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河南农业大学硕士学位论文产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究 摘要 通过好氧、厌氧和兼性厌氧三种不同培养条件的初筛和发酵复筛，在兼性厌氧条件下获 得了三组可以快速、高效降解滤纸的复合菌群，其中m 0 的c m c a s e 酶活最高达1 3 6 i u 。 对m o 菌群纤维素酶酶学特性的研究发现：酶最适反应温度为6 0 ，最适p h 值为7 o ， 且在6 0 以下和p h 3 - 8 范围内具有良好的热稳定性和p h 稳定性；钴、锌、铜等金属离子对 纤维素酶活有显著的抑制作用，最高可达4 7 ，钠和钾离子有激活作用，酶活分别提高7 和2 。在最适反应条件下，纤维素酶的最高c m c a s e 活性可达2 1 3 i u ( 蛋白胨为氮源) 。微 晶纤维素、发酵料和粉碎甜高粱秆作为碳源能不同程度的提高产酶，而c m c 、粉碎玉米秆和 酒糟对产酶有显著抑制作用。以酵母粉和牛肉膏对产酶具有极大的激活作用。分别是蛋白胨 产酶量的2 4 2 倍和2 3 7 倍，而尿素、氯化氨和硫酸氨等无机氮源不利于产酶。 通过研究菌群内部不同生长阶段p h 、酶活和失重率的动态变化及其相互关系，初步了 解了菌群内部不同功能菌株在不同生长阶段的主导地位的变化。非变性凝胶电泳对酶谱分析 共发现了七条活性酶谱条带。d g g e 分析初步揭示了降解周期中菌群组成变化。 利用纤维素选择培养基分离得到了三株可培养的纤维素降解菌，1 6 s r d n a 序列分析表明 它们分别与u r e i b a c i l l u st h e r m o s p h a e r i c u s 、b r e v i b a c i l l u sb o r s t e l e n s i s 和b a c i l l u ss p 5 0 l a y 3 的亲缘关系最近，序列相似性分别达到9 9 、1 0 0 和9 9 。 关键词：纤维素酶；菌群；活性电泳；d g g e ；菌种鉴定 1 河南农业大学硕士学位论文产纤维索酶茵群的筛选及其酶学特性研究 i s o l a t i o no fam i c r o b i a lc o m m u n i t yp r o d u c i n gc e l l u l a s ea n dt h e a n a l y s i so ft h ee n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c s s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f is o n ga nd o n g p r o ll is h iz h o n g m a s t e rc a n d i d a t e ：gl c i a b s t r a c t ：am i e r o b i mc o m m u n i t yw a si s o l a t e dt h r o u g ht h r e ed i f f e r e n tc u l t u r e c o n d i t i o n s ，i n c l u d i n ga e r o b i c ，a n a e r o b i ca n df a c u l t a t i v ea n a e r o b i c t h r e ef a s ta n d e f f e c t i v ec o m m u n i t i e si nf a c u l t a t i v ea n a e r o b i cc o n d i t i o nw e r eo b t a i n e df i n a l l y t h e m oo ft h e s et h r e ec o m m u n i t i e sh a v em a x i m a lc m c a s ea c t i v i t yu pt o1 3 6i u t h ec h a r a c t e r i s t i e so fc e l l u l a s eo ft h em oc o m m u n i t yw e r er e s e a r c h e d t h e o p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dp ho fm 0 sc m c a s ew e r e6 0 a n dp h7 0 r e s p e c t i v e l y c m c a s ea c t i v i t yw a sn o tr e d u c e dw h e nt h em oe n z y m el i q u i dw a sk e p t b e l o w6 0 o ru n d e rp h3 8 f o r3 0m i n u t e s c m c a s ea c t i v i t yw a si n h i b i t e db yc o b a l t ， z i n ca n dc o p p e ra n d4 7 o fw h i c hc o u l db er e d u c e d s o d i u ma n dp o t a s s i u mi o n s e n h a n c e dt h ee n z y m ea c t i v i t yb y7 a n d2 r e s p e c t i v e l y c m c a s ea c t i v i t yw a s2 1 3 i uu n d e rt h i so p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n ( p e p t o n ea st h es o u r c eo fn i t r o g e n ) c a r b o n s o u r c e ，f o re x e m p l e 。m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ( m c c ) ，f e r m e n t e ds a c c h a r i n e s o r g h u ms t a l ko rc r u s h e ds a c c h a r i n es o r g h u ms t a l kc o u l di n d u c et h ep r o d u c t i o n c e l l u l a s e ，w h i l ei tw a si n h i b i t e db yc m c ，c r u s h e dc o r ns t a l ka n dv i n a s s e c o m p a r e d t op e p t o n e ，y e a s te x t r a c ta n db e e fe x t r a c ta sn i t r o g e ns o u r c ec o u l de n h a n c et h e c e l l u l a s ea c t i v i t yb y2 4 2a n d2 3 7t i m e s ，r e s p e c t i v e l y w h n ei n o r g a n i cn i t r o g e n s o u r c eu r e a ，n h 4 c 1a n d ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，w e r eh a r m f u lt oc e l l u l a s ep r o d u c t i o n d y n a m i cv a r i a t i o no fp h ，c m c a s ea n df i l t e rp a p e rd e g r a d a t i o nr a t i od u r i n g m 0 sc u l t u r ep e r i o dw a ss t u d i e da n dt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h e mw e r ea l s o a n a l y z e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a te a c hf u n c t i o ns t r a i n sp l a y e dad i f f e r e n td o m i n a n t r o l ei nt h ed i f f e r e n tg r o w i n gp h a s e s e x t r a c e l l u l a rp r o t e i n so fm 0w e r es e p a r a t e db y n a t i v e - p ! f 气g e a n dw e r er e a c t e dw i t ha g a r o s eg e lc o n t a i n i n gc m ci n s i t uf o r3 0r a i n s t h i sa g a r o s eg e lw a sl a t e rs t a i n e db yc o n g or e da n ds e v e n a c t i v i t yp r o t e i nb a n d sw e r e o b s e r v e d p c r d g g er e s u l t si n d i c a t e dt h ec h a n g eo ft h ef u n c t i o ns t r a i nc o m p o s i t i o n o fm 0d u r i n gt h ec u l t i v a t i o n f i v ef u n c t i o nb a c t e r i aw e r ei s o l a t e do nt h em e d i u mw i t hc e l l u l o s ea ss o l ec a r b o n s o u r c e t h i e eo ft h e m w e r em o s tr e l a t e dt ou r e i b a c i l l u s t h e r m o s p h a e r i c u s ， b r e v i b a c i l l u sb o r s t e l e n s i sa n db a c i l l u ss p 5 0 l a y 3r e s p e c t i v e l ya c c o r d i n gt ot h e16 s r d n as e q u e n c e s ，w i t ht h es i m i l a r i t yo f9 9 ，1 0 0 a n d9 9 k e yw o r d s ：c e l l u l a s e ；m i c r o b i a lc o m m u n i t y ；n a t i v e p a g e ；d g g e ；i d e n t i f i c a t i o n 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论产纤维素酶菌群的筛选学位 硕士 文题目及其酶学特性研究级别 学生 王磊 学科导师宋安东 姓名专业 微生物学 姓名李十中 学位论文 如需保密，解密时间 年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：王袭繇粥导师签名：吖少 日期：。c 年6 月j 。日日期：c 年石月d 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本 和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开 河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为 河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学 所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：互磊 导师签名：缮槲学院领导签名； 。 日期：o t i 年月f o 日日期：( 一年6 月勿日 日期：年 月 日 致谢 时间总是很快，回首我硕士的三年学习生活，最要感谢的莫过于宋安东导师 和李十中导师。正是两位导师的努力才使我有机会在两个实验室里工作和学习。 农大给我打下了坚实的实验基础，清华给我提供了展现自己的平台。但是更重要 的是两位导师对我实验的悉心指导，无论是实验思路开拓性的建议，还是实验技 术细节上的帮助，都让我受益匪浅! 而两位导师积极的工作态度和对工作热情的 投入，更让我学到了一种积极的心态和珍惜时间的态度，让我重新审视自己，受 益终身! 在农大的时间里，我完成了理论和基础试验技能的学习，在此期间很多老师、 实验室的同门和同学都对我给予了极大帮助，在此对他们表示真诚的感谢! 他们 是实验室的王风芹副教授和谢慧老师，导师组的贾新成教授、吴坤教授、邱立友 教授、陈红歌教授及微生物学系的全体教师；实验室的师兄张建、任天宝、裴广 庆、陈伟、冯锋，师姐冯冲、王艳颖，以及楚乐然、刘杰、薛仁军、刘玉博、何 江华、刘兆云、祖向阳、王宝等同班同学，师弟张雷鸣、万续良，师妹张莎莎、 张玲玲、田原等同学。对于他们的大力帮助和支持，再次表示衷心感谢! 清华的日子是清苦的，更是快乐的。从陌生到熟悉，从身单影只到其乐融融， 因为有他们，山中的岁月，从此笑声连连、球影闪动。他们对我实验无私的帮助， 对我生活的关怀，我永远铭记。在此对他们表示真诚的感谢! 他们是李天成副教 授、杨清敏老师、仉磊博士、王二强博士、张晗星博士、郑焕娣博士、章晓庆博 士、刘晓玲博士、刘学军博士以及耿欣、韩冰、李涛、杜然、米阳、冯全周、宁 尚勇、刘苗苗、晋明芬、鲁亚霜、孟武、封文涛、唐俏瑜、赵于等同学。再次表 示由衷的感谢! 要特别感谢我的父母和家人，正是你们的辛勤哺育和谆谆教导帮助我完成学 业。真心的感谢你们! 王磊 2 0 0 9 年4 月 河南农业大学硕士学位论文 产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究 第一章文献综述 l 纤维素研究概述 纤维素是自然界中存在的最广泛的一类碳水化合物，也是地球上最廉价、最丰富的可再 生资源，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。估计每年全世界的植物体生成量高达1 5 0 0 亿吨的干物质，其中纤维素总量约为5 0 【l l 。 纤维素分子是由成千的d 六环葡萄糖残基通过b 1 ，乒糖苷键联结而成的链状聚合体【z j ， 基本重复单位是纤维二糖( 图1 1 ) 。几十个纤维素分子平行排列组成小束，几十个小束组 成小纤维，最后由许多小纤维构成一条植物纤维素【3 】，分子量可达到几十万甚至几百万。纤 维素分子的经验式为( c 6 h 1 0 0 5 ) n ，其中n 是葡萄糖苷键数目，通常称为聚合度( d p ) ，n 可以 为1 0 0 0 1 0 0 0 0 ，甚至更大。纤维素分子中含碳4 4 4 4 ，氢6 1 7 ，氧4 9 3 9 。纤维素是一 种结晶不完全的天然高分子化合物，分子链排列规整的部分形成结晶区，不规整的部分形成 无定形区【4 1 。 图1 - 1 伊六环葡萄糖残基通过6 - 1 ，4 糖苷键联结构成纤维素分子嘲 f i g 1 1 c e l l u l o s ec o n s i s t so fd - g l u c o s er e s i d u e sb y8 1 , 4g l u c o s i d i cb o n d # i 纤维素广泛存在于植物如树干、草秆、竹秆、甘蔗渣中，是植物细胞壁的主要成分，对 植物体具有支持和保护作用。纤维素是棉纺业和造纸业的主要原料，经过加工处理可制造人 造棉和人造丝；纤维素经浓硝酸处理后可形成硝化纤维素，是制造炸药的原料；纤维素与醋 酸结合成的醋酸纤维素是照相胶卷、人造丝以及多种塑料的原料；农业上可利用绿色木霉等 微生物处理秸秆，使纤维素部分水解，用作牲畜饲料；科学家还研究利用纤维素酶水解纤维 素生产酒精以代替石油；纤维素不能为一般动物直接消化利用，但能为若干微生物消化分解， 对人类无营养价值，但有刺激肠道蠕动的生理作用，故又是膳食中不应缺少的成分【6 j 。 纤维素具有分子排列整齐的结晶区和相对不规则、松散的无定形区。结晶纤维素片断的 致密结构，使得纤维素不溶于水，且比其它葡萄糖聚合物更难降解。纤维素的结晶性决定了 纤维素材料被纤维素酶水解的程度。此外，木质素和半纤维素形成牢固的结合层，紧紧地包 围着纤维素，阻碍纤维素酶与它的接触，限制了纤维素酶活性的发挥，这是影响酶反应活性 的另一个重要原因。目前，自然界中纤维素只有一小部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅 2 傩 吨h 卜舭 啦一_ 弋c _ 7 h _ 蝠 鼻；h 拶 媳 河南农业大学硕士学位论文产纤维索酶菌群的筛选及其酶学特性研究 被白白浪费，而且还造成了环境污染忉。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的 能源、食物和化工原料，对于解决环境污染、食物短缺和能源危机等社会问题具有重大的现 实意义i 引。 2 纤维素降解微生物 2 1 纤维素降解真菌 真菌是最为人们所熟知的纤维素降解微生物，从低等厌氧真菌到高等担子菌。真菌中一 些最原始的种类，如厌氧的壶菌纲( c h y t r i d o m y c e t e s ) ，能在反刍动物的胃肠道中降解纤维 素。根据游动游离孢子的形态和真菌菌丝的形成方式，可将壶菌划分为多分裂的包括 c y l l a m y c e s 、a n a e r o m y c e s 和o r p i n o m y c e s ；单分裂的包括c a e c o m y c e s 、n e o c a l l i m a s t i x 和 p i r o m y c e s 三个属。在7 0 0 多种的接合菌中，只有毛霉具有较强的降解能力，主要针对的是 可溶性的底物。而子囊菌、担子茵、半知菌中包含大量纤维素降解菌。其中b u l g a r i a ， c h a e t o m i u m ，和h e l o t i u m ( a s c o m y c e t e s ) ；c o r 幻l u s ，p h a n e r o c h a e t e ，p o r i a ，s c h i z o p h y l l u m 和s e r p u l a ( b a s i d i o m y c e t e s ) ：以及a s p e r g i l l u s 、c l a d o s p o r i u m 、f u s a r i u m 、g e o t r i c h u m 、 m y r o t h e c i u m 、p a e c i l o m y c e s 、p e n i c i l l i u m 和t r i c h o d e r m a ( d e u t e r o m y c e t e s ) 等由于产生纤维 素酶或者具有降解木材的能力很强，已经被深入研究【9 】。其中研究最为详细的模型微生物是 t r i c h o d e r m ar e e s e i ，第一次被分离是在二战期间【1 0 1 ，先是被归为z v i r i d e ，后来发现其在形 态学上与其它t v i r i d e 不同，因此根据其发现者e l w y mt r e e s e 的名字而重新命名。后来发 现z r e e s e i 为h y p o c r e a j e c o r i n a 的无性衍生物【1 1 1 。 2 2 纤维素降解细菌 如果从生理学角度来看，纤维素降鳃细菌主要分为以下几类：( 1 ) 可发酵的厌氧菌，主 要是革兰氏阳性( c l o s t r i d i u m 、r u m i n o c o c c u s 和c a l d i c e l l u l o s i r u p t o r ) ；( 2 ) 好氧革兰氏阳性 细菌( c e l l u l o m o n a s 和t h e r m o b i f u t a ) ( 3 ) 好氧滑动细菌( c y t o p h a g a 和s p o r o c y t o p h a g a ) 。 只有少量的上述细菌具有活跃的纤维素降解能力。最近发现非纤维素降解菌c l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u m 拥有一套完整的纤维素酶基因簇却并不表达，对其进行深入研究可能会有更 多的发现【1 2 】。 2 3 纤维素降解放线菌 对降解纤维素的放线菌研究相对较少，早期工作局限于分类学、生态学。直到8 0 年代 末期才有相关纤维素酶类性质的比较。对纤维素降解能力最强的是放线菌中的小单孢菌。近 年来，从堆肥中分离出了多种高温单孢菌，如弯曲高温单孢菌和褐色高温单孢斟1 3 1 。 2 4 不可培养的纤维素分解菌 自然界存在的微生物种类据估计在1 0 5 1 0 6 之间【1 4 】，但目前为止通过实验室培养的方法 能够获得纯培养的只占很小部分。通过改善培养条件从自然环境中分离更多的微生物虽然有 一定效果，但总的来看进展很缓慢，因为对天然生境的完全模拟是很困难的。对不可培养微 生物的认识是一个渐进的过程，从微生物认识以前对微生物的不自觉地利用，到培养方法的 3 河南农业大学硕士学位论文产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究 改进引起可培养微生物数量的剧增，一直到核糖体小r n a 分析的出现使得真正研究不可培 养微生物成为可能【1 5 】。通过1 6 s 或者1 8 s 序列分析，我们对于自然界中微生物的认识在深 度和广度上，都有了质的飞跃。现在随着新的宏基因组技术的出现，使得不依赖于培养，直 接从自然生境中寻找特定功能或者序列的基因成为可能。对于纤维素降解菌的纤维素酶研 究，主要通过构建土壤的宏基因组库，筛选编码纤维素酶基因的重组子克隆表达。国内相关 研究也在开展，四川大学的研究小组构建了6 个环境微生物宏基因组文库，并从文库中筛选 到了1 4 9 个表达纤维素酶活性的克隆，测序鉴定了其中1 9 个纤维素酶基因，高效表达了5 个纤维素酶基因。 然而，目前对于不可培养微生物的纤维素酶研究还刚刚开始，对环境中宏基因组的分析 并不能解决所有问题。一方面，纤维素酶基因的外源表达技术并未成熟，因此克隆表达的蛋 白并不能反映其天然活力，在筛选高活力纤维素酶的时候会遇到困难。另一方面，基因表达 与否、表达量、以及翻译后修饰都会影响最后的产物蛋白，因此对于基因的分析并不能反映 此生境中纤维素酶的存在状况，有可能会得到误导性的结果。此外，真核基因的不连续性增 加了其被筛选的难度。 2 5 复合纤维素降解菌群 最近的一个研究热点就是复合微生物菌群，这些菌之间相互协作，提供营养，移走有害 物质，通过物理和生化活动来提高它们生理上的优势【1 6 1 。例如，当巴西固氮螺菌和糖或聚 丙烯酰胺降解菌( p d b ) 混合使用时，构成一个代谢组合，在这个组合里，糖降解菌产生降 解物和发酵产物，这些能被固氮螺菌作为碳源，而固氮螺菌为p d b 提供氮源。这些组合还 有固氮螺菌和纤维单胞菌( c e l l u l o m o n a s ) ，后者能降解纤维素；固氮螺菌和芽孢杆菌，后者 能降解胶质，固氮螺菌和阴沟肠杆菌( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) ，后者能发酵葡萄糖。 纤维素降解菌群构建的最初方法是利用人工方法筛选单个纤维素降解菌，或将几个菌进 行简单组合，但该方法构建的复合菌群很难完成纤维素的降解、转化，同时由于驯化和应用 条件不同，人工筛选和驯化的菌在自然环境中的生长受到了抑制，说明单个菌或简单组合的 菌群对环境的适应能力较差。高降解能力和降解稳定性可通过复杂的微生物菌系得到，在稳 定的微生物菌系中，不同微生物之间存在密切而复杂的物质和能量代谢关系，可以使不同的 微生物获得相对稳定的生存环境，对环境的变化具有比较强的适应能力。因此，可以利用微 生物菌系中的各种微生物分解堆肥中复杂的有机物，同时保持菌系的稳定性和对环境的适应 性。 崔宗均等旧以纤维素( 滤纸和秸秆) 作为碳源，通过驯化从作物秸秆和畜禽粪便的堆 肥中筛选到高效、稳定纤维素降解菌系m c l 。将菌系m c l 用于作物秸秆和畜禽粪便堆肥， 可以加速堆肥进程，将堆肥时间从3 个月缩短为2 个月。研究表明在纤维素的降解过程中， d g g e 图谱条带的变化表明微生物菌群的种类和数量在发生变化。在最初4 天，条带b 、c 、 d 和e 占主导，随后条带a 和f 出现并占主导，而条带b 、c 、d 和e 消失【1 8 】。对条带p c r 4 河南农业大学硕士学位论文产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究 扩增产物碱基顺序进行分析，发现a 属于ct h e r m o s u c c i n o g e n e s ，为严格厌氧菌，这种菌存 在于各种生活环境中，能够利用寡糖通过发酵产生乙酸盐、乳酸盐和氢气，然而不能利用纤 维素和木聚糖进行生长。条带c 、d 和e 之间序列相似，来自于同一菌株的不同操纵子，属 于b r e v i b a c i l l u ss p ，b r e v i b a c i l l u s 属细菌，是严格好氧菌，可利用各种糖产生酸，与条带c - e 相对应的细菌可能与糖的消耗和初期有机酸的产生有关，它们所利用的糖来自于稻草的降 解。b 和f 分别属于b o r d e t e l l as p 和p s e u d o x a n t h o m o n a $ 。b o r d e t e l l a 属细菌严格好氧或兼性 厌氧，不能水解蔗糖的非发酵性细菌，不能利用葡萄糖、木糖或纤维二糖；p s e u d o x a n t h o m o n a s 属细菌是好氧菌。d g c 迅分析结果表明，好氧及兼性好氧菌可以与严格厌氧菌共存于同一微 生物菌系中。这表明通过代谢活动和代谢产物，这些微生物之间保持非常密切的关系。而条 带d 和f 之间也具有某种关联。 通过d g g e 分离和1 6 s r d n a 顺序分析表明，在微生物菌系中好氧菌和厌氧菌间存在协 同作用，它们的关系可以通过代谢产物的分析来推测。把堆肥中的微生物菌群作为一个微生 态系统，研究微生物之间的关系以及它们与环境的物质和能量代谢，能够更加全面和深刻地 理解堆肥过程所发生变化的机理，从而为堆肥过程的优化控制提供理论基础，进一步提高堆 肥进程，缩短堆肥时间。 3 纤维素酶及纤维素酶解的概述 3 1 纤维素酶种类 纤维素酶系统是一个复杂的酶体系，主要包括三种酶组分：内切b 1 , 4 葡萄糖苷酶 ( e n d o b 1 , 4 - g l u c a n a s e s ，e c 3 2 1 4 ) ，简称内切纤维素酶或内切酶；外切i b 1 ，4 - 葡萄糖苷 酶( e x o - b - 1 , 4 g l u c a n a s e s ，e c 3 2 1 9 1 ) ，或称纤维二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e s ，c b h ) ； 1 3 葡萄糖苷酶( b - 1 ，4 g l u c a n a s e s ，e c 3 2 1 2 1 ，b g l ) ，又称纤维二糖酶( c e u o b i a s e ，c b ) 。 其中内切纤维素酶随机作用于纤维素糖链的无定形区，生成随机长度的寡糖和新的链末端， 因此可以快速降低纤维素的聚合度，其底物类型一般为无定形纤维素，如羧甲基纤维素 ( c a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e ) 、磷酸膨胀纤维素等，对结晶纤维素几乎无降解能力：外切纤维 素酶作用于纤维素链的还原性或非还原性末端，产物以纤维二糖( c e l l o b i o s e ) 为主，也会 有葡萄糖产生。研究发现外切纤维素酶有些时候也可以从内部切断纤维素链，而且也不是绝 对需要链末端的存在【”】。从zf u s c a 分离到的纤维素酶e 4 既具有外切酶活性又具有内切酶 活性，而且其产物主要为纤维四糖而非纤维二搪，表明纤维素内切酶或外切酶之间的区别或 许并没有开始认为的那样大。1 3 。葡萄糖苷酶主要水解纤维二糖和低聚糖，产生葡萄糖或者 从可溶性纤维寡糖的非还原末端移去糖残基。 3 2 复合纤维紊酶和非复合纤维素酶 微生物通过不同的方法来有效的水解不溶性底物或者结构复杂的底物。丝状真菌( 或放 线菌) 能够通过菌丝的生长穿透纤维底物，因此能够在纤维微粒的封闭腔内释放纤维素酶系 2 0 l ，对这些微生物来说，游离的纤维素酶已经足够满足水解的需要。在这种纤维素酶系统 5 河南农业学硕士学位论文产纤维秉醇菌群的筛选及其薛学特性研究 中并不形成高分子量的复合体，因此被称为非复合体系( n o a c o m p l e x e ds y s t e m s ) 。而厌氧细 菌块乏这种穿透纤维素的能力从而需要寻拽另外的途径参与到对底物的竞争中来。因此形 成了复合的纤维隶酶系统( c c n u k 。纤维小体) 可以将纤维素降解细胞固定到水解位 置。 a 誊- 一持a _ _ 灾m _ o 铷罄螺舻 8 w 一6 h i 器背 古麓螺嚣黾器留譬帅 a 一晷器患嚣w 8 m - ” q _ o _ _ h h _ - 日 目1 - 2 复音酶累( 舯和非复合酶系佃) 对结和无定彤纤维素的蝶介示意图1 f k l 2 , s c m t i c p i a “o f t kh y d r o l y s i s o f a o i p h o u sa n d “口”t m e d l u l o b y n o n m p l c x c d ( a ) 挑d m p l e z e o ( b ) a ：k 皿 3 3 纤维素的酶解过程 r e e + e 最初对纤维素降解的猜想就认为不溶性的纤维素水解首先存在一个物理崩解的 过程。这种崩解的重要性，l i 上殛哪种酶在起作用目前还并不清楚。韫多因素可以导致酶解过 程中可及度的增加，如铁存在下的过氧化氢、短纤维形成囡子、c b h l 或其催化结构域以及 c b h 2 的催化结构，还有非催化的c b d ，以及短纤维产生因子密粘褶苗产生的多肽【翻。 纤维素酶在水解过程中承解效率下降很快，原因可能在于底物表面积的减少、末端减少 以及失活的纤维隶酶的无效吸附。可以肯定随着水解的进行每克纤维素的可及面积以及吸 附量都在降低。 体外降解不溶性底物，以f 三种进程会同时出现，1 ) 剧相纤维素残基艘生物理和化学 的变化：2 ) 初级水解反应的纤维素分子释放可溶的中间物；3 ) 次级水解，可溶中间物水 解成小分子中间物，直至变为葡萄糖。化学变化指的是聚合度和末端浓度的改变，而内切酶 可以降低聚台度增加末端浓度，因此内切酶主要造成了纤维素的化学变化。而其在增溶过程 河南农业大学硕士学位论文产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究 中起的作用就要小于外切酶。次级水解的速度远大于初级水解，因此推测纤维糊精可能是初 级水解产生的中间物，只不过难以检测到。 对于纤维素水解的检测主要基于还原糖的产生，因此主要关注的是次级水解，而如果对 于水解初期物理化学变化进一步的描述可能会对水解机制有更深入的理解。 3 4 纤维素酶之间的协同作用 多种纤维素酶同时作用于底物时，表现出的酶活比所有单个酶单独作用时酶活的总和 高，这种现象被称为协同作用。协同度( d e g r e eo fs y n e r g i s m ，d s ) 可以定量的表示协同的 程度，其计算方法是用多个酶共同作用的酶活和单独作用时酶活总合的的比值。主要的协同 有以下几个方面：1 ) 内外切纤维素酶之间的协同；2 ) 外切纤维素酶之间的协同；3 ) 内切 酶之间的协同；4 ) 内外切纤维素酶与葡萄糖苷酶之间的协同；5 ) c b m 和c d 的分子内协 同；6 ) 纤维小体的协同。协同作用的存在一方面能够提高酶解效率减少底物抑制，另一方 面说明，采用单个酶对底物进行降解，所测到的酶活力并不能真正反映酶的活性，因为在自 然条件下，酶不是单独存在的，只有在系统中单个组分才能真正发挥其所有能量。 3 5 酶对纤维素的吸附 糖苷水解酶的c b m 可以帮助酶吸附到底物上，c b m 大小变化很大，4 - 2 0 k d a 不等，一 般存在于蛋白链的一端，由一段高度糖基化的( 真菌) 柔性多肽与催化结构域连接。目前 c b m 一共被分为4 9 个家族。所有c b m s 用芳香族或者极性残基与底物结合，特异性吸附 到纤维素上的c b m 被称为c b d ( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n s ) 。 纤维素酶对纤维素的作用过程如下：酶首先和底物( 即纤维素) 发生专一性结合，形成 复合物e s 。因此酶分子应能够非常接近纤维并吸附在纤维素某些部位( 通常首先吸附在纤 维表面) ，再发生配位络合，形成中间复合物。然后酶分子的活性部位发生专一性的催化， 促进纤维素分子链的糖苷键水解，切断纤维素分子。但酶分子活性部位的专一性结合和催化 作用是不能绝对分开的，有的反应还可能经历几次才能完成。 纤维素不溶于水，纤维素的酶催化水解反应是一多相反应，酶分子也是高分子物，反应 的空间阻碍较大，所以吸附对酶的活性部位与纤维素分子链的结合及催化均有很大影响。一 些酶对水溶性的底物有很高的活力，而由于与纤维素不能充分发生吸附( 活性部位的结合) ， 催化效率不高，甚至不能发生催化反应。总之，吸附性高有利于加速反应，但反应速度随时 间增长而变小，这一点对反应速度快的酶更为明显。不过，吸附性影响反应速度的快与慢， 对纤维素的结晶区影响最大，而对无定形区的纤维素来说，反应速度受吸附性的影响就较小。 对水溶性的c m c 来说，酶分子和c m c 分子可充分接近，不必先发生吸附才进行反应，所 以吸附性对c i v i c 的水解反应速度没有影响。 在一般的吸附模型中涉及的参数包括纤维素酶的总量、底物总量、底物特异性参数、酶 特异性参数、以及物理化学环境参数。多数吸附模型认为存在吸附平衡，试验中也发现吸附 达到平衡所需的时间少于水解所需的时间。r a b i n o v i c h 研究了多个纤维素和纤维素酶吸附作 7 河南农业大学硕士学位论文产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究 用后发现，吸附复合物形成以后，酶会结合于纤维素一段比较长的时间，3 0 分钟或者更久， 此时间内可发生上百次催化反应【2 3 1 。 酶的吸附是可逆的，因为不可逆的吸附对于酶在纤维素表面的滑动是灾难性的，实验也 证实了这一点。然而，由于吸附力比较强，在实验中难以观察到纤维素酶的解离，因此很多 研究还是提到吸附的不可逆性及不完全可逆性。 3 6 影响酶解的因素 淀粉酶的活力是纤维素酶活力的1 0 0 倍，对于淀粉酶解的认识可能会帮助我们了解影响 纤维素酶解的因素。淀粉是d 连接的糖链，除了糖链连接方式的不同外，还有三个因素影 响二者的水解速率：1 ) 不溶性底物的可及键，2 ) 不溶性底物的有效链末端，3 ) 酶解产物 的溶解性。纤维素的可及糖苷键比可溶性淀粉低8 - 5 0 0 倍，比不溶性淀粉低5 - 2 0 0 倍，可及 糖苷键的多少会影响内切酶的反应速度。由于淀粉的分支结构，比纤维素含有更多的链末端， 链末端的众寡会影响酶的活力。当d p 6 时，纤维糊精基本己经处于不可溶的状态，而麦芽 糖糊精可以在聚合度高达6 0 时保持可溶状态。原因可能是纤维糊精是平面线性结构，而淀 粉是螺旋性结构。因此，淀粉可以比纤维素更快地进入可溶状态进行酶解。因此纤维素酶解 效率低的原因可能在于其底物性质而非a 、1 3 糖苷键之间的区别。 纤维素分子内和分子间的氢键赋予了纤维素致密和异质性的结构，虽然氢键能比糖苷键 键能低很多，但是在有纤维素分子链聚集排列形成的超分子机构中，特别是结晶区中存在大 量氢键，是造成纤维素坚韧和水不溶性的重要原因。从纤维素的超分子结构来看，酶解首先 涉及氢键断裂，这是纤维素酶解的限速步骤之一瞰1 。 转化率用来表示在整个反应过程中底物转化的量，可以用来描述整个酶解反应进行的程 度，其值介于0 1 之间，用x 表示： x = ( s o s ) s o s o 表示起始底物量，s 表示在t 时间底物的含量。随着水解的进行，x 值不断变大，但是普 遍发现水解速率下降非常快。酶解速率的下降可能有酶和底物等多方面的原因。热作用、酶 的无效吸附、产物抑制等都会影响酶的活性，特别是外切酶，失活非常迅速，然而排除这些 因素的影响，酶活下降现象仍然存在。显然，底物的特性可能在其中起重要的作用。有研究 认为纤维素中存在两种底物，对纤维素酶攻击的感受性不同，然而这种理论并没有被广泛接 受，另一种理论认为底物的活性随着水解的进行可能会降低。目前来看，还很难形成一种广 泛接受的理论，因为有多个因素可能会起作用，目前还不能做到完全排除其他因素的影响而 对单一因素进行研究。这有赖于对酶解过程更详细的了解。 3 7 纤维素酶的应用 随着世界人口的骤增和资源面临短缺的危机，如何有效的利用纤维素资源对解决环境污 染、食品短缺及能源危机等具有重大现实意义。利用微生物产生的纤维素酶进行纤维素的分 解和转化则是纤维素利用的有效途径，因此相关的研究越来越引起人们的重视。专家预测， 8 河南农业大学硕士学位论文产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究 针对扮演绿色化学品的纤维素酶的研究开发利用是新世纪的可再生性资源的关键。 纤维素酶的应用相当广泛，从广义上说，可分为两大类：一是去除植物细胞壁中的纤维 素；二是水解纤维素以生产葡萄糖。随着人们对纤维素酶研究工作的深入，纤维素酶已经在 纺织、造纸、食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。 4 纤维素降解菌的筛选方法 4 1 以纤维素为唯一碳源的选择培养基 4 1 1 纤维素选择培养基 纤维素分解菌能在纤维素的诱导下产生纤维素酶，促进纤维素的水解，在平板上纤维素 分解菌落周围会出现透明的水解圈瞄】，根据水解圈的大小可以筛选出纤维素分解菌。 1 、培养基基本组成 蛋白胨5 9 ，氯化钠5 9 ，琼脂1 8 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 0 彳2 ，纤维素粉0 8 1 5 。 配制前应对纤维素粉和琼脂进行预处理，除去药品中可能存在的其它碳源，使纤维素成为唯 一碳源。纤维素应加l m o l l 盐酸浸泡1 2 h ，然后蒸馏水洗多次至p i - i 值中性，烘干备用。 2 、产纤维素酶菌株的特征和识别 纤维素是由葡萄糖残基以b 1 。4 糖苷键连接而成的线状大分子物质，纤维素水解酶能 够催化水解此糖营键使其变成纤维二糖和葡萄糖。因此纤维素分解菌菌落周围的纤维素物质 被水解，菌落周围可观察到透明水解圈，对纤维素无分解能力的菌株周围则无此透明圈。 为了减少筛选的工作量，提高工作效率，在纤维素分解菌的选择方面有三个基本规则。 一是菌落周围有水解圈。有水解圈才证明菌对纤维素有分解作用；二是菌落水解圈出现的早 迟和直径大小。水解圈出现得越早。水解圈直径较大，可初步说明菌对纤维素有良好的分解 能力，有较强的酶活力；三是菌落的生长情况。菌在选择培养基上既有水解圈产生，而且生 长良好，则进一步说明菌对纤维素的分解能力，生长情况可通过菌落直径或单位时间内的直 径增长率来衡量。 4 1 2 纤维素刚果红培养基 l e a t h e r 和w o o d 等人曾观察到刚果红染料对鉴定多糖水解物是有效的，认为染料同水 解的多糖形成了一个清晰可见、有浓郁色泽的复合物，且认为水解圈大小与酶活高低有一定 的数量关系。h e n d r i c k s 等at 2 6 1 进- - 步发展成为一个鉴别性培养基，用于各种纤维素分解菌 数目测定。在此基础上，叶姜瑜【2 7 1 等人经过多次实验，摸索出适用于一般实验室的配方和 初步估计酶活高低的方法。 1 、纤维素刚果红培养基的配制 磷酸氢二钾0 5 9 ，硫酸镁0 2 5 9 ，纤维素粉1 8 8 9 ，刚果红0 2 0 9 ，琼脂1 4 0 0 9 ，明胶2 0 0 9 ， 土壤浸汁1 0 0 m l ，水9 0 0 m l ，p h 7 0 。配制前应对纤维素粉和琼脂进行预处理，除去药品中 可能存在的其它碳源，使纤维素成为唯一碳源。 2 、产纤维素酶菌株的特征和识别 9 河南农业大学硕士学位论文产纤维索酶菌群的筛选及其酶学特性研究 纤维素水解酶能够催化水解此糖苷键使其变成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类同刚果 红染料可形成红色沉淀，颜色浓郁、厚重，所以此水解圈在菌落生长过程中便逐渐清晰可见， 不易发生错误识别。在纤维素刚果红培养基上，凡能形成红色水解圈的菌落即是能产纤维素 酶的菌株。即使是低酶活性的菌株也能形成清晰的红色水解圈，具有明显的可识别性。 4 2 滤纸底物选择培养基 以滤纸作为唯一碳源来筛选纤维素分解菌的方法得到了广泛应用。滤纸属于较天然的纤 维素物质，如果菌株对滤纸有较强的分解能力，那么完全可以证明它对纤维素有良好的分解 能力澄】。 1 、培养基基本组成 ( 1 ) 杜博氏培养基口9 】( d u b o sm e d i u m ) 硝酸钠0 5 9 ，磷酸氢二钾1 9 ，硫酸镁0 5 9 ，氯化钾0 5 9 ，硫酸亚铁0 0 1 9 ，蒸馏水1 0 0 0