（细胞生物学专业论文）半滑舌鳎（cynoglossus+semilaevis）雌鱼fosmid基因组文库的构建及初步分析.pdf

半滑舌鳎( c y n o g l o s s u $ s e m i l a e v i a ) 雌鱼f o s n f i d 基因组文库的构建及初步分析 半滑舌鳎( c y n o g o s s u ss e m il a e v i s ) 雌鱼f o s m id 基因组 文库的构建及初步分析 摘要 半滑舌鳎( c y n o g o s s u ss e m j a e v i s ) 是我国优质的大型经济鱼类，其养殖业 发展迅速，但目前基因组研究较少，限制了许多研究工作的深入开展。本研究构 建了第一个半滑舌鳎雌鱼f o s m i d 基因组文库，对文库的部分克隆进行了双末端 测序和序列分析，并从中筛选了部分微卫星多态性位点和一个性别相关序列。主 要结果如下： 1 、半滑舌鳎雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建和鉴定 本研究用流式细胞术测得半滑舌鳎雌性基因组大小约为6 0 6 3 6m b ；从半滑 舌鳎雌鱼肌肉提取基因组d n a ，选取大小合适的d n a 片段，经末端修复并回收后， 再以f o s m i d 质粒作为载体，构建了半滑舌鳎雌鱼基因组文库。该文库含有 4 9 ，9 2 0 个克隆，重组率为9 6 8 8 ；插入片段长度分布在3 3 4 5 k b 之间，平均为 3 9 2 k b ，覆盖率为雌性半滑舌鳎基因组的3 2 3 倍，从文库中筛选得到单拷贝d n a 序列的概率为9 5 6 ；对培养第一天和第六天的文库克隆进行比较检测结果表 明，文库稳定性高，培养过程中没有发生变化。半滑舌鳎f o s m i d 基因组文库的 构建，为该物种基因组的研究工作奠定了基础，为开展测序、分子标记发掘、功 能基因筛选与定位、物理图谱构建等研究工作提供了有效的工具。 2 、半滑舌鳎雌鱼f o s m i d 末端序列分析 本研究从半滑舌鳎雌鱼f o s m i d 文库中随机选取1 ，1 5 2 个克隆进行双末端 测序，去除了大肠杆菌和载体的污染后获得2 ，2 4 7 条序列。序列总长l ，9 2 1 ，3 4 1 b p ，大约占半滑舌鳎雌鱼基因组的3 1 7 ，a + t 含量为5 7 9 ，g + c 含量为 4 2 1 d 对这些序列进行b l a s t 比对，结果表明在2 ，2 4 7 条序列中，有8 4 8 条 序列与数据库现有的序列有明显的相似性( e 2 0 ，脉冲场电泳 结果显示，片段长度大约为8 0 k b ，且为单一带状分布，但d n a 总量较少；酚氯 仿法抽提的肌肉d n a ，o d 枷o d ： 2 0 ，o d m o o d m o = 1 9 - 2 1 ，d n a 总量大，在整个 泳道呈现较亮的弥散分布，片段长度较长，大部分片段长度为在大约3 8 7 0k b ； 试剂盒法抽提的肌肉d n a ，o d 咖0 d 。 2 0 ，0 d 咖o d 啪= 1 7 - 2 0 ，总量较小，片段 也为弥散分布，但d n a 片段较短，大部分片段长度在大约8 - 2 5 k b ( 图2 1 ) 。 半滑舌鳎( c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) 雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建及初步分析 4 , 8 k b 3 0 k i t - 图2 - 1 脉冲场电泳检测酚氯仿法抽提的血液d n a ( a ) ，酚氯仿法抽提的肌肉 d n a ( b ) 和试剂盒法抽提的肌肉d n a ( c ) 的分子量大小。m ：l a m b d am i xm a r k e r ( f e r m e n t a s ) 2 2 末端修复与回收 取酚氯仿法提取的肌肉d n a ( 1 0ug ) ，经末端修复之后进行低溶点胶脉冲场 电泳，切取 3 6 k b 的胶段用1 3 - a g a r a s e 和g e l a s e 两种琼脂糖酶进行回收，结果 表明，用试剂盒中g e l a s e 删回收的d n a ，其o d 。o d 。 2 0 ，o d 。o d 。为1 8 2 0 ， 脉冲场电泳检测显示，片段长度大约为3 0 6 0 k b ( 图2 - 2 ) 。而使用1 3 一a g a r a s e 回收的d n a ，o d ：。o d ： 2 0 ，o d ：o d ：。为1 8 - 2 0 ，片段长度大部分集中在 l o k b 一4 0 k b ( 图2 2 ) 。这一结果说明，用g e l a s e 删回收的d n a 更适合f o s m i d 文 库构建。 1 2 半滑舌鳎( c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) 雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建及初步分析 4 8 k b - 3 0 k l y - 2 0 k b - - 1 0 k b 图2 2 脉冲场电泳检测回收的d n a 分子量大小 a ：g e l a s e l 回收结果 b ：b a g a r a s e 回收结果 2 3 连接、包装与转染 经连接包装转染后，共得到了约5 0 ，0 0 0 个单克隆菌落。 2 4 克隆的挑取与保存 采用g e l a s en 回收的d n a ( 1 0 p g ) 构建了半滑舌鳎雌性的基因组f o s m i d 文 库，共得到了约5 0 ，0 0 0 个单克隆菌落。从中挑取了4 9 ，9 2 0 个克隆，保存两份， 每一份保存于5 2 0 张9 6 孔微孔板中，两份分别置于- 2 0 和一8 0 冰箱贮藏。 3 诃1 忿 f o s m i d 文库构建需要高浓度、高纯度、大片段的d n a 。为确保d n a 有较好 的完整性，除了提取过程应尽量温和，避免剧烈的涡旋、振荡、离心等机械力使 d n a 产生断裂外，适当的提取方法是确保d n a 质和量的重要因素。本实验采用了 半滑舌鳎肌肉和血液两种组织，采用两种方法提取d n a 并进行了比较，结果显示 了极大的差异。酚氯仿法抽提的血液d n a 纯度较好，分子量大而且大小较一致， 经适当的机械打断后即可达到片段长度要求，但鱼类血液样品中细胞含量较低， 所提取的d n a 量较少，难以满足建库需要；采用试剂盒法提取的d n a 纯度较高， 但片段较小，在构建质粒文库时可能是较好的选择，但不符合f o s m i d 文库构建 要求；酚氯仿法从肌肉组织中抽提的d n a ，浓度大，纯度较高，d n a 完整性较 好，片段长度集中在大约3 8 - 7 0k b 范围，无需机械打断即可满足文库构建对d n a 长度范围的要求，适合构建f o s m i d 文库。 半滑舌鳎( c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) 雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建及初步分析 回收d n a 的纯度与完整性决定了连接与包装效率的高低，要求 o d 狮o d 。 2 0 ，o d 嘲0 d 。在1 8 左右，片断长度在3 0 - 4 5k b 范围，浓度 4 0 0 n g p l 。本文将两种回收结果进行了对比。琼脂糖酶g e l a s e 聊1 3 一a g a r a s e 回收的 d n a 纯度和浓度都可以达到要求，但前者的片断长度较大且集中，后者稍小且分 散。因此前者回收效率稍高。 1 4 半滑舌鳎( c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) 雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建及初步分析 第二节半滑舌鳎雌鱼f o s m id 基因组文库的质量鉴定 o 前言 评价文库质量高低的标准是文库中克隆的数量、文库的覆盖率、插入片段的 大小、空载率及克隆的稳定性等。本研究将针对这些方面对所构建的f o s m i d 文 _ ： 库进行质量评价，以衡量该文库是否适用于后续的基因组研究。 1 材料与方法 1 1 半滑舌鳎雌鱼基因组大小测定 取1 0 只冻存管，每管加入li i l l4 预冷柠檬酸盐一二甲基亚砜缓冲液田1 ( 7 0m m o l l 柠檬酸三钠，2 5 0 咖o l l 蔗糖和5 - - 甲基亚砜，用盐酸将p h 调至 7 6 ) 。取家鸡( g a l l u sd o m e s t i c u s ) 一只，采取其静脉血5m l 分装于此l o 只冻 存管中，混匀后冻存于一8 0 备用。 将冷冻贮存的鱼血细胞在3 7 水浴下解冻后，用2 的柠檬酸三钠清洗， 1 ，0 0 0r p m ( 5 0 0 g ) 离心5 m i n 去上清，重复一遍，然后将样品溶成4 0 0 灿的 细胞悬液，内含约1 1 0 6 个细胞。将家鸡( g a l l u sd o m e s t i c u s ) 的红血细胞以同 样方法处理，作为d n a 含量测定的标准内参( 1 c = 1 2 5p g ， h t t p ：w w w g e n o m e s i z e c o m ) 与待测样本混合测定( 待测样本细胞数：标准样本 细胞数2 ：1 ) ，加入2 0m g 碘化丙啶( p i ) 和1 0 0m gr n a s ea 。细胞悬液置 于3 7 避光染色2 0m i n 后，用流式细胞仪( f a c s v a n t a g e ) 进行基因组测定， 每个样品测定3 次，取平均数。 1 2 插入片段大小的检测 随机挑取9 6 个克隆，分别接种于9 6 管盛有1l n l 含氯霉素的l b 液体培养 基的离心管中，2 0 0r p m 振荡3 7 。c 培养过夜，然后向每管中加入8 0 0 p l 新鲜l b 液体培养基和l 灿1 0 0 0 c o p y c o n t r o li n d u c t i o ns o l u t i o n ，3 7 诱导培养 8 h ，再用碱裂解法提取质粒d n a ，具体操作如下： 培养物1 2 ，0 0 0 r p m ( 1 5 2 9 4 g ) 离心l m i n ，弃上清收集菌体。每管加入1 0 0 p l 溶液i ( 内含5 0 w 蛐o l l 葡萄糖，2 5 n 叮n o l lp h8 0 的t r i s - h c l 和1 0m m o l lp h8 0 的e d t a ) 涡旋，重悬沉淀，再加入2 0 0 肛l 新配制的溶液i i ( 内含0 2 nn a o h 和1 s d s ) 混匀，最后加入1 5 0 弘l 预冷的溶液i i i ( 内含5m o l l 乙酸钾6 0m l ， 冰乙酸1 1 5i n l 和h 。o2 8 5m l ) 混匀。冰上放置5m i n 后，4 1 2 ，0 0 0 r p m 离 心5 m i n ，收集上清转入新的离心管中。每管上清加入5 0 汕n a a c 和9 0 0 p l 预 冷的无水乙醇，颠倒混匀后，- 2 0 度静置2 h ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心l o m i n 得到沉淀。 再经7 0 乙醇洗涤沉淀，最终每管加入2 0 p i t e 回溶。 半滑舌鳎( c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) 雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建及初步分析 碱裂解法提取的质粒d n a 进行n o ti 酶切，反应体系为2 0 灿，内含质粒d n a 3 此， 1 0 n o tib u f f e r2 岫，1 0 0 b s a0 2 汕和n o ti8 u 。3 7 酶切6 h 之后再6 5 处理1 0 m i n 使n o ti 失活。最后进行脉冲场电泳检测插入片段大 小及重组率。电泳参数为a u t oa l o g o r i t h m ，5 - 7 0 k b 。 1 3 克隆的稳定性检测 随机挑取1 4 个克隆分别接种于1 l l l l 含氯霉素的l b 液体培养基中继代培养6 天，分别提取培养第一天( 约2 0 代) 和第六天( 约1 0 0 代) 菌液的质粒d n a ， 经屁冰i 和h i n d m3 7 酶切8 h 之后，脉冲场电泳检测电泳参数为a u t o a l g o r i t h m ，5 - 7 0 k b 。 2 结果与分析 2 1 半滑舌鳎雌鱼基因组大小 流式细胞仪测得的半滑舌鳎雌鱼血细胞吸光值，是家鸡血细胞吸光值的 0 4 9 6 倍( 图2 - 3 ) ，以家鸡血细胞d n a 含量( 1 c = 1 2 5p g ) 作为标准内参，计 算得到半滑舌鳎雌鱼血细胞d n a 含量为i c = 0 6 2 0 0 0 4 4p g ，根据公式1p g = 9 7 8m b h 田得到，半滑舌鳎雌性单倍体基因组大小约为6 0 6 3 6m b 。 细 胞 数 量 蛰 u k o b 羹 荧光强度 f l u o r e s e e n o ei n t e n s i t y ( e h a r u m lt u b e r s ，c n ) 图2 - 3 流式细胞仪检测半滑舌鳎( s e m i l a e v i s ) 所得p i 荧光强度柱状图。a ： 为半滑舌鳎雌性红血细胞，b ：为家鸡( 岔d o m e s t i c u s ) 红血细胞。 2 2 插入片段大小 从构建的文库中，随机挑选9 6 个克隆，经n o ti 酶切后，脉冲场电泳检测 插入子的有无和大小，发现只有质粒带而没有插入片段的克隆3 个，其余克隆均 1 6 半滑舌鳎( c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) 雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建及初步分析 含有插入片段，插入效率为9 6 8 8 。在含有插入片段的克隆中，有8 个( 8 3 3 ) 克隆酶切后电泳图中出现两条3 0 k b 以下的片段，说明这些克隆的插入片段含有 一个n o ti 的酶切位点，每个泳道两条带的长度之和约为3 5 4 0 k b 。另外8 5 克 隆酶切后只有一个插入片段，插入片段集中在3 3 - 4 5 k b 之间，平均为3 9 2 k b 。 图2 4 为部分克隆经酶切后电泳检测结果。 由于文库共含有4 9 ，9 2 0 个克隆，而平均插入片段长度为3 9 2 k b ，因此，根 据半滑舌鳎雌性基因组大小1 c = 6 0 6 3 6m b 计算，本次构建的f o s m i d 文库的覆 盖率约为为3 2 3 倍。根据c l a r k e c a r b o n 公式n = i n ( 卜p ) 1 n ( 卜f ) ( 其 中n 为实际克隆数，p 为筛选到某一克隆的几率，f 为某一单个克隆在整个基因组 中所占的相对比例) 可以确定从本文库中筛选得到单拷贝d n a 序列的概率为 9 5 6 。 m1234567891 0】2】3】4 ，t 8 k b 3 8 k b 3 3 k b - 3 0 乏b - 图2 4 随机挑取的部分f o s m i d 克隆经n o t l 酶切电泳检测结果 泳道1 该克隆没有插入片段 泳道1 0 该克隆酶切后有两条3 0 k b 以下的片段 m - l a m b d am i xm a r k e r ( f e r m e n t a s ) 2 3 克隆的稳定性 对1 4 个克隆培养第一天和第六天的质粒用屁冰i 和所删i 两种酶分别进 行酶切，结果显示，所有克隆第六天培养物的酶切图谱与第一天培养物的无任何 差异( 图2 5 ) ，也没有发现插入片段的丢失或重排，说明所构建的f o s m i d 文库 是稳定的。 半滑舌鳎( c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ) 雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建及初步分析 2 3 k b 9 4 k b 6 5 k b 4 3 k b 2 1 k b - 7 4 k b 5 k b 4 8 k b m 1a 1a 6b 1b 6c 1c 6d 1d 6e 1e 6f 1f 6g 4g 6 m 2h 1h 61 11 6j 1j 6k 1k 6l 1l 6m 1m 6n 1 n 6 图2 5f o s m i d 克隆的稳定性检测a ：历力d i 酶切，b ：屁d ri 酶切a - n 分 别代表1 4 个不同的克隆；1 和6 分别为第一天和第六天的克隆；m 1 ：入d n a h i n d h i ；m 2 ：入d n a e b d ri 。 3 讨论 3 1f o s m id 文库构建及其意义 半滑舌鳎是我国名贵的海水养殖鱼类，近年来，其养殖业发展迅速，有关生 物学、养殖技术、优良品种培育等问题得到大量研究，但有关半滑舌鳎的分子遗 传学及遗传育种研究刚刚起步，整体上，其基因组学研究仍较落后。半滑舌鳎为 雌性异配型性别决定h 引，因此，雌鱼的z w 型基因组可以覆盖整个基因组信息。本 研究从雌性个体中提取了高质量的d n a 样品，成功地构建了半滑舌鳎基因组的 f o s m i d 文库。文库总克隆数约五万个，克隆的平均插入片段长度较长，为3 9 2 k b ， 文库覆盖率为雌性半滑舌鳎基因组的3 2 3 倍，从中筛选得到单拷贝d n a 序列的 概率为9 5 6 ，而且，整个文库在培养过程中表现出高度的稳定性，这些都表明， 构建的文库是一个较高质量的文库。它的构建极大的方便了半滑舌鳎基因组的研 半滑舌鳎( c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i a ) 雌鱼f o m 1 i d 基因组文库的构建及初步分析 究工作，为开展分子标记发掘、功能基因筛选与图位克隆、遗传图谱及物理图谱 构建与整合、大规模的测序、比较基因组分析等研究工作奠定了基础，同时也为 进一步进行半滑舌鳎遗传改良研究提供了有效的遗传分析工具。 3 2 关于构建效率 理论上说，因为载体上携带有氯霉素抗性筛选位点，所以在通常情况下，细 菌克隆需包含载体质粒才能在含氯霉素的培养基上生长。同时，f o s m i d 系统是 由c o s m i d 系统进一步发展而来，载体只有在连接了插入片段后才能进行有效的 包装转染，因而空载体出现的可能性很小。茅云翔等构建的极大节旋藻f o s m i d 文库脚1 的重组效率达到了1 0 0 ，符合理论设计，而本研究中随机选取9 6 个克隆 进行检测，发现有3 个克隆只有空载质粒带而没有插入片段，文库克隆的重组效 率仅为9 6 8 8 9 6 。这一结果与z h a n g 等构建的栉孔扇贝f o s m i d 文库时重组结果 相似嘲。我们推测，该现象出现的原因可能是感受态菌的不纯造成的。感受态污 染有两个来源：一是在制备过程中接触了少量外源具有氯霉素抗性的杂菌，二是 试剂盒提供的菌株在制备感受态的大量繁殖过程中有少量细菌个体自身产生突 变而获得了氯霉素抗性。因此操作时应先将菌种涂布平板，然后挑取单克隆制备 感受态。 1 9 半滑舌鳎( c y n o g l o s 扭z ss e m i l a e v i s ) 雌鱼f o s m i d 基因组文库的构建及初步分析 第三章半滑舌鳎雌鱼f o s m id 基因组文库的序列分析 i 土 u 刖舌 b l a s t 搜索是一种推测所查询序列生物学功能的快速、有效的方法，可推测 不同物种基因的可能功能和同源物鉴定。本研究将借助该生物信息学技术对半滑 舌鳎雌鱼f o s m i d 基因组文库克隆双末端测序结果进行分析，以便更好的了解半 滑舌鳎雌鱼的基因组。 1 材料与方法 1 1f o s m id 克隆测序 从半滑舌鳎雌鱼的f o s m i d 文库中随机挑取1 ，1 5 2 个克隆进行双末端测序。 5 端测序引物为2 0 碱基的t 7 引物：5 一7 r 从t a c g a c t c a c t a t a g g g 一3 ；3 端测 序引物为2 3 碱基的p c c l r p - 2 引物：5 一t a c g c c a a g c t a t t t a g g t 啪卜3 。测序仪 器为a b i3 7 3 0g e n e t i c a n a l y z e r ( a p p l i e db i o s y s t e m ) 。p h r e d 软件进行序列 判读时q ：2 0 。 1 2f o s m i d 末端测序的b l a s t 比对 将去除了大肠杆菌和载体污染后的序列利用n r 和e s t 数据库进行b l a s t n 比对分析，并利用f i r 数据库进行b l a s t x 比对分析，限定条件为e 值咎。一。量毽a?，ls窘是基是窖b n ifs800台曾岛oogl3 u。岭。暑oo墨7舀oim呈。宕(dn量南昌一j。8iu。dbf)薏葛文67一q。_召m口q一-i一君。董o。惠f唷。譬mk 2山n寸ooho笛山卜-l。甘oo【02ik卜中n。口oho篮k卜一。卜no一。d叫n。oh3d山。寸_【。ooho乱厶ni【，oo一芷山nh的oh酌 。d c i 。h h o o h 3d山o_【。oo【 3d乱o。oo h o篮厶卜b。oo【 3d厶。nooo【u山厶一o。oo【u山山o西oo3d山曲ooo3d山。寸西西oo篮乱卜ln西。西oo篮阻卜卜，一。o笛乱卜_，o西oo篮皿卜_。，oo oj琵。墅【00力 磊一爵普o g翟8ui_器pl篙墨 器z拶 嚣求氯霜嗡徽爨g世仪鼎圜醐口!ttis盘删彗h繁黾蓦瓷善v爱忸孵井 n n n 寸o o in n 衄o o 8 价i - o o nq n 叫o o n o寸oo一 卜o。oon n一oon i - o o 卜= 丑o o 9a o o o 寸心o 。o o 心o 曲o o _心寸叫oo【n i - o o h卜o - o o 1 卜寸o o “ 卜6ooi 西一叫oon o 仝- a o o 0 寸h 。田o o “0 - o o 8 s 1 8 h n n 一 崎i 小 n 一芝一 小c dn 寻n 小厶；n o d西 寸a 一 气n 心岭 6 i 寸岭n 峪。一 n 一一 6 d 厶岭 口o o o 试 _ z 心 警奄奄蔑翼奄譬鼍谌lir o 譬t o _ p 8 q 肇鼍u基皇鼍 童董擎警奄茭喜 是萋q肇邕爵 q k ohf_q gu心u atllo叁o禹 q q u u q毒q舢r 遵毪n套q毽莲舢点望q警毽啦繁s望苗ob-是。警q基定螯qt基s譬嘎羹o-ldlgs 警孓u翌基的，!苫 m，：_奄量跫譬肖o萎址k鼍_函g一dl嚣。甚ls喇 警ai&o苍遇 篡0uaa1d鑫lso焉芸。一-to一譬心ft譬la_ao葚io_- o口gj叮qrb焉aatia比弓h专go田oqn翌蕊鹰g基u饕t山翟 89畚b9鲁iidu皇8h dn呈训。智)f量ii!=寸人，崩q auo一口g昌03uojg7iq嚼瞄罡d忒8_8声f譬s卫昌op价h卜1【寸n一色盈罟olo卜。霉0so吕2i：lo黧飞u肇基p遥 ib焉a它磊卫9igoq口。强aj时h一q u高苫o口。凹bnw嗤套是z，u茭誉吝u芒q 8_矗芦口d畸面_qii_8 l ， o 口9 2 v li