南京大学医学分子生物学研究法.pptx

任何强大的公司都不会给员工安全感，而是用最残忍方式激发每个人变得强大！凡是想办法给员工安全感的公司都毁灭啦，因为强大的人在温顺的环境失去了狼性！凡是逼出员工伟大的公司都升腾不息，因为在这种环境下，要么变成狼，要么被狼吃掉！最不给员工安全感的公司，其实给了真正的安全感，因为逼出了他们的强大，逼出了他们的成长，也因此有了未来！,如果真的爱你的员工，就考核他，要求他，逼迫他成长，如果你碍于情面，低目标，低要求，养了一群小绵羊、老油条，这是领导对员工前途最大的伤害！因为这只会助长他们的贪婪、无知和懒惰。让下属因为你而成长，拥有正确的人生观，价值观，并具备了完善的品行。不断的成长，就是主管对员工最伟大的爱！,分子生物学研究法-DNA、RNA及蛋白质操作技术,DNA基本操作技术,将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。,1核酸的凝胶电泳(AgaroseNCBI）下载序列（DNA,RNA）用Oligo验证评估引物引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，,酶及其浓度,TaqDNA聚合酶注：无35方向的校正活性DNA复制1/109；PCR出错率1/(2104)一个典型的PCR反应约需酶量2.5U浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,dNTP的质量与浓度,dNTP使用注意：1)保存：使用时应配成高浓度，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解；2)使用量：在PCR反应中，dNTP应为20-200umol/L。3)成分配比：注意4种dNTP的浓度要相等；,模板（template）,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一。,Mg2+浓度,1)Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响:Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低会降低TaqDNA聚合酶活性，使反应产物减少。2)在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜；,热循环条件的选择,PCR反应条件:温度时间循环次数,温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点：标准反应中采用三温度点法：1）93-95变性；2）40-60退火；3）70-75延伸对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，一般采用94变性，65左右退火与延伸,变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般9394lmin足以使模板DNA变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影响。,退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的长度当引物长度为15-20个碱基时，在高离子强度中反应（如1MNaCl）Tm=4（G+C）2（A+T）复性温度=Tm值-（510）,一般3060sec，足以使引物与模板间完全结合,延伸温度与时间：,温度：一般7075，常用温度为72。时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min。,特异性强,反应特点：,灵敏度高,简便、快速,对模板的纯度要求低,常见问题与对策,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解退火温度太高，延伸时间太短,现象：正对照有条带，而样品则无,非特异性扩增,PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致；或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,引物特异性差,模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态,M12,模板不纯或降解Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。各种试剂先进行分装，低温贮存。,*实时定量PCR*RT-PCRreal-timePCR,由于PCR技术具有极高的敏感性，扩增产物总量的变异系数常常达到10%-30%。20世纪90年代末期出现了实时定量PCR技术，利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中的扩增DNA的积累素来绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。,实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。荧光探针事先被混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光相应增加。,实时定量PCR,例如：荧光染料SYBRGreen仅能与双链DNA结合，被激发出绿色荧光，其荧光强度反映PCR产物的产量。,SYBRGreen做探针的实时定量PCR实验,SYBRGreen做探针的实时定量PCR实验,Taqman探针法,RNA基本操作技术,总RNA的提取,RNA提取：所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理,TotalRNA,1.制备RNA的关键防止内外源RNase的作用1)RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(065均具活性）；抗变性剂2)解决办法：外源RNase低温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等2.总RNA的制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：1）热苯酚抽提法2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法,实验室常用方法：异硫氰酸胍-苯酚抽提法,Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂，主要有苯酚和异硫氰酸胍组成。Trizol试剂可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并是核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。,使用Trizol试剂提取RNA具体实验过程,材料处理,液氮研磨，匀浆，加Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分,氯仿抽提，离心，分离水相和有机相,收集水相,异丙醇沉淀，得到比较纯的RNA,OD为1时，相当于浓度为40g/mLOD/OD如果在1.8-2.0，表示所提取的RNA纯度较好OD/OD低于1.8，样品中则混有蛋白质或酚污染,260,260,260,280,280,mRNA的纯化,真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有实验中常用寡聚（dT）-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA。,5端帽子结构mG,3端polyA尾巴,7,寡聚（dT）-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA,当RNA流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性结合在柱子上，再用低盐溶液会蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡聚（dT）-纤维素柱后可得到较高纯度的mRNA.,cDNA的合成,主要包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用的引物是oligodT。oligodT引物一般包含12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一个连接引物（通常是Xho等酶切位点）以便于克隆构建.,cDNA的合成,DNA变异（eg.SNP）的理论与应用,DNA多态性基因组DNA中,由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性产生机制点突变-序列多态性插入或缺失-长度多态性存在部位编码区非编码区DNA遗传标记是特定的碱基序列遵循孟德尔遗传规律遗传具有终身不变的遗传特征,SNP,指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A,T,C,G）的突变而引起的多态性。染色体DNA同一位置上的每一个碱基类型叫做一个等位位点。SNP-RFLP-SSR(限制性片段多态性)（微卫星标志）,根据SNP在基因组中的分布位置可分为：,基因编码区SNP（cSNP）基因调控区SNP（pSNP）基因间随机非编码区SNP（rSNP）,同义cSNP，即SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同,非同义cSNP，即SNP所导致的编码序列改变可使以其为模板翻译的蛋白质的氨基酸序列发生改变，从而影响蛋白质功能,SNP的检测技术,常用技术：限制性酶切片段长度多态性（RFLP）PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）毛细管电泳变性高效液相色谱（DHPLC）,以上技术仅能判断SNP的有无，而不能知道确切的碱基类型，只有进行DNA序列分析才能确认所发现的SNP,通过DNA测序法获得新的SNP,SNP的应用,人类基因单体型图的绘制SNP与疾病易感基因的相关性分析当一个遗传标记的频率在患者中明显超过非患者时，就表明该标记可能与这种疾病有关。指导用药与药物设计由于SNP能够充分反映个体间的遗传差异，所以通过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的相关性研究，可能阐明遗传因素对药效的英系那个，因此可能建立与基因型相关的治疗方案，对患者施行个性化用药。,DNA变异基因量的分析,杂合性丢失（LOH）,基因拷贝数的分析,RNA量的分析,蛋白质技术Westernblot,定义：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,WesternBlot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,WesternBlot一般流程,蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2g/mLAprotinin,0.5g/mLLeupeptin，pH8.0有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的制备,蛋白样品的定量,Bradford法考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。(上样量)试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml,3.5mg/ml,3.0mg/ml,2.5mg/ml,2.0mg/ml,1.5mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ml。）,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS後,由於SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,凝胶浓度与蛋白分离范围,不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的蛋白质混合物分离能力的关系,转膜,半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。,转膜后检测,丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。,封闭,脱脂奶粉（5）BSAWesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37一小时，4过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP),WesternBlot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平？凝胶漏液？,胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,背景太高,双向电泳技术蛋白质印迹法蛋白质的质谱分析技术,双向电泳技术,根据蛋白质的两个重要特性：等电点相对分子质量,电泳设备,垂直电泳系统,水平电泳系统,不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图,原位分析,免疫组织化学,免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。,免疫组化的全过程,抗原的提取与纯化,免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化,标记物与抗体集合形成标记抗体,标本的处理,抗原抗体反应和呈色反应,显微镜下观察结果,组织抗原,抗体,标记物,标记抗体,1荧光2酶3亲和技术4金标,组织抗原,免疫细胞化学反应原理：,标记抗体,标记的抗原抗体复合物,间接法,直接法,两种免疫细胞化学反应方法,标本的处理,标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞标本的固定与保存酶消化处理,组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。,标本的固定与保存,固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。,好的固定剂：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应,傅琦博F0318102,标本的固定与保存,各种抗原的固定,标本的固定与保存,冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构的破坏。石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法，可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但是抗原的保存量不如冰冻切片。,酶消化处理,石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。,抗体处理与保存,抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应钱或不着色。抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。,免疫染色,标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）,免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。,免疫染色,对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。,1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。,2.非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物煮至上的带电荷物质，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。,免疫组化染色中标识物的选择,用量微小，容易在光镜或电镜下识别机体内无同一物质或类似物质物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定,目前常用标识物质有荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶等,设立对照实验,为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。,（1）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。,（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。,免疫组化的结果判断,免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。,几种常用的免疫组化检测技术,荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术免疫标记电镜技术,免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位,免疫荧光技术,.异硫氰酸荧光素FITC.四乙基罗达明