细胞计数及铺板.doc

用于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板实验步骤1、准备工作用75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlpbs液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿，上下左右铺匀，37消化30分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全. 4、加入4ml的含5%血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.5、弃上清。用pbs 3ml 洗细胞，吹打或涡旋混匀，洗2次，离心1000rpm,3min.弃上清。6、配细胞稀释液（bsa 终浓度为0.1%）.每种细胞需3ml稀释液,共6个样品，所以配20ml稀释液(无血培20ml+10%bsa 200ul.)7、细胞沉淀中加3ml细胞稀释液，吹打混匀，即得稀释过的细胞悬液。8、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品计数2次，算均值。（8个大格总数/8=数值*104）9、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补。普通的细胞计数及铺板(免疫荧光，wb等不需定量)实验步骤1、准备工作用75% 的酒精擦拭双手，同时用酒精棉球擦拭超净台。2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlpbs液清洗一遍，四个方向晃动倒掉。3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿内,拍皿，上下左右铺匀，37消化30分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全. 4、加入4ml的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.若细胞较多，则需稀释。5、取上述1ml细胞悬液，在加1ml含血清的新鲜培养基，混匀。6、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品对角线计数2次，算均值。7、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用含血清的新鲜培养基补。注意：1.不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形，不规则，失去原有的特点。2.是否污染：传代或换液24-48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞 。3.皿用20天左右，可更换。4.分清无血培、血培的用途。2012-09-03实作如下:一、常规收集细胞、消化、洗涤后，加3ml细胞稀释液，悬匀后计数。细胞株 计数 shluc 114*104 /ml 10*105个/114*104 =0.877 ml=877ul she 138*104/ml 725ul 如此类推 shf 140*104/mlp 112*104/ml b 178*104/ml将细胞密度调整为5*105个/ml,每个样品总体积为2ml.则所需细胞数为2*5*105=10*105个。稀释过的细胞悬液体积补加细胞稀释液体积87711237251275714128689311075621438从以上调整过密度的细胞悬液中取适量进行transwell 及srb实验。二、transwell检测肿瘤细胞迁移实验1.在板孔（下室）中加入600 ul/well含有10%血清培养基作为引诱剂，小室底部接触培养基。2.轻轻的在细胞小室的上层加入140ul /well细胞悬液(若细胞密度为5 x 105cell/ml，则上室中共加入5 x 105cell/ml x140ul=7 x 104cell)。37 c孵育24小时（孵育时间根据实验调整，12-36小时）3.孵育结束，小心取出细胞小室，用棉签轻轻擦去上室液体。移到预先加入800 ul /well 4%多聚甲醛或70%甲醇的下室中，室温固定30分钟。4.小心取出细胞小室，用吸干上室固定液。（可4保存，隔日再做。）800 ul/ wellpbs加入下室洗3次。室温晾干。5. 800 ul/ well 0. 1%结晶紫染色30min。6.迅速将小室浸没到ddh2o浸泡数次，去除多余的染料。吸去上室多余液体完全干燥小室。7.显微镜下观察结果，随机选取3个不同的视野拍照。8.三、srb1.取24孔板