医学标书范本之补肾宁心方通过ER非经典途径介导对绝经后骨质疏松的防治作用.doc

申请代码：受理部门：收件日期：受理编号：检查保护国家自然科学基金申 请 书您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：资助类别：1)如果您是 word2000 或以上版本用户，请把 word 宏的安全性设为:中亚类说明：附注说明：(如果您是 word97 用户，继续执行以下步骤)2)关闭本文档，重新打开本文档3)点击申启用宏 按钮，即可开始填写本电话 或打印了依托单位：通讯地址：邮政编码：电子邮件：申报日期：单位电话：2004年2月16日国家自然科学基金委员会方法: word 菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中项目名称：请 者： 文档：国家自然科学基金申请书基本信息 7ieoqru/第 2 页版本 1.018.551申请者信息姓 名王文君性别女出生年月1964 年 7 月民 族汉族学 位硕士职称副教授主要研究领域中西医结合妇科电 子邮件传 人网页工作单位复旦大学 /妇产科医院在研项目批准号依托单位信息名 称复旦大学代 码20043301联 系 人唐郁电子邮件电 站地址合作单位信息单 位 名 称代 码在此录入修改在此录入修改项目基本信息项目名称补肾宁心方通过er非经典途径介导对绝经后骨质疏松的防治作用资助类别面上项目亚 类 说 明自由申请项目附注说明申请代码c03050402:中西医结合临床基础研究c03050311:中医老年病学基地类别预计研究年限2005 年 1 月 2007 年 12 月研究属性应用基础研究摘要项目研究内容和意义简介（限 400 字）：用临床疗效确切的补肾宁心方灌服绝经后骨质疏松小鼠模型，分析外周免疫活性细胞th1/th2 型细胞因子的表达、内分泌(e2、dhea)和骨生化指标的变化，观察药物对骨及子宫内膜芳香化酶活性的影响，比较药物对成骨细胞(ob)生物学功能及子宫内膜作用的差异。体外培养 ob，模拟雌激素衰退，分析 ob 优势表达的雌激素受体（er）亚型，及药物血清对骨吸收抑制因子（opg）和优势 er 亚型（或）的调节作用。根据体内、外研究结果，rnai 技术建立优势 er 亚型沉默表达的成骨细胞及内膜癌细胞系，分析其 perk1/2 的表达及细胞的增殖与凋亡，解析 er 亚型介导的信号途径及其对靶细胞的影响。阐明该复方防治绝经后骨质疏松，而对生殖系统无雌激素样副作用的机理。该研究还将有助于寻找药物归经的物质基础，深化中医药的药物归经理论。关 键 词(用分号分开，最多 5 个)绝经后骨质疏松；补肾宁心方；雌激素受体；rnai；选择性作用国家自然科学基金申请书项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏)说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。第 3 页版本 1.018.551编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1钱来娣1952-4-6女副教授学士复旦大实验设计、实验及总结82俞瑾1935-10-6女教授学士复旦大参与课题设计及监督53王玉东1974-4-17男博士生博士复旦大生物学功能104郝群1973-4-13女博士生博士复旦大分子生物学实验105朱影1956-7-14女技师其他复旦大学021-637701618286免疫学技术56孟毅1975-7-30男技师其他复旦大学021-63770161286动物实验67在此录入修改8在此录入修改9在此录入修改总人数高级中级初级博士后博士生硕士生730202国家自然科学基金申请书经费申请表（金额单位：万元）第 4 页版本 1.018.551科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费19.60001.科研业务费4.5000（1）测试/计算/分析费1.0000动物模型的建立，骨生化指标测定等。（2）能源/动力费1.0000水电煤气、液氮的维持等（3）会议费/差旅费0.5000学术会议、参加学习班等（4）出版物/文献/信息传播费1.0000查新、发表文章、论文编写、成果鉴定等（5）其它1.0000购买相关分子生物学软件等2.实验材料费12.6000（1）原材料/试剂/药品购置费10.2000细胞培养、分子生物学实验、流式/高效液相试剂、激素、细胞因子及其测定试剂盒（2）其它2.4000购买动物、饲喂、手术等，培养瓶/板等一次性物品3.仪器设备费1.0000（1）购置1.0000实验仪器的保养和维护（2）试制0.00004.实验室改装费0.00005.协作费1.5000中药提制、未脱钙骨的冰冻切片二.国际合作与交流费3.00001.项目组成员出国合作交流2.00002.境外专家来华合作交流1.0000三.劳务费1.0000博士后及研究生津贴四.管理费0.5000合 计24.1000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000国家自然科学基金申请书查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1、 项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。【项目的研究意义】绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, pmo)及其所致的骨折是全球性老年人病死率和医疗费升高的主要原因；随着世界人口的老龄化，pmo 将成为前所未有的公共卫生问题（1）们据素问上古天真论“女子七七肾气衰，任脉虚，太冲脉衰少”而组方的补肾宁心方（曾用名更年健/青/春），具有补肾宁心，燮理阴阳的功能。不仅能有效地改善围绝经期妇女的精神和神经（2、3）（4）雌性大鼠脾细胞雌激素受体（er）的表达,从而增强雌激素对免疫细胞的生物效应，改善衰老机体的（5）在成骨细胞（ob）和破骨细胞(oc)维持的骨代谢平衡中，ob 起着非常重要的作用，而目前应用的经典抗骨质疏松药物（降钙素、二磷酸盐、雌激素等），多为抑制 oc 活性的药物，缺乏刺激 ob 活性或既刺激 ob 又抑制 oc 的药物。因此，应该在深入研究和发掘化学合成药物的同时，更应注重天然植物化合物的开发应用（6）一步探讨其对绝经后骨质疏松的疗效机制具有重要的意义。【立项依据及国内外研究现状】近来美国妇女健康协会（wommens health lnitiative,whi）临床研究发现，激素替代治疗（hrt）虽然降低了骨质疏松和骨折的危险性；但增加了乳腺癌、子宫内膜癌以及心血管疾患、中风的发病（7）。总体权衡 hrt 的利弊显示，对妇女健康的风险超过了受益。大量的临床和实验研究证明，以补肾为主的“更年春”复方对更年期综合征具有良好效果，实验证明老年大鼠灌服“更年春”后虽然其血雌激素浓度不增高，但其下丘脑、垂体、卵巢、脾脏雌激素受体（er）含量增加（4，5）（2，3）（8）有研究认为，雌激素替代治疗（ert）既无刺激骨早期合成的效应，也无抑制骨吸收的效应（9）值得注意的是：一些低雌激素（e）水平的妇女并不发生骨质疏松。另外，在 e-er 效应机制中，雌激素受体比雌激素扮演着更为重要的角色。目前认为，er和 er（1996 年新克隆的受体）两种第 5 页版本 1.018.551。我症状，同时对绝经后骨质疏松有良好的防治作用。围绝经期妇女在口服“更年春”后外周血 e2水平无明显变化，th 细胞比例显著增加，il-2 诱生水平明显升高。另外，“更年春”能增强老年免疫功能。在补肾宁心方改善围绝经期症状及对骨质疏松良好疗效的基础上，进率。实验还证实，“更年春”对实验性原发性骨质疏松有防治作用，并初步证实补肾宁心方对 ob 的增殖作用。因而进一步探讨 er 介导补肾宁心方对 pmo 的疗效机制具有重要的现实意义。国家自然科学基金申请书受体亚型具有各自独特的转录激活区域，以及不同的组织分布，可能是靶组织对 e 呈现不同反应的（10）合物estren，可能通过激活 mapk 途径，防治 pmo 而无刺激子宫内膜增生的作用，为实现这一（11）。（12）。该技术具有高度的序列专一性，可使特定基因不表达，比反义rna技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变，目前已经成功地对上百种哺乳动物细胞目的基因进行功能分析，从而成为一种抑制（13）。将药物作用下的优势er亚型选择性地抑制表达，可有效地分析er介导药物作用的机制，国内外迄今未见利用此技术研究中药作用机制的报道。参考文献1. 王玉东，李大金：绝经后骨质疏松症发生的分子机制。 中华老年医学杂志 2003；22（3）：18782. 王文君，俞瑾, 王静：“更年春”对实验性原发性骨质疏松病理形态学的初步作察.上海医科大学学报 2000；27（1）：54-63. 王文君，俞瑾,王静：中药“更年春”对大鼠实验性原发性骨质疏松的预防作用观察.上海中医药杂志 2001;35(11):46-94. 李大金,李超荆,俞瑾等: 中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌免疫功能的调节. 上海免疫学杂志 1995; 15(5):257-605. 王文君,俞谨, 李大金. 中药复方”更年春”对老年雌性大鼠脾细胞 er 及 il-2、tnf 活性的影响.生殖与避孕 1996；16（4）：263-76. 廖二元.骨质疏松研究的现状与展望.中华内分泌代谢杂志 2002；18（2）：87-9.7. martin enserink. the vanishing promises of hormone replacement. science 2002; 297: 325-6.8. 王玉东，李大金. 补肾宁心方对成骨细胞的增殖和抗凋亡作用. 中国中西医结合杂志 2004 (待发表)9. fiore ce, pennisi p, tandurella fg, et al. response of biochemical of bone turnover to estrogentreatment in post-menopausal women: evidence against an early anabolic effect on bone formation. jendocrinol invest 2001; 24(6): 423-9.10. gilles b. tremblay1, andr tremblay1, neal g. copeland, et al. cloning, chromosomal localization,and functional analysis of the murine estrogen receptor . molecular endocrinology 1997; 11 (3):353-65.11. miller g. divorcing estrogens bright and dark sides. science 2002; 298:723-4.12. phillip d. zamore, thomas tuschl, phillip a. sharp. rnai: double-stranded rna directs theatp-dependent cleavage of mrna at 21 to 23 nucleotide intervals. cell 2000; 101:2533.13. morita t, yoshida k. rnai provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes.tanpakushitsu kakusan koso 2002;47(14):1839-45第 6 页版本 1.018.551关键因素。因此，药物对 pmo 的治疗作用与对生殖系统的副作用是可以区分的。最近合成的化理想的疗效初步提供了可以借鉴的方法和途径rnai（rna干扰）技术通过双链rna（dsrna）引发转录后沉默，产生rnai现象体细胞功能基因翻译表达的有效工具国家自然科学基金申请书2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。【建立假设】补肾宁心方能防治 pmo 而少见 ert 样副作用。该方对老年大鼠外周血 e2 水平无明显影响，但可增强 er 的表达，具有促进 ob 增殖和抗凋亡作用。因此，该方通过哪种 er 亚型、介导何种信号转导途径发挥选择性作用，是本题亟待解决的问题。【研究目标】（1） 观察补肾宁心方对免疫内分泌、骨生化指标和芳香化酶活性的影响；比较该方对骨与子宫作用的差异。（2） 体外培养 ob，分析正常及药物血清作用下优势表达的 er 亚型。（3） 建立优势 er 亚型沉默表达的人 ob 细胞系（mg63）和人子宫内膜癌细胞系（hec1-b），结合抗 er 亚型与抗 ar（雄激素受体）单抗对信号传导途径的阻断作用，确定在骨及子宫内膜中发挥重要作用的 er 亚型及其信号转导途径。【研究内容】（1） 补肾宁心复方灌服 pmo 模型 balb/c 小鼠 12 周，处死后取椎骨测定 bmd、形态计量、原位分析 ob 凋亡，称量子宫湿重；制备药物血清，测定 e2、脱氢表雄酮(dhea)；取脾脏免疫活性细胞分析 th1/th2 型细胞因子的表达水平；取颅骨植块法培养，观察骨片融合时间、ob 增殖能力的变化。（2） 透射电镜下观察左股骨的胶原纤维排列，ob 形态及其细胞器的变化。取右股骨松质端和子宫内膜制备微粒体，分析芳香化酶活性。取胫骨，提取总 rna，分析骨吸收抑制因子（opg）和优势表达的 er 亚型。（3） 取新生 balb/c 小鼠颅骨酶解法培养 ob，体外模拟雌激素撤退现象，予以药物血清局部干预，观察优势表达的 er 亚型及 ob 增殖能力的改变。（4） 扫描优势 er 亚型编码区基因中的 aa 序列，据其 mrna 低二级结构的区域设计 sirna，用 t7体外转录 sirna，纯化并转染 hmg63 和 hec1-b 细胞系，建立优势 er 亚型沉默表达的细胞系，分析该亚型缺失（或低表达）对 perk1/2（mapk 途径中磷酸化的细胞外信号调控激酶）的影响。【拟解决的关键问题】（1） 分析 ob 优势表达的 er 亚型及其胞内信号转导途径，阐明中药复方治疗 pmo 的作用机制。（2） 通过比较补肾宁心方对不同组织的选择性作用，使有效治疗 pmo 而避免 hrt 样副作用成为可能，从而深化中医药的药物归经理论。第 7 页版本 1.018.551国家自然科学基金申请书3、 拟采取的研究方案及可行性分析。【研究方法】（1） 酶解与植块法培养原代 ob，碱性磷酸酶（alp）显色鉴定。（2） elisa 分析小鼠免疫活性细胞表达的 th1/th2 型细胞因子水平。3（4） hplc（高效液相色谱）比较骨和子宫内膜中芳香化酶（aromatase）活性。（5） 免疫化学发光法测定内分泌激素水平，dexa 测量 bmd,骨和子宫内膜的组织切片形态计量。（6） 实时定量 rt-pcr 比较 er 亚型，opg mrna 的表达；immunoblotting 分析 perk1/2 表达。（7） 透射电镜（tem）观察体外及骨组织中 ob 形态及其细胞器的变化。（8） tunel 法原位分析骨组织中 ob 的凋亡；pcna 免疫荧光组织分析 ob 细胞增殖潜能。（9） rnai 技术建立优势 er 亚型沉默表达的 hmg63 和 hec1-b 细胞系用于解析细胞内信号转导途径。【技术路线】（1） 补肾宁心方对骨和子宫的选择性作用及对 ob 生物学功能的影响雌性 balb/c 小鼠（12-13 月龄）正常对照 假手术对照去势手术（7 天后） 生理盐水（等体积） 生理盐水/e2/补肾宁心方取血制备药物血清，测定内分泌脾脏免疫活性细胞细胞因子表达水平子宫称量湿重，内膜组化分析腺体改变，制备微粒体股骨电镜观察 ob 细胞器变化，制备微粒体胫骨提取 rna，rt-pcr 分析 er 亚型表达椎骨测 bmd，骨形态计量，原位分析细胞凋亡，及 pcna 分析细胞增殖潜能颅骨3第 8 页版本 1.018.551（3） 流式细胞术（fcm）分析 dna 周期和细胞凋亡， h 掺入法分析 ob 增殖能力。植块法培养，观察骨片融合时间；传 1 代， h 掺入法分析细胞增殖，fcm 分析 dna 周期国家自然科学基金申请书（2） 药物血清对 ob 优势 er 亚型的调节ob 原代培养（酶消化法）、鉴定确定细胞密度，模仿雌激素撤退现象加入不同浓度的药物血清电镜观察 ob 细胞器变化；fcm 分析 dna 细胞周期和细胞调亡实时定量 rt-pcr 分析 er/、aromatase 的 mrna 变化，（3）介导 ob 及内膜癌细胞增殖的优势 er 亚型及其胞内信号转导途径建立优势 er 亚型沉默表达的 hmg63 和 hec1-b 细胞系加入不同浓度的药物血清或生理浓度的 e2/dhea检测两种细胞的 dna 周期和调亡；分析 perk1/2 的表达确定两种细胞优势表达的 er 亚型及其介导的信号途径对细胞增殖的影响【实验方案】（1） 绝经后骨质疏松症中医辨证：绝经前后妇女年近五旬，肾中精气渐衰。肾精不足则骨无以充，故骨骼酸楚疼痛；甚者，骨枯而髓减，发为骨痿，并可见骨折。精血不足，肾水不能上济心火，则心火上炎。肾虚则气化不及，气血失调而产生痰瘀，痰瘀又可进一步加重肾虚，从而促进骨质疏松的产生。治则：补肾壮骨，宁心泻火。处方：生地 18知母 15 补骨脂 12 仙灵脾 12 巴戟天 12枸杞子 12酸枣仁 9 黄柏 9方解：生地、知母滋补肾阴，为君药。仙灵脾、巴戟天温补肾阳，补骨脂补肾活血，为臣药，共助君药补肾益精，使得阴阳平衡。枸杞子滋肝以补肾，酸枣仁宁心安神，为佐药。黄柏泻相火，以使水火相济；并能引诸药入肾经。全方以补肾为主，有坚肾壮骨髓之功。第 9 页版本 1.018.551国家自然科学基金申请书（2） pmo 模型的建立与实验分组12-13 月龄雌性 balb/c 小鼠氯胺酮麻醉（100mg/kg），经背部入腹切除双侧卵巢术后 7 天，分组（每组 10 只）并灌服等体积（1ml/天）液体ovx+（补肾宁心方/e2/生理盐水）组/ 假手术组/ 正常组灌药 6 周后，从 ovx+盐水组、正常组、假手术组各随机取 2 只小鼠的股骨和腰椎进行病理切片观察，确定 pmo 模型的建立，排除手术的影响。液体灌胃 12 周，处死后分别取血、脾脏、子宫和骨（3） 补肾宁心方对骨和子宫内膜芳香化酶活性的调节补肾宁心方组/ e2 组/ 盐水组分别取子宫内膜和股骨干骺端，匀浆，制备微粒体（离心：1000g20min10000g20min105000g120min）构建反应体系 1ml：50-100m pbs;0.2-2mg/ml 微粒体总蛋白底物：dhea加入 1mm nadph（开始计时），37，约 10-15min；70%高氯酸75-100l 终止反应，迅速涡旋混匀，冰浴冷却。高速离心 20000g 20min，4c18 反相 hplc 分析（粒径 5m,4.6mm i.d. 25 ），流动相为乙腈/水（40：60，v/v）1ml/min，柱温 40，进样量 5-20l, 紫外检测波长 254nm分析产物生成速率，比较芳香化酶的活性第 10 页版本 1.018.551国家自然科学基金申请书（4） 补肾宁心方对 ob 增殖和凋亡的影响补肾宁心方组 e2 组 盐水组6nbt/bcip 鉴定 ob（纯度 90%）3 培养 1、5 天弃培养液，pbs 洗涤piannexv 3h 掺 入 法 测 细 胞 增 殖 上 样 facscalibur （ 488nm, 15mw 氩 离 子 激 光 源 ）modfit lt 分析增殖和凋亡（5）药物血清 ob 增殖及其优势 er 亚型的调节从新生 3-5 天 balb/c 小鼠的头盖骨分离 ob（酶解法）-6培养 5 天传 1 代（原瓶），mem（10%fbs）培养 7 天传 2 代（96 孔培养板）加入空白血清、（5-40%）药物血清第 1、3、5 天测 od570 值；fcm 分析细胞 dna 周期第 11 页版本 1.018.551植块法（1 1 ）培养,骨片融合（时间）后，胰蛋白酶消化调成 110 细胞悬液接种于 96 孔培养板（510 /well） 重悬于 pbs 中mem 培养液配成 10 m 的 17-e2（模仿雌激素衰退）国家自然科学基金申请书（6）构建优势 er 亚型沉默表达的细胞系从aug起始，扫描优势er基因中的aa序列，记录每个aa 3端19个核苷酸作为潜在sirna靶位点，通过blast分析，去除与其它基因明显同源的靶位点，选择gc含量40-50%的sirna aan19合成3-5对aan19-cctgtctc 序列（29-nt 寡核苷酸）：正义 sirna 模板 5-aa n19 -cctgtctc-3反义sirna模板 5-aa n19-cctgtctc-3退火klenowdna聚合酶t7 rna聚合酶分别体外合成正、反义链rna，经杂交、rna酶切纯化体外转录的 sirna（玻璃纤维吸附柱），用 silencer sirna transfection kit 转染（用 50 代以下的靶细胞；避免使用抗生素和 rna 酶污染）mg63 细胞hec1-b 细胞（24 孔板） 阴性对照 sirna阳性对照 sirna荧光标记 sirnawestern blot检测抑制效果第 12 页版本 1.018.551国家自然科学基金申请书（7）er 亚型（er/）对两种细胞增殖和关键分子表达的影响优势 er 亚型沉默表达（抑制率 80%）的 hmg63 和 hec1-b加入抗 ar 和/或相应 er 亚型的单抗 15min-6培养 6 小时3 分析和比较 perk1/2 的表达，细胞增殖的变化，明确起重要作用的 er 亚型及其介导的信号转导途径对 ob 增殖的影响【可行性分析】（1）补肾宁心方临床疗效确凿，我们已经初步证实其对 er、骨代谢和 ob 增殖具有调节作用。（2）已有研究证实 er 存在两条传导途径，er和 er作用相反，而且在不同组织呈现不同分布。（3） ai 技术迅速发展，已经成为探究基因功能和细胞内信号转导的有效工具。本实验室已经开展这一新兴技术的研究。4、 本项目的特色与创新之处。（1）首次探讨中药对 ob 优势 er 亚型的调节及其对靶组织效应的选择性作用。（2）首次应用 rnai 技术分析 er 亚型在 pmo 中的重要作用及其胞内信号转导机制。以上研究设计在国际学术期刊、生殖内分泌和老年医学会议上均未见报道。5、 年度研究计划及预期研究结果。2005.12005.5建立 balb/c 小鼠 pmo 模型，分组用药。同时建立成熟的 ob 原代培养方法（酶解法和植块法）。2005.62006.2完成体内实验部分，比较中药对骨与子宫作用的差异；制备药物血清，进行体外干预 ob 增殖的实验，分析 ob 优势表达的 er 亚型及药物血清对 er 亚型的调节。建立并完善 rnai 技术使优势er 沉默表达的条件。2006.32007.5建立优势 er 亚型沉默表达的 mg63 和 hec1-b 细胞系，确定 er 亚型在两种细胞介导的信号转导途径及其对靶细胞增殖的作用。2007.62007.12总结资料，成果鉴定。发表相关论文。（二）研究基础与工作条件第 13 页版本 1.018.551不同浓度的药物血清或 10 m 的 17-e2分析两种细胞 dna 周期和凋亡（fcm/ h 测定） immunoblotting国家自然科学基金申请书1、工作基础本研究室在国家中医药管理局和中科院生化所分子生物学国家重点实验室课题资助下，曾对补肾宁心方（曾用名“更年青”春/健）做过多方面的研究，从临床-实验-再临床验证了更年青复方对更年期综合征妇女和老年大鼠的效应，并非是提高血雌激素水平，而是提高体内雌激素受体的表达而发挥作用，从而改善了临床症状、内分泌状态和免疫功能。最近，我们进一步证实了该复方治疗 pmo 的临床疗效，为下一步明确在 pmo 中起重要作用的 er 亚型，补肾宁心方治疗 pmo 的作用机制及其对靶组织疗效的选择性奠定了坚实的基础。迄今获得的相关学术奖励如下：课题“中药更年春治疗更年期综合征的临床和实验研究”获上海市科委科技进步奖二等奖；中医药管理局科技进步奖三等奖。已发表的相关论文1 王文君，俞瑾，王静，等. 中药补肾“更年春”对实验性原发性骨质疏松的预防作用观察。中华中西医结合杂志 2002；2（8）：8-102 王文君，俞瑾，周光兴，等. 中药“更年春”对实验性原发性骨质疏松的预防作用观察。 上海中医药杂志 2001；35（11）：46-493 王文君，俞瑾，周光兴，等. “更年春”对实验性原发性骨质疏松病理形态学的初步作用观察。 上海医科大学学报 2000；27（1）：54-64 王文君，俞瑾，李大金，等：雌性大鼠老化过程中脾细胞雌激素受体含量及白细胞介素-2、肿瘤坏死因子活性。中华内分泌代谢杂志 1999；