b u t eg r e a t l yt om ee l u c i d a t i o no ft h em l c so fr o si l l l i v i l l gc e l l s ms m 砌a 吼n u o r c s c e l l c ea 1 1 a l y s i sa i l di i i l 4 画n gt e c h e n 0 1 0 9 yw a sw i d e l yu s e di i l b i 0 1 0 百c a la 1 1 a l y s i s f i e l d e f f e c d v e p r o b e sf o r 旷，r o ss h o u l d f c a t i l r e g o o d c o m p a c i b j l i t yw i mb i o l o 百c a ls 锄p l e s ，l o wt o x i c i t y ，删r e s i s t a n c et oo x i d a t i o m 山东师范大学硕士学位论文 “s i b l e - w a v e l e n 垂he x c i t a t i o na n d 锄i s s i o np r o f j l e st om i 血血z es a l t l p l ed a r l l a g ea i l d n a t i v e c e l l u l a ra u t o 丑u o r e s c e c e ，卸dan u o r 鹤c 鳓c er e s p o s ef o rm a p p i n gs p a t i a l r e s o l u t i o n b 够e do nt l l ec h a n g e si ns p e c t n l i nc h a r a c t e r so ft h en u o r e s c e n tp r o b e sr e a c t i n gw i m 矿，r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，w eh a v ec a r r i e do u tt w oa s p e c t so f i n v e s t i g a t i o n ： ( 一) ad u a ln e * i 1 1 丘a r c dp hf l u o r e s c e mp r o b e ，a p _ c y ，w a ss y l l m e s i z e dm r o u 曲a o 肿一s t 印r e a c n o no f 砸c a r b o c y a n i n ew i m3 a m j n o p h e n o lu n d e rm i l dc o n d m o n s w i t hal a r g em r o u 曲p u t a p c ye x l l i b i t sh i 曲s e 璐i t i v i 劬g o o dp h o t o s t a b i l i 吼 e x c e l l 蛆tc e l lm e m b r a n ep e r i i l e a b i l 时a n dg 吨n gp hd 印e n d e n c e t h ep ht i t r a t i 咄 i d i c a t em o r et h 趾1 0 - f 0 1 di n c r e 嬲e 血n u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw i 血i i lm ep hr a n g eo f 4 0 6 5w i t hp k av a l u eo f5 1 4a 1 1 dp k av a l u eo f1 1 3 1w i t h i l lt h ep h 加g eo f 1 0 5 - 11 8 t h ep hn u o r e s c e n tp r o b e 缸t l yr e a l i z c dd u a lm e 越u r e m e m sf o f 矿 w i t h i nd i f 衔e mp hr 孤g e sa 士d i 鼢e me x c i t a t i o n 觚d “s s i 叽w a v e l c n g m s f u r t h e 加o r e ，硒t 1 1 ef i r s tn e a r i n 丘a r e dn u o r c s c e n tp r o b ef o ri i l 打a c e l l u l a ra c i d i cp h i 1 i l a g i l l g ，i t i se s p e c i a l l ys 伍t 曲l ef o fs t u d y i n ga c i d i co r g 缸c 1 1 e s w eh “e d 啪o m 仃a t e dt h cv a l u eo fa p c yb ym 删t o 曲gi n t r a c e l l u l a r rw i t l l i nh 印g 2 c e l l s r ，- ( 二) an o v e ln u o r e s c e n tp r o b ef o rt l l ed e t 黜i n a t i o no fs u p e r o x i d ea i l i o nr a d i c a l ( 0 2 ) w 罅d e s i 盟e d a i l ds 灿i z e dt h r o u g l lt h er e a c t i o no fn u o r e s c e i n 讲t h 呻h c n y l g e 皿肌i 哪b r o m t 1 1 ep r o b ec 姐r 印i d l yr e s p o n dt o0 2 ，锄d h a s1 1 i 曲 s e l e c t i v 畸，s e n s i t i v i t y 孤dg o o dp h o t o s t a b i l i t y f u r h 锄o r c ，船o n eo fo r g a 血c g e m l a j l i 吼c o m p o u n d s ，l ep r o b ei s1 0 we v e nn ot o x i c ，w l l i c hw i l lh a v e 加1 p o n a n t a p p l i c a t i o ni nd e t e c t i n g0 2 1 i i lb i o l o 百c a ls y s t 锄s k e yw o r d s ：r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ，s u p e r o x i d ea l l i o nm d i c a l s ( 0 2 ) ， r ， n e a r i n 仔a r e dn u o r e s c e n tp r o b e ，c o i l f o c a l l a s e rs c 锄i n gm i c r o s c o p y c a t e g o r y u m b e r ：0 6 5 7 - 3 v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 ， 学位论文作者签名： 叟j 霞 导师签字： 学位论文版权使用授权书 、令l 、，走 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 剑霞 导师签字： 签字日期如g 年乡月必日签字日期：如p 年j 月湘 之念矿 ，、) 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 生命活动是由各种生物活性物质参与，相互关联、相互制约的众多化学反应 的总结果。许多生物活性物质与氨基酸、蛋白质或其它有机基团结合，发挥各种 各样的生物学作用、特殊的生理功能和高度的生化效应。研究生物活性物质的存 在状态、结构及其生理功能，探讨生物活性物质在疾病发生、发展、转归、控制 和防治中所起的作用，将为人类以生物调节为中心综合防治疾病奠定重要的基 础。其中，氢离子和活性氧自由基是两种重要的生物活性物质。 1 氢离子 正常人血液的p h 值为7 3 5 7 4 5 ，平均p h 值为7 4 正常机体不断产生酸性 物质和少量碱性物质，也有一定数量的外源酸碱物质进入体内，这均可影响血液 p h ，但机体通过体液中的缓冲体系和肺、肾的作用，维持机体恒定的p h 内环境。 1 1 体内氢离子的重要作用 氢离子浓度作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，在许多细胞内的过程 中起到关键的调节作用，比如细胞生长，钙离子调节，酶活性，信号传导，细胞 内吞作用，化学向性及其他的细胞过程【l 。许多报道认为一些疾病如癌症，肾 衰竭，肺病等与细胞质或者酸性细胞器内的p h 异常有关【5 川。 1 1 1 神经肌肉细胞内p h 的作用 生物有机体必须要有稳定的内环境，其体内的各种功能才能正常地进行。构 成机体的神经肌肉细胞内p h 的稳定性维持，对其新陈代谢的功能活动是必不可 少的。当调控p h 的转运系统失调时，就会发生各种疾病。对神经肌肉细胞内的 p h 研究已有很久的历史，从最初对细胞内p h 的变化过程予以记录到内外环境各 种因素对它的调控机制研究等等。随着神经肌肉细胞内记录技术的发展，p h 对 细胞质蛋白和跨膜蛋白的影响，以及对酶的活动和通道性质的影响等也得到广泛 研究。 神经肌肉细胞质和细胞膜具有维持p h 稳定的系统，它们是通过物质代谢和 离子转运经细胞膜的运动，弱酸与弱碱对质子的解离和结合而予以实施。任何人 为的或生理性的引起细胞内p h 值的改变，均促使神经肌肉细胞产生复杂的反应， 以维持其p h 值的恒定。显然，细胞质对h + 浓度有极强的缓冲能力。通常要导致 一个单位p h 变化需加入溶液的h + 的量( m 删l ) 来定义该溶液的缓冲能力。细胞浆 山东师范大学硕士学位论文 除了依赖被动地缓冲来维持p h 值恒定以外，研究还发现，当神经肌肉细胞内p h 变化时在细胞膜中存在一个h + 转运系统，如能使细胞浆碱化的n a + 用+ 交换，酸化 的r ，一交换和n a + 依赖的c 1 m c o 3 交换，还有跨膜转运的h 十a t p 弱e 等等。一般 情况下，同一个细胞中往往具有两种以上p h 调节的转运系统，致使神经肌肉细 胞内微小的p h 值变化都能产生极其明显的效应，特别是影响那些可离子化基团 的蛋白质电荷和构型的改变，从而去影响它们的功能 8 】。 1 1 2 细胞内氢离子浓度的改变与细胞凋亡 细胞凋亡是一个具有积极生物学意义的程序化细胞死亡过程，它与细胞有丝 分裂相互协调，共同调控胚胎的发育、组织分化以及个体的免疫和衰老等生理过 程【9 】。细胞凋亡的发生不仅涉及到许多与程序性细胞死亡有关的基因，如存活基 因( b c l 2 和b c l - x ) 和致死基因( c m y c 和p 5 3 ) ，同时与细胞内许多信号系统的调控 也密切相关，如游离钙离子浓度、内源性核酸内切酶以及细胞内口h 等【1o n l 。阐 明影响细胞凋亡的因素以及细胞凋亡过程中细胞内各信号传导间的相互关系， 对于理解生命的发展、疾病的发生以及药物的引导治疗具有非常重要的意义。已 有许多研究表明细胞内p h 的改变与细胞凋亡是密切相关的【1 2 1 4 。各种物理和化 学刺激诱导细胞凋亡时，普遍存在细胞内酸化，细胞内酸化己成为细胞凋亡的一 个重要特征。细胞内酸化与细胞凋亡之间的相互关系已成为科研工作者关注的热 点。 1 1 3 细胞内氢离子浓度与癌症 早在2 0 世纪2 0 年代，德国生物化学家o t t ow a r b u r g 【5 1 ( 1 9 3 1 年生理及医 学诺贝尔奖获得者) 就提出异常的细胞内能量代谢是导致癌症发生的原因之一， 细胞能够通过线粒体的有氧呼吸或胞质中的糖酵解来获取能量。w a r b u r g 认为发 生肿瘤的细胞存在于酸性的外部环境中，这使细胞从有氧呼吸供能转向糖酵解供 能，最终导致细胞的恶性发展。 尽管许多癌症研究者认为这种供能的转换只是癌症发生的一个附产物，而不 是诱发因素，但是w a r b u r g 的工作仍引起了人们对细胞内酸、碱值变化和肿瘤 发生之间关系的探索【16 7 1 。 细胞在应对外界损伤时常常激活一个称为程序性凋亡的死亡途径，这时细胞 内的d n a 排列混乱，并导致细胞停止增殖。凋亡是否发生是由细胞中“存活前 诱导因子”和“凋亡前诱导因子”的相互作用来决定的。在正常细胞中“存活前 2 山东师范大学硕士学位论文 诱导因子 如b c l x l 能使“凋亡前诱导因子”b i m 保持失活状态，从而使细胞 不发生凋亡。近来一些研究小纠1 2 0 1 发现，d n a 损伤会导致b c l x l 中一个天门 冬酰胺的快速脱氨基化而转变为天门冬氨酸。脱氨基的b c l x l 就不再能够抑制 b i m 的活性，这提示损伤引发的脱氨基作用能够诱导凋亡的产生。 在这些研究基础上，d e m sa l e x 孤d e r 等【2 1 2 2 1 的研究发现调控细胞内酸、碱值 的变化可能是一条治疗癌症的新途径。他们的研究揭示了一条关于b c l 一x l 的分子 信号通路，如图1 所示，d n a 损伤导致细胞膜上一种称为n 涮离子交换蛋白 ( n a + i + e x c h a l l g e r ，n h e 1 ) 二到三倍的表达上调，n h e 1 能够将细胞外的钠 离子与细胞的氢离子发生交换，导致胞内氢离子外流，细胞内碱度升高。而碱 性环境促进了b c l - x l 中两个天门冬酰胺的脱氨基发生，改变了其空间结构，使其 不再能够和凋亡前诱导因子结合，而不能屏蔽其功能，最终导致细胞凋亡的发生。 为检测这一信号通路在人源肿瘤细胞中是否也发挥作用，作者对慢性淋巴细 胞瘤病人来源的细胞进行了研究，他们发现也得到和小鼠一致的结果，当细胞内 碱性增强，b c l x l 中的天门冬酰胺的脱氨基作用和细胞的凋亡就会相应发生。 h h n a + d n a a a m a g e ， 9 兰善州i 届 旦雒乒 a p o p t o s l s 图1 尽管w 抽u r g 在7 0 年前提出的能量代谢与肿瘤发生的理论并不正确，但是 他的工作提示了p h 和癌症发生之间的关系，而如今这一联系得到了实验证实。 在多种肿瘤类型中它们都利用了b c l x l 来避免凋亡的发生，这可能也是它们能对 抗治疗的原因。由d e n i sa l e x a n d e r 等提出的通过n h e 1 改变细胞内酸碱度，促 进b c l x l 中天门冬酰胺脱氨基引起凋亡的现象可能为癌症的治疗提供新的途径。 山东师范大学硕士学位论文 1 2 氢离子的监测 目前，许多方法可用于检测p l 这些方法包括微电极2 ”，核磁i 2 4 1 ，吸收1 2 5 1 及荧光光谱方法 2 8 2 b 】。测定p h 值一般用玻璃电极。但由于存在电化学干扰，可 能的机械损伤等缺陷而不适于活体p h 检测【2 9 】。此外，玻璃电极如1 也不适于极端 p h 的测量。荧光法由于其非破坏性，高的灵敏度和专一性，以及广泛可用的荧 光染料在测定p h 时比其他方法更具优越性【3 1 】。而且，荧光显微成像技术通过使 用荧光d h 探针能够描绘出活体细胞内氢离子的时空分辨。 荧光p h 探针一般是通过探针与质子的作用引起荧光的变化来实现检测的目 的。在此理论基础上，探针可分为两类：第一类包括普通使用的荧光素、蒽等的 衍生物。这类探针的酸、碱形式中只有一种显示强荧光，因此，与p h 对应的荧 光变化取决于酸或碱形式的浓度。稳态荧光检测氢离子的浓度操作简单，得到了 广泛的应用。第二类探针的酸、碱形式具有不同的吸收或者( 和) 发射带，随p h 变化，发射或( 和) 激发波长会发生移动，可以用不同波长下的荧光比率来测定氢 离子浓度。在不同波长下的荧光比率不受探针浓度，光漂白，仪器条件如光路长 度，激发强度，检测器灵敏度等的影响。另外，有些荧光探针本身随p h 变化荧 光寿命发生变化以此来检测氢离子浓度，然而，这种探针必须基于一定的理论设 计才可。并且，这种测定方法需要更加精密复杂的仪器包括更强的激发光源等。 根据荧光p h 探针的工作范围不同，荧光探针又可分为两类：一类是用于检测p h 范围大约是6 8 7 4 的细胞质内口h 的探针【3 2 - 3 7 】；另类是用于检测酸性器官如 溶酶体、内涵体等的探针，这些酸性器官p h 范围大约是4 5 6 o 【3 s 3 9 1 。 2 0 0 2 年，s j a n l e s r e m i n g t o n 等【4 0 】合成了用于检测氢离子的具有双重发射的、 比率荧光探针一绿色荧光蛋白的变体d e g p f s d e g p f s 系列探针是用苏氨酸取代 6 5 位的残基，以及用半胱氨酸取代1 4 8 位和( 或者) 2 0 3 位残基得到。d e g f p s 的 p k a 值在6 8 8 o 之间，随酸度增加，发射波长从绿光范围( x = 5 1 5 衄) 向 蓝光范围( 丸m a x = 4 6 0n m ) 变化。文中分析了两种探针d e g f p l ( p k a = 8 o ) 和 d e g f p 4 ( p k a - 7 3 ) 对氢离子的响应情况，并且通过d e g f p l 在高、低p h 的晶体 结构对照，说明了响应氢离子及发射波长变化的机理。此外，将d e g f p l 用于 p s l 2 0 纤维原细胞检测氢离子( 图2 ) ，证明了探针用于检测生理条件下p h 的重 要价值。 4 山东师范大学硕士学位论文 图2 h n a g e so fp s 12 0c e l l s 订卸s i e n t l yt 】f a i l s f e c t e dw i t l ld e g f p 4 龇d1 0 a d e dw i t h s n 触疆1 “v ec e l l sw e r ei m a g e db yc o n f o c a lm i c r o s c o p y e m i s s i o nw a v e l e n 班h sf o r d e g 】印4w e r e3 8 5 - 4 7 0 眦( a ) a 1 1 d4 7 5 - 5 2 5 衄) i nr e s p o n s et 03 6 4n me x c i t a t i o n f o rs n a r f 一1 ，e i l l i s s i o nw a v e l e n g t l l sw e r e5 6 0 一6 1 5 姗( c ) a n d6 2 5 6 5 5i 姐( d ) i i l r e s p o i l s et o5 4 3 姗e x c i t a t i o n c e l l u l a ra u t o f l u o r e s c e l l c eo c c l u d e sm u c ho f