透明质酸的发酵生产工艺.doc

食品与制药工程学院课程论文透明质酸的发酵生产工艺专业：生物制药 姓名：邓海艳 课程名称：发酵工程摘 要：透明质酸广泛分布于各种动物组织中，由于动物组织原料有限，且透明质酸的含量低，同时提取成本高，因而价格十分昂贵。而微生物发酵法，所需的原料易得，大大降低了生产成本。同时由于透明质酸存在于菌体英膜上，易于与菌体分离，因而减少了提取成本。本篇文章就是以一株兽疫链球菌作为生产菌株进行研究重点讨论了温度、pH值、搅拌转速，发酵时间以及培养方式等发酵条件对透明质酸产量和分子质量的影响。关键词：透明质酸；产量；影响因素；发酵条件透明质酸（hyaluronic acid，简称HA）又名玻璃酸，是一种高分子量的酸性黏多糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中。HA分子中的羧基和极性基团可与水形成氢键而结合大量的水，可以吸收与保持自身体重千倍以上的水分，是国际上公认的最好的保湿剂，还具有润滑，促进关节愈合等作用1。不同分子质量的HA有不同的用途，低分子质量的HA通常用作食品原料，中等分子质量的HA主要应用于化妆品，而高分子量的HA在医学上有较高的应用价值。1.透明质酸的微生物发酵法从上个世纪30年代开始，人们便开始进行微生物发酵法生产HA的研究。微生物发酵法生产HA较动物组织提取法有许多的优点，比如生产成本低廉，规模不受原料限制，因为发酵液HA以游离状态存在所以易于HA的分离纯化。能够产生HA的链球菌有A群和C群两类，其中A群主要有化脓链球菌, 一般不用作生产菌种，因为其致病性较高；C群有兽疫链球菌、马疫链球菌、类马链球菌等均属于非人体致病菌，所以可以用作HA的生产菌种罗瑞明等从患肺炎的羊肺液中分离出兽疫链球菌菌株，通过培养基优化得到的HA产量为1.88 g/L。冯建成等以Streptococcus equiSHO为出发菌株，通过物理和化学诱变选育到1株遗传稳定、无溶血性且透明质酸酶缺陷型菌株SH0201，通过摇瓶发酵试验得到相对分子量2.06xl06 Da的HA。李自刚等从奶牛鼻黏膜内分离到1株兽疫链球菌，经过紫外线诱变和亚硝基胍诱变处理后HA产量能达到6.94 g/L2。通过微生物发酵法生产HA的品质和产量主要受到以下几个方面的影响: 首先是菌种选择；其次是培养基的优化和发酵条件的优化；最后是生物工艺的下游技术即HA的提取工艺。国内外诸多学者研究了微生物发酵法生产HA的工艺。国内，凌沛学等首先开始对HA的发酵生产的工艺进行研究，分别进行了实验室小试和生产车间中试的研究；陈永浩等利用射线和紫外线结合方法和通过辐照进行诱变育种，得到了没有溶血性的菌株，使得HA产量及相对分子质量得到了进一步的提高；杨利等对透明质酸分子量的影响因素进行了探索，得到溶氧水平和搅拌转速与HA分子量的关系；付莉等从自然界蹄选到一株透明质酸的产生菌；叶华等对于透明质酸发酵流加过程进行了研究；史鹏等，对发酵法生产透明质酸提取工艺方法进行了研究；郝宁等对HA的生产菌进行了基因改造，基因重组菌的HA产量得到很大程度的提高。HA的发酵生产主要工艺流程如下:斜面种子一摇瓶种子一接种一发酵培养一补料一放罐一发酵液（加乙醇粗提）一粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）过滤（去除杂质）一滤液（乙醇沉淀）一沉淀物（脱水干燥）一成品透明质酸2.发酵培养基成分和发酵条件对HA的影响2.1不同碳源对发酵的影响当碳源为2.0%，酵母膏1.0%，蛋白胨1.0%，KH2PO4 0.2%，NaCl 0.2%，MgSO47H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%；37，100 rpm培养18 h。以葡萄糖为碳源时，透明质酸的产量最高，其后依次是蔗糖、麦芽糖和果糖。而木糖和半乳糖利用情况不好，以它们为碳源时透明质酸产量只有0.4 g/L和0.42 g/L。其原因可能是UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄合成透明质酸的前体物质，也是合成菌体的前体物质，菌体可以容易地分解蔗糖和麦芽糖得到葡萄糖，果糖也很容易转化为葡萄糖，所以它们能被比较好的利用，而其他两种碳源的利用情况则相对差些。因此本实验采用葡萄糖为碳源。2.2不同氮源对发酵的影响当氮源为2.0%，葡萄糖2.0%，KH2PO40.2%，NaCl 0.2%，MgSO47H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%，37，100 rpm培养18 h。氮源不仅为菌体生长提供氮元素，而且大多数有机氮源还能提供多种必需的生长因子。当发酵培养基的氮源采用酵母膏时，透明质酸的产量最高。其次是酵母膏和蛋白胨的混合氮源，其余的均较底。而采用无机氮源（NH4）2SO4时，透明质酸含量和菌体量都是最低的。兽疫链球菌的营养要求比较高，TCA循环不完全，有多种氨基酸不能自身合成，而且不能完全由自身合成核昔酸。而酵母膏中含有大量的菌体生长所需的生长因子，这可能是兽疫链球菌H-35以酵母膏为氮源时生长和发酵较好的原因之一。2.3酵母膏用量对发酵的影响当氮源为酵母膏，葡萄糖2.0%，KH2PO40.2%，NaCl 0.2%，MgSO47H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%，37，100 rpm培养18 h。低酵母膏用量时，细胞产出的透明质酸含量较低，细胞量也较低，逐步提高酵母膏的含量，透明质酸含量和细胞量均有大幅提高。当加入量为2%时，透明质酸含量达到最大值。所以本研究中选用酵母膏为氮源，用量为2.0%。2.4不同温度对发酵产物的影响发酵过程中，温度是一个关键的因素，对菌体生长、代谢速度有很大的影响。当温度为35时，HA产量最高，达到1.07g/L；当温度高于35，透明质酸的产量却随温度的升高而呈下降的趋势。但在实验温度范围内菌体生长却随温度的升高菌体量增多，表明高温有利于菌体的生长，碳源更多的转化为菌体。所以本实验发酵温度为35。2.5搅拌转速对HA产量和分子质量的影响搅拌转速是影响发酵液溶解氧浓度的关键因素之一。HA是HA产生菌荚膜的主要组成成分，搅拌可以强化气-液间氧的传递，既维持发酵液中有足够的溶氧，为细胞的生长提供氧气，又可使发酵液中的各营养基质混合均匀，有利于细胞的吸收和利用，同时可以加速荚膜从细胞表面脱离。高海军报道，只有在高搅拌转速时发酵体系才处于全部混合状态，在较高的搅拌速率650 r/min下发酵时可以得到较高的HA产量，为411 g/L，产率系数为0.083。这是因为HA溶液是假塑性物体，具有剪切变稀的特性，高速搅拌时，发酵液传质，传氧性能得到改善，有利于菌体生产和产物合成，同时，较高速的搅拌能使荚膜更快地脱落，解除其对细胞吸收营养物质的阻碍。Hasegawa，却认为，HA的产量在一定搅拌速度内会随着搅拌速率的增加而增加，并且随着换气速率的加快，HA的产量也会增加，然而过高的搅拌速率会破坏细胞而导致HA产量下降，这是因为过高速的搅拌会产生很大的剪切作用，对所培养的菌体细胞造成伤害，使得受损细胞合成HA的能力大大下降了。而成霞则认为在发酵前期采用较低的搅拌转速（200 r/min），使菌体细胞能快速生长，发酵开始10 h后适当提高搅拌转速（350 r/min），一方面可通过降低菌体的生长速率来降低乳酸的积累量；另一方面由于此时发酵液很黏稠，提高搅拌转速可以促进混合，有利于HA发酵的进行。David将搅拌速度从3001000 r/min进行变化，HA的分子质量基本没有改变4。2.6不同装量对发酵产物的影响随着装量增大，菌体生长较好，但透明质酸的产量在8%的装量时出现高峰。说明了装量越大，溶氧越低，不利于透明质酸的合成。因此发酵中发酵液的装量采用8%。2.7发酵条件的优化根据文献选择对兽疫链球菌生长及产透明质酸影响较大的四个因素（初始葡萄糖浓度、MgSO47H2O的浓度、初始pH和摇床转数）来设计正交试验表。其它相同的条件为：酵母膏2.0%, KH2PO4 0.2%，NaCl 0.2%，装量为8%，培养18 h。通过极差分析，影响因素大小依次是：pH摇床转速 MgSO4；含量初始葡萄糖。最优组合是pH7.0，摇床转速200 rPm，MgSO4含量0.06%，初始葡萄糖浓度4.0%。在初始葡萄糖浓度4.0%，酵母膏2.0%，NaCl0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO47H2O 0.06%，初始pH7.0，装量为8%，35，200 rpm培养18 h。实验的结果是透明质酸产量为1.43 g/L，比优化前提高了28.8%。pH是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产物的积累有很大的影响，发酵液的pH可以影响微生物细胞原生质的电荷，引起各种酶活力的改变，影响菌体对基质的利用速度和细胞的结果，以致影响菌体的生长和产物的合成5。从实验数据可知，pH7.0时对发酵有利，过低和过高都不利于发酵产物的积累。摇床转速表明，转数越高，越有利于透明质酸的合成和分泌。原因是高转数，发酵液传质、传氧性能得到改善，有利于菌体的生长和产物合成。由于荚膜会阻止营养物进入细胞，从而影响细胞的生长代谢和透明质酸的合成以及分泌。较高的转数能使荚膜更快的脱落，解除荚膜对细胞吸收营养物质的阻碍。透明质酸合成酶是透明质酸合成途径中的关键酶,该酶位于原生质体膜上。它催化透明质酸的前体UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转化成H，此酶的活性受Mg2+离子浓度的影响很大6。当MgSO47H2O为0.06%时透明质酸合成酶活性最高。因此兽疫链球菌H-35最佳发酵条件是初始葡萄糖浓度4.0%，酵母膏2.0%，NaCl 0.2%， KH2PO4 0.2%，MgSO47H2O 0.06%,初始pH7.0，35,装量为8%,200 rpm培养18 h。3.透明质酸的纯化参照应国清分离纯化玻璃酸的研究，采用阴离子交换树脂DEAE-纤维素对透明质酸粗品进行洗脱。以去离子水为淋洗液，0.6 mol/LNaCl溶液作为洗脱液，分别测定流出液中透明质酸的O.D530值和蛋白质的O.D280值。从中可看出，0.6 mol/LNaCl溶液作为洗脱剂时，透明质酸出峰时间早，峰形陡峭，峰值较高，拖尾较小，并且含蛋白质的量很低。通过考马斯亮蓝染料结合法测得粗品和纯品的蛋白质含量分别为2.84%和0.38%，说明经过DEAE-纤维素纯化以后，透明质酸得到很好的分离。结 论虽然目前国内对微生物发酵法生产HA的研究逐渐增多，但是大部分还只是在实验室进行研究，对于将其投入工业化生产的技术还不够成熟。尽管相对于动物提取法，产量有了很大提高，但是由于HA的需求增长非常快，产量仍是一个需要突破的瓶颈。因此，发酵工艺条件作为影响HA产量的一个重要因素，特别是从工业化的角度上考虑时，仍需进一步的研究和探索。今后，应在以下几方面展开进一步的研究：一是选育透明质酸酶缺陷型菌株，并根据HA的合成和代谢途径，进行发酵条件的优化，并通过建立动力学模型对生产进行评估；二是目前对发酵法生产HA的研究多集中于分批发酵，而分批发酵的转化率低，有底物抑制，葡萄糖效应，代谢阻碍等问题，不适合投入工业化的生产，应在补料分批发酵或连续发酵方面进行深入的研究。参考文献1郭学平，透明质酸在保健品中的应用 J，中国生化药物杂志，2002，23（1）：49-512周荣清，透明质酸发酵液的絮凝预处理研究 J，食品与发酵业，2001，27（12）：16-183李建武，生物化学实验原理和方法 M，北京大学出版社，2001，4：1744杭生，透明质酸的离子交换层析纯化 J，中国医药工业杂志，2001，32（11）：485-4885高海军，营养条件对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响 J，生物工程学报，2000，16（3）：396-3996鲁念慈，透明质酸的制备及其应用 J，功能高分子学报，2001，1