（作物遗传育种专业论文）番茄农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄leja2基因的功能研究.pdf

目录 一丫liifllffff7lfff8ifff6lfff7fir15fifff1ii 摘；要i a b s t r a c t i n 1 前言1 1 1 番茄系统创伤信号因子研究进展1 1 2 植物伤害信号途径2 1 2 1 伤害信号的种类3 1 2 1 1 系统素( s y s t e m i n ) 3 1 2 1 2 物理信号3 1 2 1 3 活性氧3 1 2 1 4 一氧化氮( n o ) 3 1 2 1 5 寡聚半乳糖醛酸4 1 2 2 伤害反应中的植物激素4 1 2 2 1 茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 4 1 2 2 2 乙：烯( e t h y l e n e ，e t ) 5 1 2 2 3 水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) 5 1 2 2 4 脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 5 1 2 2 5 生长素( a u x i n ) 5 1 2 3 伤害诱导的细胞内变化6 1 2 3 1 伤害和离子浓度的改变j 6 1 2 3 2 伤害诱导磷脂酶活性变化6 1 2 3 3 伤害引起c a mm r n a 积累7 1 2 3 4 伤害诱导蛋白磷酸化与去磷酸化活性变化7 1 2 3 4 1c d p k 7 1 2 3 4 2m a p k 8 1 2 3 5 蛋白磷酸酶8 1 2 4 伤害诱导的防御基因9 1 2 5 伤害诱导信号传导模式9 1 3 茉莉酸抗性反应系统的研究意义9 1 3 1 茉莉酸的研究1 0 1 3 2 植物内源茉莉酸类化合物合成途径1 1 1 3 3 番茄中信号传导途径的研究1 3 1 4 番茄莱莉酸代谢相关基因克隆及功能分析1 5 1 5 本课题研究的目的意义1 8 2 材料和方法1 9 2 1 实验材料19 2 1 1 植物材料19 2 1 2 菌株1 9 2 1 3 质粒1 9 2 1 4 主要试剂2 0 2 1 5 主要仪器2 0 2 1 6p c r 扩增引物2 0 2 2 主要试剂2 0 2 2 1 培养基的配制2 0 2 2 1 1 细菌培养基2 0 2 2 1 2 植物培养基2 1 2 2 2 常用的缓冲液和试剂成分的配制2 1 2 2 2 1 质粒d n a 提取及纯化所用的试剂2 1 2 2 2 2d n a 提取所用的试剂2 l 2 2 2 3 电泳所用的试剂2 1 2 2 2 4p p o 活性检测所用的试剂2 2 2 2 2 5p p o 活力测定所用的试剂2 2 2 2 2 6 其他试剂2 2 2 3 实验方法2 3 2 3 1 番茄遗传转化体系的优化2 3 2 3 1 1 试验采取的处理和水平2 3 2 3 2s d s 碱裂解法少量快速制备质粒d n a 2 3 2 3 2 1 质粒检测2 4 2 3 3 番茄遗传转化2 4 2 3 3 1 种植无菌苗2 4 n 2 3 3 2 外植体的准备2 4 2 3 3 3 农杆菌介导的转化2 5 2 3 3 4 抗性愈伤筛选2 5 2 3 3 5 抗性芽的生根2 6 2 3 4 转基因植株的分子检测2 6 2 3 4 1 番茄基因组d n a 的提取参考l ie ta 1 ( 2 0 0 6 ) 所描述。2 6 2 3 4 2p c r 扩增分析2 7 2 3 5 两种类型转基因苗的性状鉴定2 8 2 3 6 转基因植株多酚氧化酶p p o 活性的测定2 8 2 3 6 1 试验方法2 8 2 3 6 2 实验设计2 8 2 4 计算公式2 8 3 实验结果与分析2 9 3 1 质粒检测2 9 3 2 番茄遗传转化体系的优化2 9 3 2 1 番茄转基因植株的获得3 l 3 2 2 番茄基因转化结果3 4 3 3 转基因番茄植株的分子生物学鉴定3 4 3 4t o 代转基因苗的性状观测3 6 3 5 转基因植株多酚氧化酶( p p o ) 活性检测3 8 4 讨 仑4 1 4 1 番茄农杆菌介导体系的优化4 1 4 1 1 组织培养过程中注意事项4 1 4 2 转基因植株的p p o 活性测定4 2 4 3l e j a 2 基因的b l a s t 同源序列分析4 3 5 结论4 5 5 1 番茄转化系统的优化4 5 5 2 番茄基因转化结果4 5 5 3l e j a 2 基因功能分析4 5 参考文献4 7 i i i 6 l 基因的片段6 3 6 6 6 7 山东农业大学硕士学位论文 摘要 目前，杀虫剂和除草剂的大剂量应用对环境造成了很大的破坏，对 人类的身体和生活质量也造成了不好的影响。高等植物在长期的进化过程 中形成了复杂而精细的抗性反应机制以抵抗昆虫的侵害。深入认识植物对 昆虫抗性的的分子机理将会为利用植物自身的抗性建立环境友好的控制 农业害虫的策略提供理论依据。目前所鉴定的信号分子主要包括多肽信号 分子系统素( s y s t e m i n ) 以及来源于不饱和脂肪酸的植物激素茉莉酸( j a ) ， 从分子水平对二者所介导的抗性反应过程进行遗传学解析，鉴定其中的重 要组分( 功能基因) 并对其功能进行深入研究。本研究优化了番茄遗传转 化体系；同时利用反向遗传学原理，构建了l e j a 2 ( l y c o p e r s i c o np s c u l e n t u mj a s m o n i ca c i d2 ) 的过量表达载体和r n a i 表达载体，通过农 杆菌介导的转基因技术，获得两种类型的转基因苗，通过对两种类型的转 基因苗的性状鉴定和p p o 活性的测定，对l e j a 2 的功能进行了初步的预 测。主要研究的结果如下： 1 建立了农杆菌介导的番茄遗传转化体系 对农杆菌介导的番茄转化l e j a 2 基因系统进行了优化，研究了农杆 菌侵染时间、侵染温度和侵染浓度三个因素对番茄愈伤组织形成的影响， 寻求影响基因转化的主要因素，获得了较好的番茄农杆菌侵染体系。 2 获得了转基因番茄植株 以子叶为转化受体，使用高效农杆菌介导遗传转化体系将l e j a 2 基 因和l e j a 2 r a n i 基因导入番茄，获得了2 0 株l e j a 2 过量表达的番茄抗 性植株和3 5 株l e j a 2 基因沉默抗性植株，p c r 检测结果表明卡那抗性株 均能扩增出1 0 5 0 和5 1 7 b p 的目的条带，证明基因已经整合到番茄基因组 中。 3 功能验证 对转基因番茄植株p p o 活性进行了初步检测。通过p p o 活性测定结果 得出：植株机械损伤处理前，过量表达l e j a 2 基因的转基因植株p p o 染色 后呈现深褐色，而对照和转l e j a 2 一r n a i 基因植株p p o 染色后仍然呈现正 常的汁液的绿色。用剪刀进行机械损伤后进行p p 0 染色，l e j a 2 基因过量 至苎垄堑堕坌量董堕壁垡垫查堡墨的优化与番茄l e j a 2 堆j 大i 的功能研究 l 二二= ：= 二= 竺：! ： 表达植株、转l e j a 2 一r a n i 基因植株和对照染色后都呈现深褐色。试验结 果表明l e j a 2 基因在番茄茉莉酸介导的伤信号传导途径中起着上游调控 的作用，调控着抗性相关基因的表达。 关键词：番茄 组织培养基因转化 荣莉酸信号传导 系统抗性反 应 i i 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t c u r r e n t l y , t h eh i g h - d o s ea p p l i c a t i o no fp e s t i c i d e sa n dh e r b i c i d eh a d c a u s e dg r e a td e s t r u c t i o nt oe n v i r o n m e n t a n da l s oc a u s e dab a di n f l u e n c eo nt h e h u m a nb o d y , a n dt h eq u a l i t yo fl i f e h i h e rp l a n th a se s t a b l i s h e dt h ec o m p l i c a t e da n de l a b o r a t ed e f e n s em e c h a n i s ma g a i n s ti n s e r ta t t a c k d u r i n gt h e l o n g t e r me v o l u t i o n h a v i n gd e e p e ru n d e r s t a n d i n go ft h em o l e c u l a rm e c h a n i s m o fp l a n tr e s i s t a n c et oh e r b i v o r e sw i l lp r o v i d et h e o r e t i c a le v i d e n c et oe s t a b l i s h t h ee n v i r o n m e n t - f r i e n d l ya g r i c u l t u r a lh e r b i v o r e sm a n a g e m e n tb ye m p l o y i n g t h er e s i s t a n c ea b i l i t yo fp l a n ti t s e l f t h es i g n a lm o l e c u l e st h a th a v eb e e na p p r a i s a l e di n c l u d i n gp e p t i d es i g n a lm o l e c u l e ss y s t e ma n dp l a n th o r m o n ej a s m o n i ca c i dc o m i n gf r o mt h eu n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，m a k i n gg e n e t i c sa n a l y s i s r e s i s t a n c ei nm o l e c u l a rl e v e lm e d i a t e db ys y s t e ma n dj a ，i d e n t i f y i n go n eo f t h ei m p o r t a n tc o m p o n e n t s ( f u n c t i o n a lg e n e ) a n dd o i n gf u r t h e rr e s e a r c hf o ri t s f u n c t i o n t h i sr e s e a r c ho p t i m i z e da g r o b a c t e r i u mm e d i a t e dt o m a t og e n e t i c t r a n s f o r m a t i o ns y s t e m u s i n gr e v e r s eg e n e t i c st e c h n o l o g y , c o n s t r u c t e dt h ee x c e s s i v ee x p r e s s i o nl e j a 2v e c t o ra n dr n e x p r e s s i o nv e c t o r b yt r a n s g e n i c t e c h n o l o g ym e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u m ，a f t e rs e e d l i n gt w ot y p e so ft r a n s g e n i c ， i d e n t i f i e dt h et w ot y p e so ft r a n s g e n i cs e e d l i n g sa n dt h ed e t e r m i n a t i o no fp p o a c t i v i t y , t h ef u n c t i o no fl e j a 2w a sp r e d i c t e dp r e l i m i n a r y m a i nr e s e a r c hr e s u i t sa r ea sf o l l o w s ： 1 e s t a b l i s h e da g r o b a c t e r i u mm e d i a t e dt o m a t og e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n s y s t e m o p t i m i z e da g r o b a c t e r i u mm e d i a t e dt o m a t ot r a n s f o r m e dl e j a 2s y s t e m s t u d y t h ei n f l u e n c eo ft h r e ef a c t o r s ，a g r o b a c t e r i u mt u r n f a c i e n si n f e c t i o nt i m e i n - f e c t i o nt e m p e r a t u r ea n di n f e c t i o nc o n c e n t r a t i o n ，t ot o m a t oc a l l u sf o r m a t i o n s e e k i n gt h em a i nf a c t o r sa f f e c t i n gg e n et r a n s f o r m a t i o n o b t a i n e dt h eo p t i m a l c o m b i n a t i o no ft o m a t oa g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e di n f e c t i o ns y s t e m 2o b t a i n e dt r a n s g e n i ct o m a t op l a n t s t a k ec o t y l e d o n sa sc o n v e r s i o n , u s i n ge f f i c i e n ta g r o b a c t e r i u mm e d i a t e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mt r a n s f e rl e j a 2g e n e sa n dl e j a 2 r _ 心ig e n et o t o m a t o e s ，a c q u i r e d11 l e j a 2g e n ee x c e s s i v e l ye x p r e s s e sr e s i s t a n tt o m a t o p l a n t s a n d3 5l e j a 2g e n es i l e n c i n gr e s i s t a n tp l a n t s p c rd e t e c t i o nr e s u l t s s h o wt h a tk a n a m y c i nr e s i s t a n tp l a n t sc a nb ea m p l i f i e dt h e10 5 0 b pa n d517 b p p u r p o s eg e r s h g o r i mb a n d t l l i sp r o v et h a tg e n e sh a sb e e ni n t e g r a t e di n t ot h e i i i 番茄农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄l e j a 2 疑1 大1 的功能研究 t o m a t og e n o m e - 3l e j a 2g e n ef u n c t i o nv a l i d a t i o n t e s t e dp p oa c t i v i t yo ft r a n s g e n i ct o m a t op l a n t sp r e l i m i n a r y b yp p oa c t i v i t yd e t e r m i n a t i o nr e s u l t so b t a i nt h a t ：u n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s ，e x c e s s i v e e x p r e s s i o nl e j a 2g e n et r a n s g e n i cp l a n t sp r e s e n tb r o w n ，w h i l ec o n t r o la n d l e j a 2g e n es i l e n c i n ge x p r e s s i o nt r a n s g e n i cp l a n t ss t i l la p p e a rn o r m a lj u i c e g r e e na f t e rp p od y e i n g ：d om e c h a n i c a ld a m a g ew i t hs c i s s o r s ，e x c e s s i v e e x p r e s s i o nl e j a 2g e n et r a n s g e n i cp l a n t s ，c o n t r o la n dl e j a 2g e n es i l e n c i n g e x p r e s s i o nt r a n s g e n i cp l a n t sa p p e a rb r o w na f t e rp p od y e i n g e x p e r i m e n t “卜 s u l t ss h o wt h a tl e j a 2g e n ep l a y sar o l eo fr e g u l a t i o nu p s t r e a mi ns i g n a l t r a n s m i s s i o nc h a n n c l m e d i a t e db yj a s m o n i ca c i do ft o m a t o ，r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no f r e s i s t a n c er e l a t e dg e n e k e y w o r d s ：t a m a t o ；t i s s u ec u l t u r e ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ；j a s m o n i ca c i d ； s i g n a l l i n g ；s y s t e m i cd e f e n s er e s p o n s e ； i v 山东农业大学硕士学位论文 1 前言 目前，各类昆虫的侵害对农作物生产构成极大威胁，传统的害虫防治 方法主要是大量施用化学杀虫剂，这在取得一定经济效益的同时，也带来 了农药残留、环境污染、生态破坏等严重问题。在长期的进化过程中，植 物为了抵抗昆虫的侵害，建立起了复杂、多样的抗性反应机制，我们可以 利用植物自身的抗性来建立一种无污染、可持续的农业害虫防治策略，这 就需要对植物自身的抗性反应机理进行深入透彻的研究。番茄 ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 既是重要的经济作物又是公认的模式植物，历 来是研究植物与病原微生物及昆虫相互作用的经典模式植物。就植物对昆 虫抗性反应机理而言，番茄被认为是研究植物从受伤刺激到抗性基因表达 这一信号传导过程的最理想的模式系统。这主要是因为番茄中存在衡量抗 性反应强弱的标志蛋白一蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r s ，p i s ) 。 1 1 番茄系统创伤信号因子研究进展 在番茄中存在抗性反应强弱的标志蛋白一蛋白酶抑制剂( p r o t p f 甩口s p i n h i b i t o r s ，p i s ) 。p l s 是一类富含丝氨酸的小分子量碱性蛋白质分子，通过 抑制昆虫肠道内消化酶的活性而达到抗虫目的。番茄植株受到机械损伤、 昆虫侵害后会大量合成p i s 等抗性相关的物质，并且p i s 不只是在受伤 的部位大量合成，而且在植物全身，包括未受伤的叶片中合成。这标志着植 物整体抗性反应，即对应于受伤刺激，植物会合成一类信号分子s i g n a l ，这 种信号分子可以长距离运输到植物全身的各个部位，包括未受伤的叶片， 从而诱导抗性相关基因的表达。 当植物受到机械损伤或害虫伤害时，植物体会在受伤部位产生创伤 信号分子启动防御基因的系统表达。许多研究表明系统素( 或其前体原系 统素) 在受伤部位激活茉莉酸的合成，使之达到系统反应的水平应对外来 伤害；茉莉酸或其衍生物是重要的系统伤信号分子，它诱导伤防御基因的 系统表达。自从系统素和茉莉酸被认为是伤诱导防御基因表达的信号分子 后，番茄成为研究植物系统伤信号很好的模式植物。系统素( s y s t e m i n ) 和茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 被认为是最可能的细胞间创伤信号。同益增 多的生化和遗传学证据表明，系统素和茉莉酸是通过一个共同的信号传导 番茄农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄l e j a 2 基i 大i 的功能研究 途径调控抗性相关基因的局部和系统表达( r y a na n dp e a r c e ，2 0 0 3 ；s c h e e r a n dr y a n ，2 0 0 2 ；l ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。然而，系统素和茉莉酸各自起怎样的 作用? 以及二者如何相互作用来协调抗性基因的表达所知甚少( t u r n e re t a 1 ，2 0 0 2 ) ? r y a n 教授( f a r m e ra n dr y a n ，1 9 9 2 ) 的模型认为：系统素是 进行长距离运输的信号分子，在系统抗性反应中起主导作用；而茉莉酸不 进行长距离运输，主要是在局部区域起作用诱导抗性相关基因的表达。 2 0 0 3 年，李传友等以茉莉酸合成突变体s p r 2 ( l ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 和茉莉酸识 别突变体j a i l ( l ie ta 1 ，2 0 0 4 b ) 为遗传工具所进行的嫁接试验表明，系统 抗性中可以进行长距离运输的信号分子是茉莉酸而不是系统素；系统素的 功能在于调控茉莉酸的生物合成，它对抗性反应的作用依赖于茉莉酸( l e e a n dh o w e ，2 0 0 3 ；l ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。这一结论从根本上改变了长期以来认 为系统素是长距离运输的信号分子的观点，并确定了茉莉酸在调控植物对 昆虫抗性反应中的核心地位。从分子水平对二者所介导的抗性反应过程进 行遗传学解析，鉴定其中的重要组分( 功能基因) 并对其功能进行深入的 研究。 1 2 植物伤害信号途径 在自然环境中生长的植物会不断遭受到各种各样的生物和非生物因 素所形成的机械损伤以及病原性侵害，譬如风、沙、雹、雨、干旱、洪涝、 盐渍、寒冷、高温等非生物因素以及昆虫、动物和许多病原菌( 病毒) 等生 物因素。为了抵御这些伤害，在长期的进化过程中植物自身形成了一些防 御机制：一类就是植物赋予自身的物理防御特性特征，如木质化的表皮可 以成功地耐受小型草食动物的侵袭；毛状体、棘和其它特殊的器官可以有 效地限制害虫的活动。另一类就是植物对伤害所产生的抗性反应，这主要 依赖于特异基因的表达活性的提高。这是植物自身能动性的一种体现，因 为植物不可能像动物一样对于伤害可以通过移动位置进行躲避。对于所受 到的伤害刺激，植物自身会通过一类特异信号分子的产生、释放、感受和 传导，从而激活伤害相关防御基因的表达，从而减少或避免进二步的伤害。 这些防御基因产物的主要功能为：1 ) 对损伤植物组织的修复；2 ) 产生可以 抑制昆虫生长发育的物质；3 ) 参与伤害防御信号途径的激活；4 ) 调控相关 物质的代谢。 2 山东农业大学硕士学位论文 1 2 1 伤害信号的种类 自然界中有许多物质能够诱导植物伤害防御反应，植物的这种反应通 常需要不同信号分子和调节因子同时起作用，而且参与伤害反应的信号分 子的种类和表达量因植物的种属而不同。 1 2 1 1 系统素( s y s t e m i n ) 系统素能够强烈诱导番茄和马铃薯等茄科植物中蛋白酶抑制剂的表 达。该物质最初是从番茄受伤叶片粗提物中分离到的一类多肽，由1 8 个 氨基酸组成( m o u r aa n dr y a n ，2 0 0 1 ) 。从番茄幼苗基部施加化学合成的系 统素，能够诱导上部幼嫩的番茄叶中蛋白酶抑制剂基因表达；用放射性 ( 1 4 c ) 标记的系统素处理叶片的损伤位点，则可在韧皮部检测到放射性， 证明系统素是可移动的( r y a na n dp e a r c e ，2 0 0 3 ) 。此外，表达反义原系统 素基因的番茄缺乏长距离的伤害信号传导，并且对害虫的侵袭比野生型更 敏感，这证明系统素参与番茄的系统信号传导( h o w ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 1 2 1 2 物理信号 除系统素外，电脉冲( e l e c t r i c a lp u l s e s ) 和水压波( h y d r a u l i cw a v e s ) 也是 长距离传导信号( m i s h r ae ta 1 ，2 0 0 1 ；s c h u t t e ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。实验证明系统 素可引起脂膜的电应答反应，这说明化学信号和物理信号可能共同参与伤 害信号传导的早期步骤，它们之间可能发生相互调节作用。 1 2 1 3 活性氧 伤害反应的早期是一个伤1 2 1 快速关闭的反应，这可使植物减少细胞成 分的流失，也可限制微生物的侵入。这个反应至少包括2 个过程：1 ) 在侵 染位点立即产生活性氧，活性氧可在伤害发生后1 5 秒内检测到。这可使 植物细胞壁发生交联，细胞壁蛋白的交联提供一个结构屏障，抑制微生物 的侵入。2 ) 活性氧中的h 2 0 2 可激活一些伤害诱导基因的表达。有实验证 明h 2 0 2 作用位点是在j a 作用的下游，在伤害和系统素诱导的反应中起到 增强的作用( o r o z c o c a r d e n a se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 2 1 4 一氧化氮( n o ) 尽管一氧化氮与活性氧协同作用激活防御反应抵抗病原物，但是在伤 害信号传导中却起着抑制剂的作用( o r o z c o c a r d e n a sa n dr y a n ，2 0 0 2 ) 。用 n o 底物硝普钠盐( s o d i u m n i t r o - p m s s i d e ，s n p ) 处理番茄离体叶片，则抑制伤 番拍农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄l e j a 2 基l l 的功能研究 害诱导的p i i 积累，而用n 0 的清除剂2 - ( 4 - c a r b o x i p h e n y l ) 一4 ，4 ，5 , 5 t e t r a m e t hv l i m i d a z o l i n e 1 一o x y l - 3 一o x i d e ( 简称为c a r b o x y - p t i o ) 可以解除这种抑制。 n o 也可以阻碍h 2 0 2 的产生和蛋白酶抑制剂的合成，但是n o 并不抑制 j a 途径基因的激活，也不抑制s a 的合成，而s a 对伤害诱导防御反应基 因信号传导起抑制作用。 1 2 1 5 寡聚半乳糖醛酸 小分子寡糖是防御反应的特征性激发子。在植物的伤害部位有来源 于植物细胞壁的寡聚半乳糖醛酸的释放。寡聚半乳糖醛酸和真菌的脱乙酰 壳多糖可激活茄属植物伤害诱导的蛋白酶抑制剂基因的表达( d o a r e se ta 1 1 9 9 5 ) 。番茄中的多聚半乳糖醛酸酶受伤害和系统素的诱导，而且寡聚半 乳糖醛酸可激发番茄细胞的活性氧产生，说明在番茄系统素所诱导的局部 反应信号传导系统中，寡聚半乳糖醛酸可能代表( 伤害系统素呻寡聚半 乳糖醛酸啼活性氧) 这一过程一个中间步骤。寡聚半乳糖醛酸的可移动性 十分有限，因此其作为信号分子局限于伤害叶片受伤区域内。在寡糖处理 的细胞中，内源茉莉酸( j a ) 居i j 增，并诱导了前系统素基因的表达( c r e e l m a n a n dm u l l e t ，1 9 9 7 a ) 。因此，目前认为在防御反应中寡糖可能是作为一种局 部信号分子发挥作用。 1 2 2 伤害反应中的植物激素 1 2 2 1 茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) j a 是植物中广泛存在的一类植物激素，目前认为它是激活受伤害诱 导基因表达的关键调节因子，特别是在诱导植物系统抗性反应中起到主导 作用。受伤后植株在受伤部位以及未受伤部位短时间内迅速合成大量茉莉 酸( k e s s l e re ta 1 ，2 0 0 4 ；c r e e l m a na n dm u l l e t ，1 9 9 7 b ) 。外施j a 或m e j a 使伤 害诱导的基因的表达水平提高( f a r m e re ta 1 ，1 9 9 0 ) ，转录调控形式类似于 受伤害诱导。在茉莉酸合成缺陷突变体中伤害诱导韵基因表达受到破坏。 嫁接实验证明茉莉酸作为可移动的系统性信号介导伤害反应。伤害反应信 号途径不仅存在依赖于j a 的途径，也存在着不依赖于j a 的反应。t i t a r e n k o 利用m r n a 差异显示技术证明，伤害和激素处理后，伤害诱导基因和j a 诱导基因的表达谱在转录空间分布上存在差异，同时这两类基因在对 a b a 和j a 的响应上也存在差异( t i t a r e n k oe ta 1 ，1 9 9 7 ) 。通过比较拟南芥 4 山东农业大学硕士学位论文 的野生型和j a 不敏感突变体c o i l ( c o r o n a t i n e i n s e n s i t i v e l ) 对伤害的响应， 发现拟南芥至少存在2 条途径来传导伤害信号。一条不需要j a 介导，主 要是伤害位点附近基因的活化；另一条途径依赖于j a 的基因表达，发生 在植物的整体。 1 2 2 2 乙烯( e t h y l e n e ，e t ) 机械伤害反应中，植物通过激活合成途径的酶基因产生e t 。番茄中 e t 是通过o c t a d e c a n o i d 途径加强系统素激活的伤害途径( o f d o n n e l le ta 1 2 0 0 3 ) ；而拟南芥中，e t 是连接依赖和不依赖于j a 的伤害诱导基因表达 的调节因子。 1 2 2 3 水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) 在暗处用亚麻酸( 1 i n o l e n i ca c i d ，l a ) 和1 3 s h p l a 处理番茄离体叶片， 发现乙酰水杨酸( a s a ) 抑制o c t a d e c a n o i d 途径，因此抑制j a 的合成 ( p e n a - c o r t e se ta 1 ，1 9 9 5 ) ；同时证明s a 抑制1 3 s h p l a 向1 2 o x y - p d a 的 转化，即抑制1 3 s - 氢过氧化物脱水酶( s c h a l l e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。d o a r e s 等也证 明番茄中受j a 和系统素诱导的蛋白酶抑制剂基因受s a 抑制；而且证明 s a 对伤害信号途径的抑制主要发生1 3 s h p l a 向1 2 o x y p d a 的转化以 及j a 合成与基因转录活化之间( d o a r e se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 2 2 4 脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 目前，a b a 在伤害信号传导中所起的作用还不确定。许多证据表明 a b a 是番茄、马铃薯等植物的伤害信号传导中一个基本信号物质，例如： ( 1 ) 番茄和马铃薯的a b a 缺失突变体不能在伤害处理6 h 和2 4 h 时检测到 伤害诱导蛋白酶抑制剂基因( p i i i ) 的m r n a 的积累( p e n a - c o r t e se ta 1 ， 1 9 9 1 ) ；( 2 ) 而a b a 处理2 4 h ，番茄离体叶片积累p i i im r n a ；( 3 ) 伤害处 理6 h 后，番茄叶片中a b a 含量增加2 5 0 倍( b i r k e n m e i e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。另 外，系统素不能诱导a b a 缺失突变体中的p i 基因表达；而j a 则可诱导。 这表明在伤害反应中，a b a 信号位于系统素的下游，j a 的上游。由此认 为a b a 是伤害信号传导途径中激活防御基因表达的重要成分。 1 2 2 5 生长素( a u x i n ) 生长素已被证明能够抑制伤害诱导的蛋白酶抑制剂基因表达，这种抑 制不仅发生在培养细胞中，也发生在整株植物中。生长素不仅抑制伤害诱 番茄农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄l e j a 2 綦【大i 的功能研究 导基因的表达，还抑制其它化学物质起诱导作j 羽( l e o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 伤害诱导的细胞内变化 1 2 3 1 伤害和离子浓度的改变 系统素是番茄中激活受伤害诱导基因表达的重要媒介物质，并可使番 茄细胞培养基快速碱性化，暗示着在质子跨膜运输与防御基因的诱导之间 可能存在一种受质膜矿a t p 酶活性调节的机佑u ( s c h a l l e re ta 1 1 9 9 9 ) 。 矿a t p 酶抑制剂如藻红b ( e r y t h r o s i n e b ) 、二乙基己烯雌酚( d i e t h y ls t i l b e s t r 0 1 ) 、钒酸盐( v a n a d a t e ) ，可使番茄细胞培养基碱性化，并且可以诱导整 株番茄伤害基因的表达。相反，h + a t p 酶激活剂壳梭孢菌素( f u s i c o c c i n l 可使番茄细胞培养基酸性化。同样地，壳梭孢菌素处理番茄植株，发现伤 害和系统素对伤害诱导基因的激活都受到抑制。以上实验证明矿a t p 酶 参与了细胞内外质子环境的调节。此外，研究证明番茄细胞培养基的碱性 化依赖于c a 2 + 的内流和蛋白激酶的活化，预示着质膜h + a t p 酶可能是依 赖于c a 2 + 的蛋白激酶的靶蛋i 兰t ( m a t i n v i c e n t ee ta 1 ，2 0 0 5 ) 。伤害信号分子 可引起细胞内c a 2 + i 懦( m o y e n ，1 9 9 8 ) ：用系统素处理番茄幼苗，可触发 叶肉细胞内c a 2 + 的瞬时升高，推测系统素诱导的细胞内c a 2 + 升高可能是系 统信号途径的早期步骤；用j a 处理烟草可引起酸性磷酸酶活性升高和蛋 白含量下降的反应，表明j a 也影响了c a 2 + 的流动。 1 2 3 2 伤害诱导磷脂酶活性变化 伤害能引起植物细胞膜脂类组分产生快速而瞬时的变化，这种变化包 括极性脂类含量的降低和可溶性脂类、磷脂酸、游离脂肪酸，特别是亚麻 酸和亚油酸的水平提高。亚麻酸是j a 生物合成的前体，因此，亚麻酸从 膜上的释放是伤害诱导防御基因表达的胞内信号事件中的关键步骤 ( c o n c o n ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 。亚麻酸是磷脂酶( p h o s p h o l i p a s e ) 作用于膜上磷脂而释 放出来的。伤害、系统素和寡糖能够引起番茄幼苗磷脂酶a ( p h o s p h o l i p a s e a ，p l a ) 活性升高( n a r v a e z v a s q u e ze ta 1 ，1 9 9 9 ) 。利用p l a 2 抑制剂研究 p l a 2 活性与蛋白酶抑制剂( p i ) 含量变化的相关性，结果表明p l a 2 参与了 伤害、系统素、寡糖引起的信号转导的早期事件，并导致防御蛋白的合成 及积累，并调节防御基因的表达( p o h n e r t ，2 0 0 2 ) 。w a n g 等一系列研究表明 磷脂酶d ( p l d ) 的活化也在介导磷脂水解过程中起着重要的作用( w a n ge t 6 山东农业