（生物医学工程专业论文）几种基于纳米金标记的dna传感器的研究.pdf

东南大学博士学位论文 放大检测。实验表明，采用1 2 a c 2 0 a c o | i t h f 氧化体系替代1 2 小2 0 ，p y r i d i d 胛h f 氧化体系进行d n a 原位合成，可以消除试剂互串对原位合成效率的影响。其原 位合成的偶联效率可达9 8 2 ，而且不影响所合成的d n a 探针阵列与靶序列杂交 的特异性，可很好地区分碱基正错配。以h 2 和n ：混合气体等离子体处理聚丙烯微 孔膜和聚丙烯片，光电子能谱( x p s ) 证实在其表面分别接枝了大量活性氨基， 可直接用于d n a 的原位合成。实验成功地制备了1 3 n m 的胶体金，在聚丙烯片上 原位合成d n a 探针后的金标银染检测灵敏度达到1 0 0f m ，可明显区分碱基正错 配，正配：错配一个碱基：错配二个碱基：错配三个碱基的杂交银染信号比为 2 2 ：1 6 ：9 ：4 。聚丙烯片上手工点样d n a 探针后的检测灵敏度为1 0 0p m ，比原位合 成法低3 个数量级，而且同一样本d n a 浓度下，手工点样的银染信号约为原位合 成的1 2 。聚丙烯膜上原位合成d n a 探针后的金标银染检测信号强于带o 0 7u m o l ， c m 2 表面氨基的商用聚丙烯膜，且可明显地区分碱基正错配，其金标银染杂交信 引通着纳米金粒径和胶体金浓度的增加而增大。 2 纳米金放大的电化学d n a 检测 将纳米材料混入碳糊电极中，分别在纳米碳管改性的碳糊电极和s b a 1 5 分 子筛改性的碳糊电极上通过亲和素一生物素法固定d n a 探针，固定的探针与纳 米金标记的靶d n a 杂交后结合第一层胶体金颗粒，并通过l a y e r _ b y l a y e r 层层放 大连接第二层胶体金，最后检测单层和双层纳米金的差分脉冲伏安( d p v ) 电化 学信号。对固定在电极表面的d n a 进行循环伏安扫描( c v ) 表明，在碳糊电极 中加入纳米碳管制成的纳米碳糊电极( c n t p e ) 由于具有比纯碳糊电极( c p e ) 更大的吸附表面积，固定的d n a 量更多，有利于d n a 杂交。通过亲和素一生 物素体系在电极表面固定d n a ，纳米碳管的孔径越大，d n a 的固定量越多，d n a 的循环伏安( c v ) 信号也越强。随着电极中纳米碳管的含量增加，杂交信号增 强。而碳糊电极经分子筛改性后，由于分子筛不导电，其d n a 吸附和杂交的电 化学响应信号均低于纯碳糊电极。在纳米碳糊电极表面，经过两次杂交的胶体金 层层放大后，其d p v 信号明显高于一次杂交的胶体金d p v 信号，而且层层放大 杂交能很好地区分正错配d n a 序列。一次杂交对靶d n a 的检测限为1 i l m ，而层 层放大的检测灵敏度可达1 0 0 p m ，比一次杂交高一个数量级。 3 纳米金质量放大的压电d n a 检测 v 摘要 压电d n a 检测属于对质量敏感的传感，由于纳米颗粒的质量远远大于d n a 分子的质量，采用纳米金颗粒标记杂交的d n a ，以增加石英金电极表面的质量 改变量，并通过l a y e r _ b y 1 a y e r 层层放大连接更多的胶体金颗粒，最后检测由表 面质量变化引起的频率改变值。实验表明，标记的胶体金确能增加石英晶体的频 率检测信号。由于具有更高的杂交效率和胶体金标记效率，先杂交后标记胶体金 的“追加标记法”比先标记胶体金后杂交的“直接标记法”具有更大的频率降。 直接标记法中，频率改变值随纳米金的直径增大而增加，而追加标记法中，频率 改变随纳米金直径的增加而减少。在追加标记法中，在杂交条件优化后，表面探 针浓度为1 “m ，标记胶体金直径为5 m 时，一次杂交放大的灵敏度为1 0 0 f m ， 去除背景后，正配：错配一个碱基的频率降比值为2 2 7 ：1 ，胶体金层层放大的检 测灵敏度为1 0f m ，去除背景后正配：错配一个碱基的频率降比值为2 1 3 ：1 。 经层层放大后的检测灵敏度比一次杂交时可提高一个数量级。层层放大杂交对 m t h f r 基因c 6 7 7 t 突变纯合型的检测灵敏度达到1 0 f m ，并成功地实现了单碱 基错配检测，正配：错配一个碱基的频率降比值为2 1 ：l 。 v i 东南人学博士学位论文 a b s t r a c t t i t l e ：s t u d yo fs e v e r “d n as e n s o r sb a s e do ng o l dn a n o p a n i c l el a b e i p h d c a n d i d a t e ：n i el i b o s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rh en o n g 一1 y - u e n a m eo ft h eu n i v e r s i t y ：s o u t h e a s tu n i v e r s i t y h u m a nl i f ei s f u n d a i n e n t a l l y c o n t r o l l e d b yg e n e w i t hu 1 1 d e r s t a n d i n gt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e ng e n ea n dc o r r e s p o n d i n gd i s e a s e ，i ti sv e r yi m p o n a n tt od i s e a s e t h e r a p ya n dp r o g n o s i st 1 1 a tt h eg e n em u t a t i o na n di m p r e s s i o n a b l es p e c i e sa r ed e t e c t e d a tm o l e c u l a rl e v e l t h ed n a r e c o g n i t i o nt e c h n o l o g yi si m p r o v e dc o n t i n u o u s l yw i t h t h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g ya 1 1 db i o t e c l l i l o l o g y i nr e c e n ty e a r sd n as e n s o r t e c l m o l o g yi sp a i dc l o s ea t t e n t i o nb e c a u s ei th a st h ea d v a m a g e so fs a v i n gd e t e c t i o n t i m e ，a n a l y z i n gt h eq u a l 姆a n dq u a i 】t i 哆o fs 锄p l e ss i m u l 伽1 e o u s ly ，a s 、v e l la sh i 曲 s e n s i t i v i t ya n de x c e l l e n ts e l e c t i v i 够d n as e n s o rt e c l l l l 0 1 0 9 yi n t e g r a t e sm o l e c u l a r b i o l o g y ，p h y s i c s ，c h e m i s t r ya 1 1 dm i c r o e l e c 们n i ct e c h n 0 1 0 9 yi tc a n b eu s e di nt h ea r e a o fd i s e a s ed i a g n o s i s ，c o m a g i o nd e t e c t i o n ，e v i r o m n e n tm o n i t o r i n g ，m e d i c i n er e s e a r c h ， m e d i c o l e g a l i n d e n t m c a t i o na n df o o d s t u f fa n a l y s i s a c c o r d i l l gt od e t e c t i o nm e t h o d s ， d n as e n s o r si n v o l v ee l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r ，o p t i c a ls e n s o r ，m a s ss e n s o r ( f o re x 锄p l e ， q u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ) a n ds oo n n o w a d a y s ，i t sad e v e l o p i n gd i r e c t i o n 血a tn 趾o t e c h n o l o g yc o m b 协e sw i t hb i o s e n s o r t e c 1 1 1 0 1 0 9 y n a n o m e t e r i a l sp o s s e s su n i q u ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ，s u c ha s q u a n t u ms i z ee 仃e c t ，s m a l ls i z ee 虢c t ，s u r f a c ee 船c ta n dq u a i l t 啪t m m e l i n ge 航c t f u n c t i o n a ln a n o p a r t i c l e s ( e l e c t r o n i c ，o p t i c a la 1 1 dm a g n e t i c ) c a nc o l l l l e c tw i t hd n a m o l e c u l e st oe n l a 曙et h es i g n a l so fd n a d e t e c t i o n s p e c i a l l y ，n a n o 9 0 1 db e c o m e so n e o ft h em o s ts u i t a b l en a n o p a r t i c l e sb e c a u s eo fi t ss i m p l ep r e p a r a t i o np r o c e d u r e ， c o c m l l e dd i 锄e t e r ，b i o l o g yc o m p a t i b l ea n de a s yt o1 a b e lw i t hd n a s e n s i t i v i t yi so n eo ft b em o s ti m p o r t a l l tp r o p e n i e so fd n a s e n s o r s i nt h i ss t i l d 弘 w ea t t e m p t e dt oi m p r o v et l l es e n s i t i v i t i e so fs e v e r a ld n as e n s o r sv i a l el a b e l i n go f g o l dn a n o p a r t i c l e s t h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： v t t 摘要 1 g o ml a b e ls i l v e rs t a i m e t h o do fd n ad e t e c t i o no np o l y p r o p y l e n es u p p o r t c o m p a c tp o i y p r o p y l e n e s l i c e sa 1 1 d p o m u sp o l y p r o p y l e n e m e m b r a i l e sw e r e m o d i f i e db yt h eh y d m g e “n i t r o g e n p l a s m at r e a t m e m i no r d e rt og r a ra m i n o f u n c t i o n a lg m u p ( 一n h 2 ) o m ot h es u r f a c e s o l i g o n u c l e o t i d e sw e r e 咖j 打“s y n m e s i z e d o nt h ea m i n a t e dp o l y p r o p y l e n es u p p o r t a tt h es a m et i m e ，t h e0 x i d i z i n ga g e mo f 加 j 甜“s y n t h e s i sw a si m p r o v e di no r d e rt od e v e l o pb i o c h i pf a b r i c a t i o nm e t h o d sw h i c h w e r es u i t a b l ef o rp r i m i n gc h e m i c a l so f d n a r n i c r o 蝴ys y l l t h e s i sq u i c k l ya n di nl a 唱e s c a l e g 0 1 dn a n o p a n i c i el a b e l e dt a r g e td n a sw e r eh y m d i z e dt o 让l es y t 1 1 e s i z e d o l i g o n u c l e o t i d ea r r a y ，a n dt h e nm es l i c e sa i l dm e m b m n e sw e r ee x p o s e dt om es i l v e r e n h a n c es o l u t i o nf o r s i g m la i i l p l i f i c a t i o n ns h o w e dm a t血e i m p m v e d 1 2 a c 2 0 a c o h t h fo x i d i z i n ga g e mm a d et h e 加j 加ls y i l t h e s i sm o r ef e a s i b l eb y e l i m i n a t i n g 也ed e c r e a s eo fc o u p l i n ge 伍c i e n c yw h i c ho w i n gt om ec t o s sr e a g e n t i n t e r f e r i n ga r i s e s 矗d mp y r i d i n ea j l dw a t e ri nt l l et r a d i t i o n a l1 2 h 2 0 p y r i d i n e t h f o x i d i z i n ga g e m u s i n gt h i so x i d i z i n ga g e n t ，as i n g l es t e pc o u p l i n ge f f i c i e n c yo f9 8 2 w a sa c h i e v e d ，a n dt h ec o m p l e m e n t a r ya n dm i s m a 七c h e dd n ac o u l db ed i s t i n g u i s h e d c i e a r l y t h en 2 h 2p l a s m a 订e a t e dp o l y p r o p y l e n es i i c e sa t l dm e m b r a n e sc a i lb eu s e da s t h es u b s t r a t eo f 加j 打“s y n t l l e s i so fd n a d i r c c t l y t h en e wg e n e d c t e c t i o ns y s t e m ， w h i c he m p l o y sap i a s m at r e a t n l e mo np o l y p r o p y l e n es l i c e sa r nad n a 加s f m s y n m e s i st c c h n i q u eb a s e do nc o l o r i i n e m cd e t e c t i o n ，h a sas e n s i t i v i t ya sl o wa s1 0 0 f m ，a n dc a nd i s t i l l g u i s hm i s m a t c hs e q u e n c e sc l e 甜l ya tt l l i st a r g e tc o n c e n t r a t i o n t h e r a t i oo ft | l eb a c k 盯o u n d s u b t r a c t e d 掣a y s c a l ev a l u e sf o rap e r f e c tm a t c h ，s i n g l e _ b a s e m i s m a t c h ，2 - b a s em i s m a t c ha 1 1 d3 _ b a s em i s m a t c hi s2 2 ：1 6 ：9 ：4 t h es e n s i t i v i t yo f d n a s p o t t i n gs y s t e mw a s1 0 0p m ，w h i c hw a s3o r d e r so fm a 鲥t u d el o w e r 血a nm a t o f d n a 拥s f f “s ”m e s i ss y s t e m ，a n dt h es 蟾n a l so f t l l ef o m e rw e r ea b o u th a l f o f 1 a t o ft h el a t t e ru n d e rt h es a m et a r g e td n ac o n c e n t r a t i o n o nt h es u r f a c eo fa m i n o p l a s m a - g m r e dp o l y p m p y l e n em e m b r a n e s ，t h eh y b r i d i z a t i o ns i g n a l sw e r es t r o n g e r t h a r lt h a to ft h ec o m m e r c i a lp o l y a c r y l a m i d em o d i f i e dp o l y p m p y l e n em e m b r a n e st h a t l o a d0 0 7 m o m 2 丹e ep r i m a r ya m 血of u n c t i o n s c o m p l e m e m a r ya n dm i s m a t c h e d s e q u e n c e sw e r ec l e a r l yd i s t i n g u i s h e d b i g g e rn a n o p a n i c l ed i a m e t e r a s 、v e l la sh j 曲e r c o n c e n t r a t i o no f t h i o ld n am o d i f i e dg o l dn a n o p a n i c l e s1 e a dt os t m n g e rh y b r i d i z a t i o n v t t l 东南大学博士学位论文 s 培n a j s 2 g o i dn a n o p a r t i c l ee n h a n c e de l e c t r o c h e m i c a ld n ad e t e c t i o n c a r b o nn a n o t u b e sa i l dm e s o p o r o u sm 0 1 e c l l l a rs i e v e ( s b a 一1 5 ) w e r em i x e dw i t h g r a p h i t ep o w d e ra n do l e f i no i lr e s p e c t i v e l yt of 萏b r i c a t ec a r b o nn a n o t u b e 口a s t e e l e c t r o d e( c n t p e ) a n dm o l e c u i a rs i e v ec a r b o np a g t ee l e c t m d e ( m s c p e ) d n a p r o b e s w e r ei m m o b i l i z e do nt h e p r 印a r e de l e c t r o d e sb ys t r e p t a v i d i n b i o t i n c o n j u g a t i o n ，t h e nh y b r i d i z e dw i 血a un a l l o p a n i c l el a b e l l e dt a r g e td n at oc o n n e c tt h e f l r s tl a y e ro fc o l l o i dg o l d f u r t h e n o r e ，t h es e c o n di a y e ro fc o u o i d9 0 1 dw a s c o n n e c t e dv 胁l a y e r _ b y l a y e rh y b r i d i z a t i o n t h ee l e c t r o c h e m i c a lt r a n s d u c t i o nw a s e m p l o y e dv f m o l l i t o r i n gt h ed p vr e s p o n s eo f9 0 1 dn a n o p a r t i c l e s i 、h ec vr e s p o n s e o fi m m o b i l i z e dd n ai n d i c a t e dm a tc n t p e s 、v c r cm o r e p r o p i t i o u s t od n a h y b r i d i z a i i o nt h a np u r ec a r b o np a s t ee l e c t r o d e ( c p e ) b e c a u s eo ft l l e1 a r g c rs u r f a c e a r e ao ft h ef o n n e lt h e 锄o l l l l to fm ei i l l r n o b i l i z e dd n a w a si n c r e a s e dw i mt h e i n c r e a s eo ft h ed i a m e t e r so fn a n o t l 】b e s t h eh y b r i d i z a t i o ns i g n a l sw e r ee n h a n c e d 、v i 廿1 t h ei n c r e a s eo ft h ec o n t e n to fn a l l o t u b ei n l ec n r p eh o 、e v e r t h ee l e c t r o c h e m i c a l s i g n a l so fd n aa d s o r p t i o na i l dh y b r i d i z a t i o no fm s c p ew e r eb o t l lw e a k e rt h a nt 1 1 a to f c p e a f 【e r1 a y e r _ b y 一1 a y e r h y b r i d i z a t i o n ，t h ed p v r e s p o n s ew a sm o r es i 印i f i c a n tt h a i l t h a to fo n e - l a y e rh y b r i d i z a t i o n c o m p l e m e n t a r ya n d m i s m a t c h e dd n ac a nb e d i s t i n g u i s h e dc l e a r l yi n1 a y e r - b y - l a y e rm e l o d t h ed e t e c t i o nl i m i to fo n e - l a y e r h y b r i d i z a t i o nw a s1n m t h ed e t e c t i o nl i m i to fl a y e r - b y l a y e rh y b r i d i z a t i o n 、v a s1 0 0 p m ，w h i c hw a so n eo r d e ro f m a g n i t u d eh i g h e rt t l a l lt 1 1 a to f o n e 一1 a y e r h y b r i d i z a t i o n 3 g o l dn a n o p a r t i c l em a s s - e h a n c e dp i e z o e l e c t r i cd n a d e t e c t i o n p i e z o e l e c t r i cd n as e n s o ri sm a s s s e n s i t i v e g 0 1 dn a n o p a n i c l e sw e r el a b e l e d 、v i t h h y b r i d i z e dd n a t oi n c r e a s et h em a s sc h a n g eo nt h es u r f a c eo fg o l dc o a t e dq u a n z c r y s t a lb e c a u s et h em a s so fa un a n o p a r t i c l ei sm u c hg r e a t e rt h a nt h a to fd n a m 0 1 e c u l e l a y e r _ b y l a y e rc o n n e c t i o no fg o l dn a l l o p a r t i c l e sw a sp e r f b r m e di no r d e r t o e 1 1 1 1 a n c et 1 1 em a s sc h a i l g er n o r e i ts h o w e dt 1 1 a tt h el a b e l e da un a n o p a r i c l e sa c t u a l i y i n c r e a s e dt h e 丘e q u e n c yc h a n g eo fq u a r t zc r y s t a i t 、v ol a b e l i n gm e t l l o d s 、e r ec a r r i e d o u t ：o n ei si n d i r e c tl a b e l i n gm e t h o di nw h i c h n a n o p a r t i c l e sa r el a b e l e dw i t hd n aa f t e r h y b r i d i z a t i o n ，t h eo t h e ri sd i r e c t l a b e l i n gm e t h o di nw h j c hn a n o p a n i c l e sa r el a b e l e d 摘要 w i t hd n ab e f o r eh y b r i d i z a t i o n t h ef r e q u e n c yc h a l l g eo ft h ef o m e r 、珊sm u c h g r e a t e rm a nt h a t o ft h el a t t e li nd i r e c ti a b e l i n gm e t l l o d ，t h e 丘q u e r l c yc h a n g e i n c r e a s e dw i t l lt h ei n c r e a s eo ft h ed i a m e t e ro fa un a n o p a r t i c l e b u tt h es i t u a t i o nw a s o p p o s i t ei ni n d i r e c tl a b e l i n gm e t h o d 、册1 e nt h ec o n c e n 仃a t i o no fd n ap r o b ew a s1 ma n dt h ed i 趣e t e ro fa un a n o p a r t i c l ew a s5 眦，t h es e n s i t i v i t yo fo n e l a y e r h y b r i d i z a t i o nw a s1 0 0f m ，a n dt h e 抒e q u e n c yc h a n g eo fc o m p l e m e n t a r yd n a ： o n e b a s em i s m a t c h e dd n aw a s2 2 7 ：1 t 1 1 es e n s i t i v i t yo fl a y e r - b y - 1 a y e rh y b r i d i z a t i o n w a s10 伽，a n dm ef r e q u e n c yc h a i l g eo fc o m p l e m e n t a r yd n a ：o n e - b a s em i s m a t c h e d d n aw a s2 13 ：1 i ti n d i c a t e dt h ed e t e c t i o ni i m i to fl a y e r _ b y l a y e rh y b r i d i z a t i o n 、v a s o n eo r d e ro fm a g n i t u d e l l i g b e r t h a nm a to fo n e l a y e r h y b r i d i z a t i o n t h i s l a y e r _ b y l a y e rm a s se n h a n c e ds y s t e mw a sa p p l i e dt od e t e c tt h e6 7 7 t tg e n o t y p eo f m t h f rg e n e t h es e n s i t i v 时a c h i e v e d1of ma n dt h ec o m p l e m e n t a r ya j l do n e _ b a s e m i s m a t c h e dd n ac o u l db e d i s t i n g u i s h e dc l e a r l y 1 1 1 e f r e q u e n c yc h a n g e o f c o m p l e m e n t a r yd n a ：o n e _ b a s em i s m a t c h e dd n a w a s2 1 ：1 x 东南大学学位论文独创性声明 木人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了谢意。 尉7 形 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复日j 件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：蕴垡翩签名：日期：坷7 一l 弘 第一章绪论 第一章绪论 1 1d n a 传感器概述 自1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 创立生物遗传分子脱氧核糖核酸( d n a ) 的双螺 旋结构，建立生物遗传基因的分子机理以来，有关d n a 分子的识别、测序一直 为人们所关注。1 9 9 0 年美国制定了世界最庞大的基因研究计划“人类基因组计 划”，随着人类基因草图的公布，人们正在深入开展后基因组计划研究，为此， 国际上掀起了有关生物芯片和生物传感器的研究热潮。基因控制着人类生命的生 老病死过程，随着对基因与癌症及其它与基因有关病症的了解，在分子水平上检 测易感物种及基因突变，对于疾病的治疗及预后也有着重要的意义，并可望实现 对疾病的早期诊断乃至超前诊断。 随着分子生物学和生物技术的发展，d n a 检测技术不断提高，日臻完善，为 d n a 传感器的建立提供了可能。在基因分析技术中，p c r 技术以其简便、快速、 灵敏的优势，成为基因诊断和分析的重要手段。但是p c r 技术存在着急需解决的 二大问题：一是费时费力，二是污染所致的假阳性“3 。d n a 传感器的出现使对目 的d n a 的测量时间大大缩短，既可定性又可定量，且灵敏度高、选择性好，而且 不会产生放射性标记的危险性，因此，近几年来受到了人们的广泛重视。d n a 传 感器与其他生物传感器所用的酶和抗体不同，d n a 分子识别层十分稳定，并且易 于合成或再生，能重复使用。这一特性使得d n a 生物传感器在基因分析领域发 挥着重要的作用”1 。除了d n a 检测外，还可应用于环境监控、药物研究、法医鉴 定及食品分析等领域，具有广阔的发展前景。 d n a 传感器的基本概念是指以d n a 为分子识别元件，与相应的换能器结合 实现对特定化学物质的作用并产生相应的可检测信息( 如光、电效应、热效应、 场效应和质量变化等) 。“。可用于特定d n a 序列及其变异识别的机制有两种： 一种是d n a 杂交严格遵守的w a t s o n c r i c k 碱基配对原则，即c 与g ，a 与t 形成 碱基对；另一种则是通过h o o g s t e e n 氢键形成三链体寡聚核苷酸，即双螺旋d n a 的a t 碱基对可与t 形成t a t 三碱基体，g c 碱基对可与质子化的碱基c ( c + ) 形成c gc 三碱基体。目前，大多数d n a 传感器都是建立在d n a 杂交基础上。 根据是否选用指示标记物，d n a 传感器可分为：( 1 ) 标识型，用荧光试剂或电 活性试剂标记探针或靶基因，利用荧光或氧化还原信号的改变进行检测；( 2 ) 无 标记型，利用d n a 杂交前后引起的质量及折射率等物理或化学信息的变化进行 检测。根据d n a 转换器件转换信号的不同，可分为电化学传感器、光纤传感器、 东南大学博士学位论文 光波导传感器、表面等离子体传感器、石英晶体传感器等“。1 。d n a 传感器涉及 两个关键技术：一是有效地将d n a 探针在固体基质表面的固定技术：二是在传感 器液相界面对于靶基因或靶标物质的测定技术。 1 2d n a 探针的固定方法 d n a 固定化技术是使具有分子识别能力的物质得以利用的基础。固定核酸 探针要考虑使寡核苷酸探针能有效地连接于支持物并保持其与待测分子的特异 性结合活性。此技术涉及两个方面：( 1 ) 将感受器如金属电极、压电元件、石英光 纤等表面修饰，使其带上各种需要的活性基团如羟基、氨基等，以便与d n a 探针 结合：( 2 ) 核苷酸的衍生，使其带合适的功能团，以利于d n a 在表面的固定及后 续的检测。固定技术影响着传感器的灵敏度及使用寿命。 1 2 1d n a 探针及其特性 d n a 探针一般是线性的，但为了得到更快的杂交速度和更多的杂交量，发 夹结构的d n a 越来越多地被使用( m o i e c u i a r b e a c o n ，分子信标) ，而且发夹一靶 d n a 结合物在热动力学上更加稳定，分子信标探针是特殊类型的d n a 探针。信 使r n a ( m r n a ) 是从细胞中经过纯化得来的，它的分析可提供基因表达的信 息，而且m i a 是d n a 编码区的复制，它也可用于鉴别编码区的多态性。但 m r n a 一般很少用作固定探针，因为它非常不稳定，而是将m r n a 逆转录为更 加稳定的c d n a 。肽核酸( p n a ) 作为探针近来引起了特别的重视。与d n a 不 同，p n a 是一种线性聚合物，以中性的n ( 2 氨基乙基) 甘氨酸重复单元通过酰胺 键连接成骨架，嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基连在碳原子上。换句话况，p n a 是d n a 中四个碱基的衍生物构成的序列，只是没有d n a 中的磷酸戊糖骨架， 而以电中性的骨架取代，从而减少了杂交双键形成时的静电斥力。p n a 与d n a 杂交形成的氢键和碱基距离与d n a 双螺旋结构相似，但与d n a ，d 1 q a 双链不同， p n a d n a 双链不会被核酸酶和蛋白酶降解，因为核酸酶和蛋白酶不能识别肽骨 架。p n a d n a 双链热稳定性更高，其瓦值e b 相应的d n a ，d n a 双链大约高1 0 。c ， 并且由于p n a 的电中性，p n a d n a 双链对离子强度不敏感。单碱基错配 p n a d n a 双螺旋不如相应的d n a d n a 双螺旋稳定，这使p n a d n a 杂交更适 于基因的突变检测0 1 。 1 2 2d n a 探针固定方法 常用的d n a 固定方法列于表1 1 ，主要有嵌入聚合物中固定、在功能化支持 第一章绪论 物上的共价结合、亲和固定、在固体表面的物理吸附以及单分子层自组装。在这 些常规方法中，自组装单分子层( s a m ) 固定方法具有简单、高效、有序组装 的优点，因此得到广泛应用。 表1 1d n a 探针固定方法f 鍪阂缀震翁翳缓豳黧霹露霾霾蕊t 潮一圈一 z 渤豳 蓑嚣箩“。一。冀恕m 焉= 。 品赫。n 。：瑟s 。m “”n 。w 冀：掣“：麓。一a e ” m “n x。v醣担 s u r 自e e h e a h 盯n 裟磊一一n 一然搿。一 哪 晰一时：篡嚣。訾黑 v k l d s s u 札eh 髑n r t e m n 啪d e dj o t 9 9 7 蓑黧一一m 篇搿。一一一曲粼黜嚣愁淼。篓瓣 l o w 曲l 删硼 b a 憎r 日障帆1 蜡0 d 3 s 岫c b t t e a h n e m ”晰 黧幕嚣燃”一“ 呦娄：嚣辫：蒜一 “一嘲 辨c l f i c i n k 曙c 6 0 m m m n t l 9 8 6 c 目1 ，f日蛆1998 o i i 弛* 昏 一。御n 删m 一。m s ”一 一一时、嚣蜊”羹釜群器 p 9 m a m l z 胡t 9 舶 f m b 如a d j 嘲 a k 2 c o l l l 0 0 当船m 一啮a l “f l l ，一 。 o 陋 i a 虹1 9 9 2 h 8 s 托m 0 佃1 撇 黑窭旒篇管m 一 恂。 篓釜譬蠹慧篇羹誊辫 a 翩卿肿_ o i b a f 畦e a 1 9 蜉 p “b 虹1 9 9 9 b o m2 0 s u r ! a o l r h r 璺掣t 。e m 一鲁篡：掣。m 删 哟n 警鏊慧：黯：要= 删；蚰。：越；3 磬 摊i 如 d n a 探针固定必须考虑四个因索。第一，被固定的物质必须在后续的分析步 骤中非常稳定，也就是固定的生物识别分子不能从基片表面脱落；第二，d n a 探 针固定后不能影响其性质，也就是固定技术不能改变探针的化学构象，否则将改 变其生物识别功能；第三，生物分子固定必须有适当的空间取向，才能不阻碍碱 东南大学博士学位论文 基配对；最后，即使有适当的空间取向，固定的探针还不能由于探针密度影响， 存在空间位阻而阻碍靶d n a 接近。 叫嵌入聚合物中这种方法中，生物识别分子嵌入或交连于经过化学、电化学、 光化学或热处理的聚合物。结合d n a 的聚合物可以是有机、无机或金属