（果树学专业论文）蛋白酪氨酸可逆磷酸化参与水分胁迫细胞逆境信息传递.pdf

中国农业大学硕士学位论文 蛋白酪氨酸可逆磷酸化参与水分胁迫细胞逆境信息传递 摘要 由于植物的生氏和发育不可避免地要受到各种环境因素特别干旱的影响或胁迫，氏期的 进何使植物演化出一套适应或对付环境胁迫的机制，这种机制体现在，环境胁迫f 植物可以 通过复杂的细胞逆境信息传递使植物及时感知环境胁迫并最终产生出各种抗逆的生理、生化 反应。由酪氨酸蛋白激酶 r o s i n ep r o t e i nk i n a s e ，t p k ) i ：1 1 磷酸酶( p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h t a s e ， p t p ) 催化的蛋白酪氨酸可逆磷酸化在动物细胞的信息传递中具有重要的功能，长期以来，人 们一直认为植物细胞不存在该信息系统。但是，药理学实验表明，该信息系统可能参与a b a 逆境信号的产 参与水分胁迫 究以玉米胚芽鞘为材料，采用多种生物技术对蛋白酪氪酸可逆磷酸化 胞信号传递进行的研究。免疫胶体金电镜定位研究表明，细胞核、州 绿体和细胞质区域均有磷酸酪氨酸基团( p h o s p h a t e - t y m s i n e ，p t ) 分布，细胞核是p t 分布的 主要部位，液泡和细胞壁中没有p t 分布。水分胁迫似乎可导致细胞核p t 减少，但减少程度 不很明显。免疫印记研究表明，至少有两种细胞核蛋白可于p t 抗体发生免疫反应，其中水分 胁迫可导致5 5k d 核蛋自发生脱磷酸化，而6 3k d 的核蛋白可发生磷酸化反应。细胞可溶性 蛋白中尽管有3 种蛋白可与p t 抗体发生反应，但水分胁迫没有引起免疫反应的变化。微粒体 蛋白中有两种蛋白可于p t 抗体发生反应，但杂交信号很弱，说明p t 在微粒体蛋白中含量很 底。尽管如此，研究发现，水分胁迫下一个分子量为6 5k d 的蛋白可发生脱磷酸化反应。以 上结果不仅证实了磷酸酪氨酸存在于植物细胞，而且为磷酸酪氨酸可逆磷酸化参与水分胁迫 诱发的细胞信号传递提供了直接证据，同时为进一步揭示p t k p t p 信号组分及鉴定其具体功 能建立了很好的基础。 关蝴：水分近；信毳叠：磷酸酪菇；免础 免疫市逸。 研，细撩 中国农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t oc o p ew i t hu n p r e d i c t a b l ee n v i r o n m e n t a ls t r e s s e se s p e c i a l l yw a t e rs t r e s s ，p l a n t sh a v ee v o l v e d w i t hs o m es i g n a l i n gm e c h a n i s m sb yw h i c hp l a n t sc a nr a p i d l yp e r c e i v ea n da c t i v e l yr e s p o n dt ot h e w a t e rs t r e s s r e v e r s i b l ep r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o n ( p t ) c a t a l y z e db yt p k ( t y r o s i n ep r o t e i n k i n a s e ) a n dp t p ( p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e ) p l a y sc r i t i c a lr o l ei nc e l l u l a rt r a n s d u c t i o no f a n i m a l c e i l h o w e v e r , i th a sl o n gb e e nt h o u g h tt h a tt h et p k p t ps i g n a l i n gc a s c a d ed i dn o te x i s ti np l a n t c e l l s w eh a v er e c e n t l yc a r r i e do u ts o m es t u d i e so nt h ec e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o nf o r mw a t e rs t r e s s p e r c e p t i o n t oa b aa c c u m u l a t i o n ，a n dw i t hp h a r m a c o l o g i c a le x p e r i m e n th a v eo b s e r v e dt h a tt h e w a t e rs t r e s s i n d u c e da b aa c c u m u l a t i o nm i g h tb ec l o s e l yr e l a t e dt ot h er e v e r s i b l ep r o t e i nt y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n i np r e s e n tr e s e a r c h ，e x p e r i m e n t s w e r ec a r r i e do u tw i t h m u l t i p l eb i o l o g i c a l t e c h n o l o g y i no r d e rt o p r o v ew h e t h e rt h e r e v e r s i b l e p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o nm i g h tb e i n v o l v e di nw a t e rs t r e s s - i n d u c e ds i g n a lt r a n s d u c t i o n 1 m m u n o - g o l de l e c t r o nm i c r o s c o p yh a ss h o w e d t h a tp te x i s t sb o t hi nn u c l e ia n dc h l o r o p l a s t sa n dt h em a j o r i t yo fp te x i s t si nt h en u c l e iw i t hn o d e t e c t i o no fp ti nv a c u o l e s w a t e rs t r e s ss e e m st oc a u s et h ed e c r e a s eo fp ti nn u c l e i b u tn o t s i g n i f i c a n t l y w i t h w e s t e m b l o t t i n g i tw a so b s e r v e dt h a tl e a s tt w ok i n d so f p r o t e i nm a y i m m u n o l o g i c a l l yr e a c tw i t ht h ep ta n t i b o d y , a m o n gw h i c ha5 5 k dp r o t e i np h o s p h a t e - t y r o s i n ew a s d e p h o s p h o r y l a t e da n da n o t h e r6 3k d n u c l e a rp r o t e i nw a sp h o s p h o r y l a t e d t h r e ek i n d so fs o l u b l e p r o t e i n sw e r ef o u n dt or e a c ti m m u n o l o g i c a l l yw i t hp ta n t i b o d y , b u ti t h a sb e e nn o ta f f e c t e db y w a t e rs t r e s s t w ok i n d so fm i c r o s o m ep r o t e i nw e r ef o u n dt oi m m u n o l o g i c a l l yr e a c tw i t ht h ep t a n t i b o d y a l t h o u g ht h ei m m u n o - r e a c t i o nw a sv e r yw e a k ，i tc o u l db es t i l l i d e n t i f i e dt h a ta6 5 k d p r o t e i nh a db e e nd e p h o s p h o r y l a t e du n d e rw a t e rs t r e s s t h er e s u l t sa b o v eh a v en o to n l yp r o v e dt h e e x i s t e n c eo fp ti np a n tc e l l ，b u ta l s oh a sp r o v i d ed i r e c te v i d e n c e st h a tt h er e v e r s i b l e t y m s i n e p h o s p h o r y l a t i o nm i g h tb ei n v o l v e d i nw a t e rs t r e s si n d u c e ds i g n a lt r a n s d u c t i o n m o r e o v e r , t h e p r e s e n tr e s e a r c hh a sl a i dav e r yg o o df o u n d a t i o nf o rf u r t h e ri d e n t i f y i n ga n dr e v e a l i n gt h ee x a c t f u n c t i o no f t h es i g n a lc o m p o n e n t si np t k p t pc a s c a d e k e y w o r d s ：w a t e r s t r e s s ：s i g n a lt r a n s d u c t i o n ：p h o s p h o t y r o s i n e ：l m m u n o g o l d l o c a l i z a t i o n ；w e s t e r nb l o t t i n g 。 2 中国农业大学硕士学位论文 英文缩写表 a b a ：a b s c i s i ca c i d b s a ：b o v i n es e r u ma l b u m i n p t p ：p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e p t ： p h o s p h o t y r o s i n e p t k ：p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e a c r y ：a c r y l a m i d e a p s ：a m o n i u m p e r s u l p h a t e b i s ： n ，n - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e d t r ：d i t h i o t h r e i t o l e d t a ： e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d p a g e ：p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s ：s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e s d s p a g e ：s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s d a p i ： 4 6 一d i a m i d i n o 一2 一p h e n y l i n d o l e o c w ： c e l lw a l l c y t ：c y t o p l a s m c h l ： c h l o r o p l a s t v ：v a c u o l e m e s 2 - ( n - m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d 3 中国农业大学硕士学位论文 前言 干旱是限制作物产量及植物生存与发展的主要因素之一。近年来大量的研究表明，植物 具有对干旱胁迫快速感知和主动反应的能力，这种快速感知和主动反应能力的获得是通过一 系列逆境信息传递过程实现的。逆境信息传递包括植物整体的长距离信息传递及细胞逆境信 息传递。所谓长距离信号传递是指，在水分胁迫f 植物可以通过器官间的信息交流特别是根 系和地上部分之间的信息交流使植物产生整体的抗逆性。细胞逆境信号传递是指细胞如何接 受环境刺激，然后如何通过复杂的信息交流使细胞产生抗逆的生理、生化反应。细胞抗逆的 生理、生化反应多是以基因的表达调控为基础，近年来，植物逆境应答基因或抗逆基因的研 究已成为一个热点，目前已发现了众多的逆境应答基因或抗逆基因但大部分不清楚其功能。 人们越来越清楚地认识到，植物的抗逆性不是受单个基囚操纵的，多基因协同表达才可有效 实现抗逆性，而多基因协同表达的机制实际上是由细胞信号信号系统操纵的。为此，细胞逆 境信号传递的研究越来越受到人们的高度重视。第二信使系统如c a “、c a m 、i p 3 和d g ，丝 氨酸苏氨酸及烈功能蛋白激酶和磷酸酶如p k c ，c d p k ，m a p k 等是人们比较熟悉的信号组 分或系统，它们具有广泛的功能，因此它们与细胞逆境信号的研究也受到人们的高度重视。 越米越多的证据表明，这些信号组分或系统都可能参与细胞逆境信号传递。 除以上信号组分或系统之外，脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 可以说是一个最为重要的细 胞逆境信号之一，这是因为众多的水分胁迫麻答基因的表达都是由a b a 米介导的，而a b a 之所以能够作为细胞逆境信号，其根本基础在于水分胁迫可以诱导a b a 的大量积累。水分胁 迫诱导a b a 积累过程实际上是一个细胞逆境信息传递过程，即从细胞对水分胁迫原初信号的 识别，到细胞内信号传递直到最后的编码a b a 生物合成关键酶基因的启动。 近年来，我们围饶水分胁迫诱导a b a 积累的细胞逆境信号展开了许多研究，但是没有发 现人们熟知的信号组分或信号系统如c a ”、c a m 、i p 3 和d g 、p k c 、c d p k 、m a p k 可以参 与水分胁迫诱导a b a 积累的细胞信号传递。十分有有兴趣的是，水分胁迫诱导的a b a 积累 可被所有的酪氨酸蛋白磷酸酶专抑制剂阻断。这一发现激发了我们对酪氨酸可逆蛋白磷酸 化参与细胞逆境信号传递的兴趣。这是因为，由p t k p t p 催化的酪氨酸可逆蛋白磷酸化在动 物及酵母细胞的信号传递中起着非常重要的作用，例如p t p 可以作为受体识别许多胞外信号， 4 中国农业大学硕士学位论文 某些胞内p t p 可和激活的生长因子受体反戍凋竹细胞的生长和分化等，但是，跃期以来人们 一直认植物细胞中不存在由p t k p t p 催化的酩氨酸可逆蛋白磷酸化系统，直到最近儿年，植 物细胞中存在p t p 才偶有报道，但对其功能没有任何了解。本研究的目的就是试幽揭示酩氨 酸可逆蚩白磷酸化是否有可能参与水分胁迫诱发的细胞信号传递及其生化机制如何，以便为 进一步深入揭示p t p p t k 信号组分及阐明其具体功能打下良好的基础。 中国农业大学硕士学位论文 文献综述 1 水分胁迫下植物的生理生化反应 植物是不能移动的有机体，它们生存在一个多变的环境中就必须对外界刺激作出快速 的反应。植物暴露在一些极端的环境条件下( 如干旱) ，就会导致一系列在生理、形态和发 育上的变化。如细胞失水、活性氧产生、脱落酸( a b a ) 积累、渗透调节物质合成航氧化 能力提高以及膜系统破坏、组织伤害、蛋白质核酸降解、细胞解体升值，甚至植物死亡等。 既有主动的适应( 抗逆反应) ，也有伤害性反应，h s i a o ( 1 9 7 3 ) 对此有专门的评述。传统观念 认为植物对逆境刺激的反应只不过是植物直接受其干扰或伤害的结果，即指植物的伤害性 反应。事实上，抗逆反应对于植物、以最优化的方式维持其生存具有重大意义。 2 水分胁迫应答基因的功能 水分胁迫可诱导多种基因的表达，但只有较少的基因可根据其编码蛋白的氨基酸序列 初步推断其抗逆的功能( 1 n g r a m 和b a r r e l s1 9 9 6 ) 。实际上只有极少基因编码蛋白的生理、 生化功能得到实际分析。这些基因编码蛋白基本上可分为西类：一类为功能蚩白，这些蛋 白直接参与细胞对水分胁迫的抗性；另一类为调节蛋白，这些蛋白并不直接参与细胞对水 分胁迫的抗性，它们的作用在于调控下游的水分胁迫应答基因的表达。功能蛋白可分为以 i - ) l 类：( 1 ) 参与a b a 生物合成的关键酶如9 - c i s n e o x a n t h i n 裂解酶；( 2 ) 凋控水分子跨 膜运输的蛋白如水通道蛋白；( 3 ) 对细胞大分子物质及膜系统有保护作用的蛋白如l e a 蛋 白、渗透蛋白、抗冻蛋白c h a p e r o n e s 等；( 4 ) 参与渗透调节的物质( 如甜菜碱、糖、脯氨 酸) 代谢酶；( 5 ) 参与自由基清除的酶如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化 物酶、谷光甘肽s 转酶、环氧化物水解酶等：( 6 ) 蛋白酶如巯基蛋白酶，泛素伸展蛋白等， 这些酶或蛋白参与水分胁迫功能受到破坏的蛋白或酶的转化、清除或修复。调节蛋白为细 胞信号组分及转录因子，其中包括：( 1 ) 与第二信使产生有关的酶如磷脂酶c 。( 2 ) 胞内信 号蛋白如蛋白激酶及蛋白磷酸酶，1 4 3 3 蛋白等：( 3 ) 转录因子，它们直接参与基因地表达 调控。如上所述，目前尽管己发现人量的水分胁迫应答基因并且通过其编码蛋白的氨基酸 序列可以初步推断其功能，但仅有极少数的基因在抗逆中的实际功能得到鉴定。通过转基 因植物来鉴定水分胁迫应答基因地功能是一个非常有利的手段。由于功能蛋白基因地表达 是由调节蛋白操纵的，因此，调节蛋向的揭示或者说细胞逆境信息传递的研究无疑是一项 十分重要的工作。 6 中国农业大学硕士学位论文 水分胁迫信号的识别和转导 近年来，虽然有关细胞逆境信息传递的研究越来越多， ：作也越来越深入，但这些研 究提供的信息大多是零散和不系统的。目前，对细胞逆境信息传递的整体面目仍然没有一 个清晰、完整的了解。另外，有关细胞逆境信息传递的许多资料实际上都是关ra b a 信息 传递的研究。a b a 信息传递虽然是细胞逆境信息传递的重要组成部分，但本质上讲是属丁- 激素的信息传递。环境信号是非物质信号，其识别转导机制和植物激素应有本质区别。总 之，在植物细胞内，从水分胁迫信号的感知到各种基因表达这一信号传递链及其相关的信 号分子，还未得到广泛而深入的研究。 3 1 第二信使与水分胁迫信号转导 根据以往的研究表明，c 矿、质子( h + ) 、i p 3 和c a d p r 均可充当信号胞内传递的第二 信使。以水分胁迫导致气孔关闭为例来阐明这些信号分子的作用机理。气孔关闭可以理解 为：渗透活性可溶物从保翟细胞流出，尤其a b a 显著的是k 。流从液泡、胞质穿膜流出，结 果导致保卫细胞的膨压的f 降。尽管对c a 2 + 影响a b a 的初始来源还不清楚，但研究已表明， c a ”穿过质膜进入胞液，以及胞内储藏库释放c a ”，有助y - a b a 诱导的c a 2 + 浓度增加。c a 2 + 流通过a b a 诱导的非选择性离子通道进入胞内，而内源c a 2 + 库释放可通过l n 或c a d p r 的作刖。已经确认在气孔保卫细胞内有几种c a 2 + 可透过性通道的类型，包括：诱导伸k = 的 c a ”选择性通道；质膜上非选择性电压门控c a “通道；液泡膜上的慢通道( s l o w v a c u o l a r , s v ) ；c a d p r 诱导的c e + 通道；电压依赖的c a 2 + i 蘑i 酋( m a r t i nr 等1 9 9 7 ) 。另有证 据表明k + 通道对胞液p h 值( p h i ) 也具有依赖性，且a b a 可能通过胞液碱化而调控k + 通道，从而认为h 十也可能作为胞内第二信使( m i c h a e lr 1 9 9 7 ，m c a i n s h ，m r 等1 9 9 3 ) 。 3 2 水分胁迫诱导a b a 积累的信息传递 3 2 1 a b a 作为细胞内信号在水分胁迫应答基因的表达中起关键作用 应瑚某些技术和方法特别是a b a 缺陷型及a b a 不敏感型突变体研究证实，水分胁迫 7 中国农业大学硕士学位论文 诱导基冈的表达可分为两条主要途径：依赖a b a 的基冈表达途径和不依赖a b a 基冈表达 途径。依赖a b a 的基网表达途径本身义包括两条途径，即需蛋白重新合成的基因表达途符= 和不需要蛋白重新合成途径( g i m u d a t 等1 9 9 4 ，l n g r a m 等1 9 9 6 ，j e n s o n 等1 9 9 6 ，s h i n o z a k i 等1 9 9 4 ) 。在不需要蛋白合成的基因表达途径中，a b a 应答基因地激活子区域都含有一个 a b a 响应组件：a b r e 。a b r e 乖湘应的b z i p 家族转录冈子和如e m b p 1 结合即可促进a b a 应答基冈的转录。在需要蛋白合成的基因表达途径中，蛋白冈子的重新合成是a b a 诱导基 冈表达的前提因素。这类基因中不含有a b r e s ，其a b a 应答元件和m y c 家族转录因子结 合。编码m y c 家族转录因子的基因启动和m y c 家族转录因子合成是a b a 应答基因启动 的先决条件。 在不依赖a b a 的基因表达途径中，某些基冈可以被a b a 诱导只是a b a 不是基因表达 的必要条件之一( 1 n g r a m 和b a r t e l s1 9 9 6 ，s h i n o z a k i 和y a m a g u c h i s h i n o z a k i1 9 9 7 ，b r a y 1 9 9 7 ) 。如r d 2 9 a 即属于这个类型。r d 2 9 a 至少包括两个调控序列，一个是a b a 应答序列， 另一个是非a b a 应答序列。非a b a 应答序列是一个由9 一b p 组成的保守序列，t a c c g a c a t , 也称d r e c r e p e a t 序列，该序列对水分胁迫诱导的基因表达是必须的但不受a b a 的调控。 3 2 2 水分胁迫诱导a b a 积累的信息传递在水分胁迫诱发的信息传递中处于核心地位 a b a 之所以能成为关键的细胞逆境信号，其根本机制在于水分胁迫能够快速大量的诱 导a b a 的积累。水分胁迫诱导a b a 积累过程本身就包含了一系列的完整的细胞信息传递 过程，即水分胁迫原初信号的识别、转导、细胞内信息传递直至最后的编码a b a 生物合成 关键酶基因的启动，调控这一信息传递链中的任何一个环节都可以操纵a b a 的积累，因此 也就能够调控一批的水分胁迫应答基因的表达。显然，水分胁迫诱导a b a 积累得信息传递 在水分胁迫诱发的信息传递中处于核心地位。 如上所述，有关细胞逆境信息传递的研究尽管开展了很多工作，也揭示了很多信息系 统和信号组分，但这些研究多是从分子生物学入手，考察信号组分的基因表达是否影响环 境胁迫。值得注意的是，从细胞对环境胁迫的感知到信号组分的基因表达本身就是一个原 初的细胞信息传递过程，显然也是最重要的信息传递过程，对该过程的研究不仅可揭示a b a 信号起源的机制，更重要的是揭示水分胁迫原初信息传递的整体面目。 8 中国农业大学硕士学位论文 3 3 水分胁迫原初信号的识别 如果说水分胁迫诱导a b a 积累等原初信息传递过稃和是整个水分胁迫信息传递中最重 要的过群，那么水分胁迫原初信号的识别则是整个信息传递中最重要的步骤，冈为它是一 个总的开关，操纵着所有水分胁迫廊答基因的表达。目前人们对这个过程儿乎一无所知。 尽管如此，人们可以通过对原核生物或酵母的深入了解，对高等植物中水分胁迫的识别机 制提出某些设想。s h i n o z a k i 和y a m a g u c h i s h i n o z a k i ( 1 9 9 7 ) 认为水分胁迫的识别机制有儿种 可能，一是类似原核生物中双组分系统的组蛋白激酶渗透感应器，二是类似酵母细胞s h o l 渗透感应器，三是自由基产生体系，四是物理张力。在以上四种可能性中似乎渗透感应 机制的可能性最大。这一方面是因为，原核生物中双组分系统的渗透感应机制已了解的相 当透彻，另一方面，u r a o 等人( 1 9 9 9 ) 的确在高等植物拟南芥中发现了类似戏组分系统的 渗透感应器a t h k l 。 细胞火水引起膨压变化，膨压曾被认为是引发脱落酸合成的原初因子。而u r a o ( 1 9 9 4 ) 利川拟南芥测定细胞膨压与生理反应的关系时，并没有发现细胞内存在“膨压感受器”，而 可能存在“渗透感受器”。“烈组分系统”是细菌中广泛存在的“渗透感受器”，由e n v z 和 o m p r 两种蛋白组成。前者是一个组氨酸激酶，在高渗透环境下能发生自身磷酸化，起感应 器的作用；后者是反应调节器，含有天冬氨酸残基，能接受来自e n v z 的磷酸根而被磷酸化， 磷酸化的o m p r 可作为转录因子而将来自e n v z 的信号输出。酵母中也有类似的“双组分系 统”，磷酸化的反应调节器可激活m a r p k 级联系统而诱导渗透保护性物质的合成。拟南芥 中有一种蛋白能被水分胁迫激活，这种蛋白与酵母“渗透感应器”有同源性：乙烯受体e t r l 类似于细菌双组分系统的组氨酸激酶，位于e t r if 游的c t r l 则是m a p k 级联环节的一 部分。最近在拟南芥中又找到了“双组分系统”的另一部分“反应调节器”，因此植物 也有起“感受器”或“受体作用”的双组分系统。此外，m a e d a ( 1 9 9 5 ) 曾报道另一种跨越膜 感受器s h o i p 蛋白，该蛋白含有4 个堆在一起的疏水跨膜多肽，其碳端在胞外，在高渗透 条件下，它能激活m a p k a 级联系统，s h o l p 也有可能成为植物的另一种类型的“渗透感受 器”。 在大肠杆菌种，细胞对渗透胁迫的反应是由“双组分系统”完成的。组氨酸蛋白激酶 e n v z 为渗透感应器，它可识别渗透势的变化，e n v z 通过磷酸根的传递激活“响应调节蛋白” 9 中国农业大学硕士学位论文 o m p r 。o m p r 赢接作为转录因子直接激活有关基因从而使细胞产生适应渗透胁迫的生理、 生化反应。台：酵母细胞中也存在类似的渗透感应器s l n l 。s l n l 识别渗透胁迫后可将信号 传递给m a p k 信息传递系统，m a p k 信号传递系统f 游信号组分p b s 2 ( m a p k k ) ， h o g l f m a p k ) 激活后即可激活转导基冈地表达，使细胞产生适应渗透胁迫的生理、生化反 府。如上所述，u r a o 等从拟南芥中分离得到一个组蛋白激酶的c d n a 克隆a t h k i 。a t h k l 可以当补酵母渗透感应器( s l n l ) 平( s h 0 1 ) 突变体。这些结果说明渗透感应器可能在高 等植物至少在拟南芥渗透胁迫的识别的信号转导中起作用。s h i n o z a k i 和 y a m a g u c h i s h i n o z a k i ( 1 9 9 7 ) 认为水分胁迫的识别可能和渗透胁迫的机制是一致的，原因是 水分胁迫可引起跨细胞质膜的渗透势变化。本实验室最近的研究表明，水分胁迫的识别可 能并不是渗透甘油机制，原因是细胞渗透势的改变不一定能够触发水分胁迫诱导的a b a 积 累，细胞质膜张力变化可能才是水分胁迫信号的识别机制( j i a 和z h a n g ，2 0 0 1 ) 。有兴趣的 是，细胞擘可能参与水分胁迫信号的识别过程，原因是细胞壁在b 法荫平诱发的细胞质膜 张力变化过程有重要作用( 贾文锁等2 0 0 1 ) 。 3 4 可逆蛋白磷酸化与水分胁迫信号的转导 由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的可逆蛋白磷酸化无论在动物细胞还是植物细胞的信息 传递中都起核心作川。越来越多的资料表明环境胁迫可诱导许多蛋白激酶或蛋白磷酸酶基 因的表达( i n g r a i n 和b a r t e l s1 9 9 6 ，m i z o g u c h i 等1 9 9 7 ，s h i n o z a k i 和y a m a g u c h i s h i n o z a k i 1 9 9 7 ，l e u n g 和g i r a u d a t1 9 9 8 ，n e i i 等1 9 9 9 ，l i u 等2 0 0 0 ) 。在拟南芥中，干旱和盐胁迫 可以快速诱导来年各种钙依赖蛋白激酶( c a l c i u m d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e c d p k ) 基因的表 达即a t c d p k l 币la t c d p k 2 ( u r a o 等1 9 9 4 ) 。s h e e n ( 1 9 9 6 ) 将a b a 、盐胁迫和冷胁迫应答 基因h v a l 的启动子和一个报告基因组成的融合基因导入玉米原生质体，同时将组成形表 达的a t c d p k l 基因导入玉米原生质体，结果表明a t c d p k l 编码的蛋白激酶c d p k 可以接 到h v a l 报告基因的表达，说明c d p k 可参与a b a 、冷和盐胁迫引发的细胞信息传递。 1 0 中国农业大学硕士学位论文 4 酪氨酸蛋白可逆磷酸化在细胞信号转导中的可能作用 绝人多数磷酸化修饰发生在丝氦酸( s e r ) 和苏氮酸( t h r ) 残基上。在1 9 8 0 年之前， 一直认为只有磷酸丝氨酸和苏氦酸才能自发发生氨基酸的磷酸化。然而，自从劳氏肉瘤病 毒的转化蛋白即p p 6 0 ”被确认有酪氨酸蛋白激酶( p t k ) 活性之后磷酸酪氨酸( p t ) 开 始受到越来越多的重视( h u n t e rt 和c o o p e r ja 1 9 8 5 ) 。1 9 8 8 年后，e h f i s c h e r 实验室在人 的胎盘细胞中分离纯化了第一个酪氨酸蛋白磷酸酶( 现称p t p i b ) ( 1 9 9 1 ) 。之后的短短儿年 内，已有4 0 多种同功酶相继纯化或基因克隆。 4 1 酪氨酸蛋白激酶和磷酸酶的分类 目前己发现三种类型的p t k ( m a u r ol 和d i x o nje1 9 9 4 ) 。第一类是指病毒癌基因和正 常细胞癌基因编码的p t k ，它们主要分布在细胞浆和内膜系统上。第二种类型与某些生长 因子和激素受体有关，这些受体本身就是p t k ，它们是介导相应生长因子和激素效应的质 膜上的信号转换机构。第二类则包括与前两类不同的其它类型的p t k ，如p 7 5 是从大鼠肝 脏得到的一种分子量为7 5 k d 的p t k ，因而称之为p 7 5 ( h u n t e rt 和c o o p e rja1 9 8 5 ) 。从 结构上讲不但各类p t k 在氨基酸顺序上表现出一定的相似性，而且与其它蛋白激酶之间也 有一定的同源性。 p t p 经常被分为三种( s t o n el 等1 9 9 4 ) ：1 ) 受体类型p t p ：2 ) 胞内p t p ：3 ) 双重底物 特异性的p t p 。受体类型p t p 结构的共同特征包括：( 1 ) 可变长= 度和组成的胞外区域；( 2 ) 单一跨膜区域：( 3 ) 一个或两个胞内催化区域。胞内p t p 的结构特征是：( 1 ) 单一的催化 区域；( 2 ) 多样的n 端和羧基端伸展区。这些伸展区具有类似的信号肽的氨基酸顺序，它 将p t p 分送到细胞的特定位置。双重底物特异性的p t p 是胞内p t p 的一个特殊分类。它与 痘苗病毒的开放阅读框h 的产物具有最多的序列同源性。在p t p 中唯独这些酶不仅能以磷 酸酪氨酸为底物而且还能以磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸为底物。所有p t p 在结构上的共同点 是它们在催化域中的氨基酸顺序极为相似，共有2 4 0 个氨基酸，内含，h c x a g x g r ( s t ) g ，的特征序列，该序列第二位二 胱氨酸( c ) 中的巯基对p t p 酶的活性是必须的。 中国农业大学硕士学位论文 4 2 酪氨酸蛋白可逆磷酸化在酵母和动物细胞信号转导的研究 真核细胞中的生长网子，如e g f 、p d g f 、胰岛素的受体，本身就具有p t k 活性。生 长网子参与细胞的生长、增殖、分裂和分化等众多生理过程，而介导它的功能的受体在这 些过程中具有至关重要的地位( h u n t e r t1 9 8 7 ) 。在目前发现的酪氨酸蛋白激酶中，对具有受 体功能的酪氨酸蛋白激酶( r p t k ) 的结构与功能了解得最为清楚，它是与信号转导密切相 关的。在寻找酪氨酸蛋白激酶的生理底物时发现r p t k 的几种底物在细胞信号系统中都具 有重要的作用。r p t k 还参与一些信号转导途径的启动，如r p t k 激活磷酸肌醇酯酶( p i c ) 的一种同功酶p l c v ，然后水解i p 3 和d g ，引起双信使途径。近年来揭示了r p t k 启动的 一种重要途径，即r a s 途径。它是多种生长因子，包括e g f 、p d g f 、胰岛素、神经生长因 子等，实现其功能所具有的信号传递通路，在细胞信号转导网络中占有重要位置( 刘永学等 1 9 9 6 ) 。 p t p 的生理功能虽不完全清楚，但在细胞中与p t k 相互拮抗是肯定的。例如，在某些 体系中p t p 具有肿瘤抑制的作用( s t o n er l ，d i x o nj e 1 9 9 4 ) 。此外，p t p 在许多动物和酵 母的信号转导途径中起重要作用。c d 4 5 作州一种细胞表面抗原，是最早发现的受体类型 p t p ，在免疫t 细胞和b 细胞中含量很高，它在这两类细胞的活化中具有重要的作用，能 主动通过脱磷酸化而启动相应的信号系统。一些胞内p t p 与动物细胞的活化生长因子受体 相互作用。 由r 两性p t p 不仅水解p t 单酯而且还水解s e 胛h r 单酯，所以它在p t p 中是很有独特 性的( f a n t lwj 等1 9 9 3 ，v a nd e g r e ep 和h u n t e r t1 9 9 4 ) 。两性p t p c d n a 克隆已经从许多 有机体内分离出去，这包括酵母，痘病毒和哺乳动物。m a p k ( 促分裂原活化蛋白激酶) 在 许多信号转导途径中起着重要的作用。m a p k 的活化是依靠相邻t v r 和t h r 残基的磷酸化。 数据表明，许多m a p k 的同功酶在特定的细胞内表达，且每一种都具有特定的细胞功能。 许多两性p t p 不论在体内还是在体内对活化了的m a p k 同功酶均具活性。在每种情况f ， 两性p t p 使m a p k 同工酶去磷酸化则导致m a p k 活性丧失。令人感兴趣的是，两性p t p 和m a p k 同工酶一样大多数都能在特定的细胞类型存在。一些胁迫激活的p k ，如m a p k ， 在t h r 利t y r 残基受磷酸化的机会几乎是均等的。此外，这些磷酸化作用对激酶活性来说 是重要的。这些分子将有可能被证实是两性p t p 的底物。 1 2 中国农业大学硕士学位论文 4 3 酪氨酸蛋白可逆磷酸化在植物细胞信号转导中的研究进展 p t k 利p t p 住调控动物细胞生长和分化以及信号转导系统中具有重要作t l 。然而，在 高等植物体内，却不址对此类酶的描述。对丁它们是否植物体内还存在争议。近米年的研 究发现，在高等植物体内存在许多m a p k ，而且，在有些情况f ，植物体内m a p k 的激 活和动物体内一样伴随着酪氨酸的磷酸化作用。这些数据表明在高等植物体内可能存在有 这种酶，它能使底物蛋白( 如m a p k 上的酪氨酸残基) 去磷酸化。c h e n g ( 1 9 8 9 ) 1 g e l l a t b ，( 1 9 9 4 ) 分别在小麦幼苗和马铃薯块茎中检测到具有p t p 活性的蛋白。h e i m o v a a r a d i j k a t r a ( 1 9 9 6 1 等报道，p t p 专性抑制剂p a o 参与a b a 诱导基因表达及大麦蛋白磷酸化作用。这表明了 p t p 参与a b a 信号的传递。最近有人从拟南芥中分离出种e d n a 编码的蛋白具有p t p 活性，并认为该蛋白可能在植物逆境反应中起定作用。 中国农业大学硕士学位论文 材料与方法 一、玉米幼苗胚芽鞘细胞中酪氨酸磷酸( p t ) 的亚细胞定位及其与水 分胁迫的关系 l 。材料： 农大1 0 8 玉米种经2 次氯酸钠消毒5 0 m i n 后，清水洗净，沙中3 0o c h 音箱培养，5 6 天当胚 芽鞘k = 3 , - - 4c m 时进行如f 实验。 2 方法 2 1 失水处理 称取1 0 9 胚芽鞘，在空气中自然失水至3 0 厉，放在1 0 0 湿度的容器中温育6 小时后t 进行p t 定位。对照为没有失水胁迫的材料。 2 2 玉米幼苗胚芽鞘中酪氨酸磷酸( p t ) 的亚细胞定位方法 2 2 1 组织包埋块的制备 ( 1 ) 取对照或处理的玉米胚芽鞘，刚双面刀片分割成3 卅m m 2 的小块： ( 2 ) 用预冷的固定液( 含4 多聚甲醛，2 5 戊_ 二醛的磷酸缓冲液p h 7 2 ) 4 。ci l i 定4 小时； ( 3 ) 放在预冷的磷酸缓冲液中洗三次，每次3 0 m i r a ( 4 ) 依次州3 0 、5 0 、7 0 、8 0 和9 0 的乙醇在4 c 下脱水，每次2 0 m i n ，之后用无 水乙醇脱水3 次，每次1 小时； ( 5 ) 依次用2 ：l 、 1 ：1 、 l ：2 的乙醇：k 4 m 置换各1 小时，最后再纯的i ( 4 m 中浸透过夜； ( 6 ) 进行包埋后，在2 0 c 紫外光照射f 聚合4 8 小时，室温聚合2 4 4 8 小时。 2 2 2 切片 包埋块切成超薄切片，捞在覆有f o r m v a r 膜的1 0 0 目铜镍网上 2 2 3 胶体金免疫染色程序 ( 1 ) 超薄切片用0 5 胰蛋白酶t b s ( o0 1 mt r i s h c ip h 7 5 ，0 1 5 mn a c i ，0 1 c a c l 2 ) 室温f 处 理5 m i r a 1 4 中国农业大学硕士学位论文 ( 2 ) 刚t b 洗3 次，每次5 m i n ； ( 3 ) 川t b s t g ( 含3 7 4m g m l 甘氮酸的t b s t ( t b s + 0 】t r j t o n x 一1 0 0 ) ) 在室湍f 阻断 3 0 m i r a ( 4 ) 将切片川1 ：1 0 0p t 抗体t b s t g g s ( t b s t g + l 正常羊血清) 2 5o c 下孵育2 小时； ( 5 ) t b s t 洗3 次，每次】5 r a i n ； ( 6 ) 1 ：5 0 胶体金标记羊抗鼠t b s t 溶液中室温孵育2 小时； ( 7 ) t b s t 洗3 次，每次1 5 m i n ，再用蒸馏水洗3 次每次1 5 m i n ； ( 8 ) 用含2 醋酸铀的5 0 乙醇溶液在2 5o c 下染色3 0 m i n ，然后用重蒸水洗： ( 9 ) 川柠檬酸铅在2 5 cf 染1 5 m i n ，用重蒸水充分洗涤； ( 1 0 ) 透射电镜观察。 二、玉米胚芽鞘细胞核的制备 1 材料 玉米胚芽鞘的培养方法同上。 2 方法 21 失水处理 方法同上。 2 2 1 细胞核的制备( 方法一) 取1 0 9 材料放入预冷的烧杯中，加入1 0 0m l 冷乙醚，3 0 秒后立即倒去冷乙醚，迅速朋冷的 分离液( 1 m 蔗糖1 0 m m t f i s h c l ，5 0 m m 巯基乙醇，5 m m m g c l 2 ，0 5 m m d t t ，0 1m m e d t a 2m m n a v 0 3p h 7 6 ) 洗涤3 次。将胚芽鞘加入组织捣碎机，并加入1 0 0m l 分离液，低速 匀浆0 5m i n ，快速1m i n 。匀浆液经二层纱布和1 0 0 目、4 0 0 目不锈钢网过滤，以除去组织 碎片和细胞。滤液在o 和4 0 0 0 g 下离心5 m i n ，弃上清，沉淀悬浮在含有1 t r i t o n x 1 0 0 分离液内，并用玻璃匀浆