（化学工程专业论文）乳制品中防腐剂高效液相色谱检测方法的研究.pdf

山东大学硕士学位论文 中文摘要 本实验以酸牛奶为例，用高效液相色谱法检测乳制品中苯甲酸和山梨酸两 种防腐剂含量，研究和摸索乳制品样品的前处理方法，建立一种可以用高效液 相色谱对乳制品中苯甲酸和山梨酸进行定性定量检测的方法。该方法简单易行， 所用试剂均为常规试剂。当苯甲酸和山梨酸的浓度范围在o o 1 m g m l 时，苯 甲酸和山梨酸标准曲线的相关系数分别为r 2 = o 9 9 9 9 和r 2 - o 9 9 9 8 ；方法精密度 为1 6 9 ，标准品添加浓度在0 0 1 9 k g o 1 9 k g 的范围内时，苯甲酸的回收 率范围在7 5 9 1 7 之间，平均回收率达8 6 2 ；山梨酸的回收率范围在 9 1 0 9 6 1 0 5 9 之间，平均回收率达9 7 5 。 关键词：高效液相色谱，乳制品，苯甲酸，山梨酸，检测 山东大学硕士学位论文 a b s t r - a c t t h er e s e a r c hi st os t i l d y 趾de x p l o 陀am e t l l o d 饧rp r e t l 咖e n ta t o u tt h e d t m m n i n a 虹o no f b ：n z o i ca c i d 觚ds o r b i ca c i di n ) ，o g u n 1 w oi l n p t a n ti n d i c 抛r so f p r e c i s i o n 孤dr e c o w 堰yc 锄t e s t i 匆t l l ef e 笛i b i l i 够o f t l 地m e t l l o d a n o t h e ro b j e c v eo f 也e 舒卿喇m e n ti st oe s t a b l i s hag o o dm e t l l o d 缸dv e r i 鸟t h ef 宅a s i b n i 哆o f t h em e m o d b yh p l c ，r 觚g 丘d m 也ec a l c t l l a t i o n 趾dt h es e d i n l e l l t a r yr e a g tt or 锄o v e 肚i n a l l df a ti nm a n ya s p e c t ss u c h 船d e t e m i n a t i o nt h e 珑咖，f - i n gq 嘶匆锄d s t d b i l i qa n di n d i c a t o r so fp r e c i s i o na n dr e c o v lr e s m t ：t h em t i o no fp r c c i s i o ni s 1 6 9 ，w h e nt h e 船a ls 黜p l ei sb e t w e e no 强d3 0 m g l ，i n d i c a t o ro f 舱c o v e r y a b o u tb e n z o i ca c i di s7 5 - 9 1 7 ，a n dt l l ca v e r a g cr a t i o no fr e c o v e r yi s8 6 2 ， i l l d i c a t o ro fr e c o v e r ya b o l l ts o r b i ca c i di s9 1 o 1 0 5 9 ，a i l dm ea v e m g er a t i o no f r e c o v e 巧i s9 7 5 t h er e s u l t ss h o w c dt h a tt h em e t h o dw a ss i r n p l e ，r 印i d ，a c c u r a t c a n de 孙yt oo p e m t c i th a sb e e na p p l i e df o ra c t u a ls 锄p l e s 、i ms a t i s f a c t o r yr c s u h s k e yw o r d s ：h p l c ，d a i r yp r o d u c t s ，b e n o i ca c i d ，s o r b i ca c i d ，d e t c c t i o n n 附件一 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名 百雅 r 一 日期 斗p 7 、 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 一：草翩躲雏日期 净d j | 山东大学硕士学位论文 1 1 课题的研究背景 1 1 1 中国乳制品发展现状 第一章引言 中国乳制品业近年来发展迅速，中国已经成为世界乳制品生产与消费的主 要国家之一，随着经济的发展，人民生活水平的不断提高，我国居民对乳制品 的消费会进一步增强。乳制品业的发展不但有利于改善我国居民的膳食营养结 构，而且对增加农民收入，优化农业产业结构也具有重要意义。现在是对中国 农村产业结构进行战略性调整的关键时期，乳制品业有可能成为今后农业发展 的一大支柱产业。乳制品业是一个涉及面广，牵动性强的特色行业，它的发展 对种植业，畜牧业，饲料加工业，食品添加剂行业以及包装业等都有很强的拉 动作用，应当大力发展。 当前，人们已经对乳制品有了一定程度的消费，但乳制品在我国居民的食品 消费结构中所占的份额仍然很低，中国人均乳制品年消费量仅占世界平均水平 的l 1 6 ，甚至不足某些发展中国家的1 5 。中国的乳制品总产量也不到世界总 量的2 。随着人们生活水平的提高，饮食结构的改善，乳制品作为“最接近完 善的食物”，日益受到人们的重视，所以说我国乳制品业发展前景非常广阔，但 同时中国乳制品业具有奶畜单产水平低，企业规模较小，乳制品品种单一，乳 制品贸易额在整个农产品贸易额中的比重小等特点。 在加入w t o 后，由于我国关税的降低，国外乳制品会以其质优、价廉等优 势来占领市场，我国的乳制品行业将面临巨大的冲击。 1 9 9 5 年以来，我国乳制品行业呈现快速、强劲的发展态势，行业的总产值以年均 2 4 3 的速度增长。另据中国乳制品工业协会预测，未来几年，我国乳制品消费将 大幅度增加，特别是液态奶，大量数据充分表明我国乳制品市场有巨大的发展 潜力。乳制品业实质上是个把现代工业、现代商业和现代农业紧密结合起来 的行业，世界上发达国家的乳制品业已成为农业中的第一产业，产值占农业产值 的2 0 9 6 4 0 9 6 ，法国乳制品业的产值甚至超过汽车工业。乳制品业做为高 山东大学硕士学位论文 效的畜牧产业，世界各国都普遍重视其发展，我国也大力鼓励发展该产业， 乳制品业已列为国家重点扶持项目。 2 0 世纪9 0 年代以来，随着中国国民经济的持续快速发展和人民收入的稳 步增加，中国人民的生活逐步由温饱迈向小康。在这个转变的过程中，人们的 健康观念加强，已由单纯追求食物的数量转向追求食物的质量和营养，改善膳 食结构，增加膳食营养，增强体质已成为中国人民提高生活水平和生活质量的 一个非常重要的方面。但在人们对优质食物的需求不断增加的同时，中国人口 仍在不断的增加，耕地逐渐减少，食物尤其是优质食物的供需矛盾十分突出。 因此，大力发展节粮，经济，高效的乳制品业，对满足人们的需求及实现中国 农业的可持续性发展都具有非常重要的现实意义。 第一、乳制品营养丰富而全面。鲜奶中有上百种化学成分，总乳固体平均 质量分数为1 3 9 ，脂肪4 o ，蛋白质3 4 ，乳糖4 8 ，无机盐o 8 ( 其 中钙0 1 1 ) ，含有几乎所有的脂溶性和水溶性维生素，营养价值十分丰富， 有全价食品之誉。乳制品不仅富含人体生长发育所必须的各种氨基酸，维生素 和矿物质，而且易于消化吸收，是人体蛋白质和钙的最好来源，有“完善食物”、 “人体保姆”、“白色血液”等美称。乳制品符合当前膳食结构调整的需要，能 显著提高人们的身体素质，是提高人民营养水平，增强国民体质不可以缺少的 优质食物，大力增加乳制品的生产和供给，既可以满足人们对于优质食物不断 增长的需求，又是实现党中央提出的“营养战略”的重要途径。 第二、奶畜是饲料转化效率极高的家畜。奶牛能将饲料中能量的2 0 、蛋 白质的2 0 3 0 9 6 转化到牛奶中：用1 k g 饲料喂奶牛所能获得的动物蛋白比喂猪 所产出的至少高两倍。从节粮的角度看，生产l k g 牛奶只需o 4 到0 5 k g 精 饲料，比生产同等重量的猪肉节约很多精饲料。不仅如此，反刍动物特有的消 化系统能将含在饲料中的纤维素作为能量加以吸收，还能利用低等植物蛋白和 非蛋白氮转化为高等动物蛋白，从而在很大程度上避免了与其他牲畜争夺精饲 料。 第三、乳制品业包括了奶牛的饲养、挤奶、原料奶的收购、乳制品的加工、 乳制品的运输、乳制品的销售等环节，第一、二、三产业都有涉及，通过发展 乳制品业，可以带来饲料种植业、畜牧业、运输业、包装业等多个行业的兴旺， 2 山东大学硕士学位论文 创造大量的工作机会，还能增加从业人员的收入，促进我国经济的增长，可谓 是一举多得。世界上有很多国家通过发展乳制品业，带动了农业的进步，实现 了经济的增长，这些国家特别是一些乳制品业发达国家的成功经验，值得我们 认真学习。但我国的乳制品业的发展却不尽如人意，目前我国牛奶人均占有量 不到1 0 k g ，世界平均水平是1 0 0 k g ，欧美则达到了3 0 0 k g ，我国与发达国家相比 有着较大的差距，和不少的发展中国家相比我国的牛奶人均占有量也是处在较 低的水平，乳制品也是目前中国人均惟一没有达到世界入均消费水平的主要农 产品。有资料显示，作为世界上第一人口大国，我国鲜奶产量仅为美国的1 5 ， 人均占有奶量仅为世界平均水平的l 1 3 ，为发达国家的1 3 7 。在这种情况下， 全面、深入、系统的研究对促进中国乳制品业的健康发展具有重要意义。如何 快速提高我国的乳制品业的水平，是一个值得研究的重要课题。本文通过对中 国乳制品现状的分析以及对国外发达国家同行业发展经验的借鉴，提出一些建 设性的建议。 近l o 年闻，世界乳制品的需求量年上升率为2 ，今后1 0 年间上升率将为 2 7 ，供给量每年将增2 ，其中，随着人民生活水平的日益提高和政府的引导 和倡导，中国对乳制品需求将变的最高，乳制品的需求逐年增加。据第2 7 届 i d f 世界乳业大会上的数据显示，中国乳业市场已成为全球最大的乳业新增市 场，每年的增长量占据了全球乳业新增量5 0 的份额。中国乳制品需求的增长 竟成为世界乳制品价格上涨的重要因素之一。为了乳制品的保鲜贮存和长距离 运输，许多乳制品中不可避免的添加了各种类型的防腐剂。 1 1 2 乳制品防腐剂概况 防腐剂是用以保持食品原有品质和营养价值为目的的食品添加剂，它能抑 制微生物活动、防止食品腐败变质从而延长保质期。我国对防腐剂的使用有着 严格的规定，明确防腐剂应该符合以下标准：1 、合理使用对人体健康无害；2 、 不影响消化道菌群；3 、在消化道内可降解为食物的正常成分；4 、不影响药物 抗菌素的使用：5 、对食品热处理时不产生有害成分。 目前国内乳制品中常用的防腐剂有：苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其盐类和 亚硝酸盐。我们的实验主要研究的就是乳制品中苯甲酸和山梨酸这两种防腐剂 的高效液相色谱检测方法。 3 山东大学硕士学位论文 1 1 3 苯甲酸和山梨酸简介 1 1 3 1 苯甲酸( c 6 h 5 c o o h ) 简介 苯甲酸( 又称安息香酸) 是一种常用的食品防腐剂，与其钠盐的防腐效果 相同，它对多种微生物细胞的呼吸酶系的活性有抑制作用，并对微生物的细胞 膜生长有阻碍作用，从而达到抑制微生物的繁殖的目的。由于它既能抑制多种 微生物的繁殖，又具有很好的杀菌作用，被广泛用于罐头、果酱、酱油、食醋、 汽水以及各类肉食品中。苯甲酸是各国允许使用，而且历史比较悠久的食品防 腐剂。当苯甲酸进入人体后，会与人体内氨基乙酸( 甘氨酸) 和葡萄糖酸分别 反应生成马尿酸和葡萄糖苷酸，后者会随尿排出体外，所以每日摄取少量苯甲 酸不会对人体形成危害。但是摄入过量的苯甲酸时，却会对人体肝脏造成危害。 因为苯甲酸的戒毒反应是在肝脏中进行的，对肝功能衰弱的人即使摄取少量苯 甲酸也会使病情加重，苯甲酸对皮肤、眼睛和粘膜也有一定的刺激性，苯甲酸钠 可引起肠道不适。联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h 0 ) 试验研究 后规定人体对苯甲酸的每日摄入量为5 l o m g k g ( 体重日) ，我国也对各类 食品中苯甲酸的最大使用量也作了规定。 1 1 3 1 1 苯甲酸的使用及其规定 苯甲酸作为一种防腐剂、抗微生物剂广泛应用于食品工业中，对酵母、霉 菌和细菌都有抑制作用。世界各国对苯甲酸的允许使用量、使用范围限量均 有不同规定。食品添加剂使用卫生标准( g b 2 7 6 0 ) 在对苯甲酸的允许使用范 围规定中无乳制品。瑞士明确规定，苯甲酸不得用于乳制品。食品法典委员会 ( c a c ) 在干酪的一般标准中( c o d e xs t a na 6 1 9 7 8 ，r e v 1 1 9 9 9 ) 中规定， 不经成熟干酪和成熟干酪产品中允许使用的防腐剂为山梨酸及其盐、乳酸链球 菌素、丙酸及其盐；成熟干酪( 包括霉菌成熟干酪) 中允许使用的防腐剂为山 梨酸及其盐( 仅限于表面、外壳) ；切片、切块、切丝或搓碎干酪中允许使用的 防腐剂为山梨酸及其盐”3 。可见，苯甲酸均不在允许使用范围之列。苯甲酸作 为食品添加剂在规定使用限量内是安全的，但是苯甲酸在使用上也存有争议。 有研究表明，因苯甲酸具有一定毒性，且其毒性比山梨酸强，在不少国家已逐 步被山梨酸取代”。摄入过量的苯甲酸会加重肝脏负担，危害人的身体健康 。目前也有苯甲酸引起累积中毒的报道n “”，h a c s g ( 欧共体儿童保护 4 山东大学硕士学位论文 集团) 认为苯甲酸不宜用于儿童”食品。 1 1 3 1 2 食品中苯甲酸的来源 研究表明，苯甲酸自然产生于多种食品中，大部分浆果如成熟的红莓、青梅、 李、肉桂、成熟的丁香等约含o 0 5 的苯甲酸，安息香胶( g u m b e n z o i n ) 中含 有高达2 0 的苯甲酸“，n a g a y 锄a 报道”1 水果、蔬菜、坚果中自然存在苯甲 酸；h a r b o r n e 报道“，苹果在被真菌感染后也会自然产生苯甲酸；s t e e g 报 道，蜂蜜含有1 0 1 0 0 m g k g 苯甲酸。s i e b c r 等1 对某些食品中检出的苯甲 酸结果表明：牛奶中含有o 6 m g k g ；土豆、蚕豆谷类中含有0 o 2 m g k g ； 水果中含有0 m g k g ；坚果、黄豆中含有1 2 1 1 m g k g 。苯甲酸同时作为一 种食品添加剂应用于食品加工中，因此，食品中苯甲酸来源存在食物中的天然 成分和食品添加剂部分。 文献报道，乳品中不同程度含有苯甲酸。表1 表3 分别为各国研究人员 对牛奶、不同品种酸奶，发酵乳制品中苯甲酸含量检测结果。 表1 牛奶样品中苯甲酸的含量h3 m g k g 样本量平均值 o 2 5 1 o 7 l0 1 8 o 4 5 4 由表2 和表3 可以看出，不同品种酸奶及其他一些乳制品中均检出苯甲 酸，其中酸牛乳中苯甲酸最高检出值为3 9 m g k g ，乳清粉也检出较高含量的苯 甲酸。s i e b e r 等n 钉研究表明，乳制品的发酵过程中，原料乳在乳酸菌作用下， 马尿酸脱甘氨酸生成苯甲酸，从而使酸牛乳中天然苯甲酸含量增加。马尿酸 ( h i p p u r i ca c i d ) 又名苯甲酰甘氨酸、苯甲酰氨基乙酸2 “，是牛乳中的有机 1 2 2 l 2 2 4 山东大学硕士学位论文 酸成份，其质量浓度为3 0 6 0 m g 几2 “。因此苯甲酸被认为 表2 不同品种酸牛奶中苯甲酸的含量g k g 样品样本量平均值范围 酸奶 酸奶“1 酸奶2 1 普通酸奶“1 脱脂酸奶“ 脱脂酸奶1 7 1 脱脂酸奶”3 1 脂肪酸奶n 93 3 6 脂肪酸奶”1 全脂酸奶”1 水果酸奶“1 水果酸奶1 93 水果酸奶”1 水果酸奶“3 4 1 1 2 8 6 4 2 3 4 0 8 l o 9 2 1 8 1 0 5 2 5 1 3 1 8 2 2 5 1 9 3 2 1 4 3 2 6 2 5 1 5 o 2 4 4 1 6 4 水果酸奶1 。1 51 2 28 1 6 是一种天然成分存在于发酵乳制品中”，其反应式如图l 所示。 小黥如一d h 叫 图l 马尿酸转化为苯甲酸反应式 6 一 一 盯 船 挎 砣 卅 q q q 掩 均 弘 驴 山东大学硕士学位论文 g u s e y d i l z b 瞳在开菲尔的发酵过程中对z e l 一有机酸测定发现，马尿酸 在发酵过程中减少，5 h 后马尿酸含量基本消失，发酵过程结束后已无马尿酸 残留检出。谢国祥等13 在对酸牛乳中苯甲酸自然形成的研究表明，乳酸菌在 高温短时间发酵3 b 后乳中马尿酸已基本消失，且酸牛乳中马尿酸在乳酸菌作用 下生成苯甲酸是不可逆的，马尿酸和苯甲酸的反应生成量为l ：l 。对食品中马 尿酸的检测研究中，h a t a n a k a 1 采用高效液相色谱法检测牛奶中马尿酸的含量， 最低检测限为o 1 m g l 【g ，s t i j v e ”报道了高效液相色谱法检测酸奶中马尿酸 的含量，最低检测限为5 i g k g 。目前国内文献 表3 其他乳制品中苯甲酸的含量m g k g 酪乳1 1 开菲尔1 93 开菲尔“1 乳清“】 乳清粉“1 4 3 3 3 6 1 4 5 1 2 6 5 0 o l o 1 9 1 8 2 3 8 1 9 1 2 1 3 2 3 7 5 有乳制品中马尿酸的高效毛细管电泳测定法“”。谢国祥等研究了高效 液相色谱法检测牛乳中的马尿酸，最低检测限为0 0 9 m g k g 。因此，监测原 料乳中马尿酸含量对预测酸牛乳成品中自然形成的苯甲酸含量有实际意 义。l 数据表明，牛乳中也含有一定量的表天然苯甲酸。s a j k o 报道1 ，乳 链球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o i l ) 及荧光假 单孢菌( p s e u d o n a s f l u o r e s c e n s ) 在牛奶中可生成苯甲酸。无乳链菌 ( s t r e p t o c o c c u sa h a l a c t i a e ) 、f 争孚l 链菌( s t r e p t o c o c c u s d y s a g a l a c t i a e ) 、 乳房链球菌( s t r e p t o c o c c u su b e r i s ) 等微生物污染均会导致奶牛患乳腺 炎口2 2 “，因此，乳腺炎乳、腐败变质乳中苯甲酸含量会有所升高，因此 原料乳卫生质量也应得到良好控制。 1 1 3 2 山梨酸( c h 3 c h - h c h h c 0 0 h ) 简介 山梨酸( 又名花楸酸) 是国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全的防腐 保鲜剂，是目前被公认的最安全的防腐剂。能有效地抑制霉菌，酵母菌和好氧 7 山东大学硕士学位论文 性细菌的活性，还能防止肉毒杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌等有害微生物的生长 和繁殖，但对厌氧性芽孢菌与嗜酸乳杆菌等有益微生物几乎无效，其抑止发育 的作用比杀菌作用更强，从而达到有效地延长食品的保存时间，并保持原有食 品的风味。它是一种不饱和脂肪酸，可以在人体内参与正常的代谢活动，被人 体的代谢系统吸收而迅速分解为二氧化碳和水，在体内无残留，毒性低于苯甲 酸及其盐类，但是价格高于苯甲酸。近年日本报道用添加1 5 的山梨酸的饲料喂 小白鼠，1 5 只中有一半患了肝癌，可见最安全的防腐剂也不可靠，长期过量食 用同样会对人体肝肾造成损害。 1 1 4 我国国家标准的相关规定 1 1 4 1 含量规定 国家标准g b 5 4 0 8 1 1 9 9 9 巴氏杀菌乳，g b 5 4 0 8 2 1 9 9 9 灭菌乳中规定，纯 鲜牛奶中不得添加苯甲酸和山梨酸；在g b 2 4 7 6 1 9 9 9 酸牛乳中规定，纯酸牛乳 和调味酸牛乳中苯甲酸含量要0 0 3 9 瓜g ，不得含有山梨酸；在g b 2 7 0 6 1 9 9 6 食品添加剂使用卫生标准中规定苯甲酸在含乳饮料中不得添加，山梨酸在 含乳饮料中除乳酸茵饮料最大使用量不得超过1 o 眺g 外，其他都不能添加。果 料酸牛乳中苯甲酸和山梨酸都不得超过o 2 3 k g 。 1 1 4 2 检测方法规定 g b 厂r 5 0 0 9 2 9 - 2 0 0 3 ( 食品中山梨酸、苯甲酸的测定) 在对食品中苯甲酸、 山梨酸的检测共推荐了三种方法，分别是气相色谱法、液相色谱法和薄层色谱 法。气相色谱法的检验原理是：试样酸化后，用乙醚提取山梨酸和苯甲酸，用 负氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列进行比较定量； 液相色谱法的检测原理是：样品加温除去二氧化碳和乙醇，调p h 至近中性， 过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定 性和定量；薄层色谱法的检测原理是：试样酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨 酸，将试样提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开。显色后，根据薄层板上 苯甲酸、山梨酸的比移值，与标准比较定性，并可进行概略定量。 使用气相色谱法，样品前处理过程较为繁琐，而使用薄层色谱法，不能进 行准确的定量，而使用液相色谱法，定量检测苯甲酸和山梨酸的同时，在不需 8 山东大学硕士学位论文 改变实验方法和条件的情况下还可以准确检测出另一种食品添加剂糖精钠 的含量。所以我们的实验确定选择高效液相色谱法来测定乳制品中苯甲酸和山 梨酸的含量。 1 2 目前国内外的研究进展 目前，欧美许多国家已经不允许在乳制品中添加苯甲酸这类的防腐剂，所 以国外已经少有这方面的研究。国内已经有的一些乳制品前处理方面的研究也 大都是针对高效液相色谱法来展开的，其研究的重点大都放在蛋白质沉淀方法 的选择上。 1 2 1 使蛋白质沉淀的几种方法 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀( p f e c i p i t a t i o n ) ，变性 蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的 蛋白质也可不发生沉淀。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即 颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳 定因素( 如调节溶液p h 至等电点和加入脱水剂) 蛋白质便容易凝集析出。如将 蛋白质溶液p h 调节到等电点，蛋白质分子呈等电状态，虽然分子问同性电荷 相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用， 如果这时再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互 相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节p h 到等电点，也 同样可使蛋白质沉淀析出。引起蛋白质沉淀的主要方法有下述几种： 1 2 1 1 盐析( s a i t i n go u d 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析 出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。调节蛋 白质溶液的p h 至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。 1 2 1 2 重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件 以p h 稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离 子结合成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的。 9 山东大学硕士学位论文 1 2 1 3 生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂( 如苦味酸、钨酸、鞣酸) 以及某些酸( 如三氯醋酸、 过氯酸、硝酸) 结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是p h 小于等电点，这 样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。 1 2 1 4 有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能 破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉 淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则 变性进行较缓慢。 1 2 1 5 加热凝固 将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固( c o a g i l l a t i o n ) 而沉淀。加热首先是加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不 规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白 块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。 蛋白质的变性、沉淀，凝固相互之间有很密切的关系。但蛋白质变性后并 不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定 凝固。例如，蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带着大量电荷，故仍 溶于强酸或强减之中。但若将强碱和强酸溶液的p h 调节到等电点，则变性蛋 白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚 固的凝块。 在 玎? l c 检测乳制品样品中防腐剂的过程中，大都选用混合重金属盐体系 作为蛋白质的沉淀剂【l 】。 1 2 2 色谱条件的选择 流动相：g b 厂r 5 0 0 9 2 9 2 0 0 3 ( 食品中山梨酸、苯甲酸的测定) 中液相色谱法推荐 使用的是5 甲醇+ 9 5 o 0 2 n 1 0 1 几乙酸胺；在i d f l 3 9 ：1 9 8 7 中流动相选择 的是10 9 6 甲醇+ 9 0 9 6 p h 6 7 的磷酸盐缓冲液。 固定相：反相c 1 8 柱。 l o 山东大学硕士学位论文 u v 检测波长：苯甲酸的最大紫外吸收波长在2 2 7 衄处，而山梨酸的最大紫外吸收 波长在2 5 0 衄处。为了能够同时检测两种防腐剂，我们还是将紫外 检测器的波长设在了2 2 7 i 吼处。 流速：一般不超过1 2 m i 知i n ，可根据具体实验条件自行确定。 1 2 3 前处理方法 一般有超声震荡法萃取法，有机溶剂萃取法。 1 3 本实验的目的和意义 目前，对于检测食品中苯甲酸和山梨酸的高效液相色谱法，国家标准中并 没有强制性的规定，尤其是对于样品的前处理方法，g b 厂r 5 0 0 9 2 9 2 0 0 3 ( 食品 中山梨酸、苯甲酸的测定) 中的液相色谱法，仅仅是推荐性地说明了汽水果汁 类、配制酒类样品的前处理方法，对其他成分更为复杂的样品未作任何规定说 明，应该说国家标准在样品处理方法上存在着不足。在各种饮料中，乳制品可 以说是成分最为复杂的一种，而且它富含蛋白质和脂肪，这两种物质都具有粘 性，会损坏和污染色谱柱，还会影响待测物质的分离与检测。不能如汽水、果 汁、酒类等样品经简单处理后即可进样。目前，对于乳制品中苯甲酸和山梨酸 的高效液相色谱检测的样品的几种前处理方法的优劣，各文献说法不一。本试 验的目的就是根据实验室现有的条件、仪器和设备，选择合适的沉淀体系，摸 索乳制品样品前处理的方法和条件，并通过高效液相色谱得检测，从精密度与 回收率的角度对方法加以验证。试图找到一种可用于高效液相色谱检测乳制品 中防腐剂的样品前处理方法。 1 4 高效液相色谱( h p l c ) 简介嘲 构成高效液相色谱仪的主要装置有：储液罐、高压输液泵、进样装置、色 谱柱、检测器、记录仪和数据处理装置。 1 4 1 高效液相色谱法的应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子 山东大学硕士学位论文 量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然 的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品 及环境污染物等，约占全部有机化合物的8 0 9 6 。其余2 0 的有机化合物，包括永 久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。 1 4 2 高效液相色谱法的优点 ( 1 ) 分离效能高一由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱 的柱效可达5 1 0 3 3 1 0 4 块m 理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱1 0 3 块m 理 论塔板数的柱数。 ( 2 ) 选择性高由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善 分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合 物及其同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效 的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要作用。 ( 3 ) 检测灵敏度高在高效液相色谱法中使用的检测器大多数具有较高 的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达1 0 。9 9 ；用于痕量 分析的荧光检测器，最小检出量可达1 0 d 2 9 。 ( 4 ) 分析速度快一由于高压输液泵的使用，相对于经典液相( 柱) 色谱， 其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品 的分析时间仅需几分钟到几十分钟。 ( 5 ) 使用了非破坏性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动 相，实现对少量珍贵样品的回收。 1 4 3 高效液相色谱法的局限性 ( 1 ) 在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成 本高于气相色谱法，且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时，它比气相色 谱法的程序升温操作复杂。 ( 2 ) 高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器( 如热导检 测器和氢火焰离子化检测器) 。近年来蒸发光激光散射检测器的应用日益增多， 有望发展成为高效液相色谱法的一种通用型检测器。 山东大学硕士学位论文 ( 3 ) 高效液相色谱法不能代替气相色谱法，去完成要求柱效高达l o 万块理论 塔板数以上，必须用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产 品。 ( 4 ) 高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在2 0 0 好a 至l m p a 柱压下 去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。 1 5 实验设计构想 选择几种蛋白质沉淀体系，从沉淀效果、前处理过程的难易程度和色谱定 性、定量分析上对沉淀剂进行选择，选择的主要目标就是精密度( 定量检测的 准确性) 和回收率( 最大限度地减少待测组分的损失) 。并通过检测其它种类的 乳制品对方法进行推广性验证。 山东大学硕士学位论文 第二章实验方法 2 1 实验设备和材料 2 1 1 实验设备 仪器 h p 高效液相色谱仪1 1 0 0 u v 检测器 样品过滤器( 带有0 4 5 岬水相滤膜) 溶剂过滤器( 带有o 4 5 岫1 水相滤膜) 抽滤器 酸度计 超声波清洗器 电子天平 2 1 2 实验材料 试剂级别 苯甲酸基准品 山梨酸基准品 甲醇色谱纯 乙腈色谱纯 亚铁氰化钾a r 乙酸锌 a r 硫酸锌 a r 乙酸铅ar 草酸钾a r 1 4 生产厂家 美国a g i l e n t 公司 美国a g i l e n t 公司 美国a g i l e n t 公司 天津市腾达仪器厂 天津市腾达仪器厂 海康仪仪器有限公司 江苏扬中市电子器材公司 美国电子器材公司 生产厂家 天津福晨化学试剂厂 上海三浦化工有限公司 天津福晨化学试剂厂 天津福晨化学试剂厂 上海试剂一厂 天津市天河化学试剂厂 天津市天河化学试剂厂 天津市化学试剂三厂 天津市化学试剂三厂 山东大学硕士学位论文 磷酸氢二钾a r山东莱阳经济技术开发区精细化工厂 磷酸二氢钾a r山东莱阳经济技术开发区精细化工厂 氨水ar青岛海滨化学试剂厂 硫酸ar莱阳市康德化工有限公司 氢氧化钠a r山东莱阳经济技术开发区精细化工厂 样品：原味酸牛奶、高钙酸牛奶、纯牛奶、酸酸乳、奶粉 实验所用水至少为蒸馏水，配制流动相和标准溶液的水为超纯水 2 1 3 各种溶液的配置方法及浓度 ( 1 ) 苯甲酸和山梨酸混合标准溶液的配制： 准确称取o 1 9 苯甲酸和o 1 9 山梨酸，于1 0 0 1 n l 容量瓶中，加入3 0 n 1 l 甲 醇，摇匀待苯甲酸和山梨酸完全溶解，冷却后，用超纯水定容至刻度并摇匀。 溶液中苯甲酸和山梨酸的浓度均为1 m 鲈n l 。此溶液在冰箱保存可放三周。 ( 2 ) 苯甲酸标准溶液的配制： 准确称取o 1 9 苯甲酸和o 1 9 山梨酸，于1 0 0 m l 容量瓶中，加入3 0 m l 甲 醇，摇匀待苯甲酸和山梨酸完全溶解，冷却后，用超纯水定容至刻度并摇匀。 溶液中苯甲酸和山梨酸的浓度均为1 m 酌咀l 。此溶液在冰箱保存可放三周。 需要更低浓度苯甲酸和山梨酸标准溶液时，移取一定体积的混合标准液， 用3 0 的甲醇水稀释。 ( 3 ) p h = 6 7 的磷酸盐缓冲溶液： 称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钾各2 5 9 于1 0 0 0 m l 容量中，加水，摇匀，并 定容到1 0 0 0 m l ，用溶剂过滤器过滤。 ( 4 ) 亚铁氰化钾溶液( 1 0 6 9 ，l ) ： 称量1 0 6 9 亚铁氰化钾于1 0 0 m l 容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解， 加水至刻度并摇匀。 山东大学硕士学位论文 ( 5 ) 乙酸锌溶液( 2 1 9 9 l ) ： 称量2 1 9 9 乙酸锌于l o o n l l 容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解 加水至刻度并摇匀。 ( 6 ) 硫酸锌溶液( 2 8 8 9 ，l ) ： 称量2 8 8 9 硫酸锌于1 0 0 m l 容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解加水 至刻度并摇匀。 ( 7 ) 草酸钾一磷酸氢二钾溶液： 称取草酸钾3 9 、磷酸氢二钾7 9 溶于l o o m l 水中 ( 8 ) 乙酸铅溶液( 2 0 0 9 l ) ： 称量2 8 8 乙酸铅于l o o m l 容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解加水至刻 度，摇匀。 ( 9 ) 氨水( 1 + 1 ) ：氨水与水以1 ：1 的比例混合。 ( 1 0 ) 硫酸溶液( o 5 m o n ) ： 将3 m l 硫酸小心缓慢加入5 0 n 1 l 水中，待冷却后用水加到1 0 0 n ：l l 。 ( 1 1 ) 氢氧化钠溶液( 1 5 m o l l ) ： 称量o 4 9 氢氧化钠于1 0 0 n l l 容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解加水至 刻度，摇匀。 2 2 实验方法 2 2 1 实验原理 样品加沉淀剂沉淀蛋白，除去蛋白质后，滤液调p h 至近中性，过滤后进 高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，跟标准品色谱图进行比对，根据待测物 质的保留时间进行定性，根据色谱峰面积和定量。 2 2 2 样品前处理 液态样品称量之前，需用电热套微温加热，并搅拌使之均匀。待样品冷却 后称重。本实验选择原味酸牛奶作为实验材料。 1 6 山东大学硕士学位论文 样品进样前的处理分为四个部分：( 1 ) 沉淀蛋白质；( 2 ) 收集滤液；( 3 ) 调节滤 液的p h 值；( 4 ) 用带o 4 5 肛m 滤膜的样品过滤器过滤滤液。 其中( 3 ) 、( 4 ) 两个步骤基本是一致的，处理过程的差异主要集中在( 1 ) 、( 2 ) 两个步骤，它决定了计算方法的不同。我们决定采用同一种方法计算，所以处 理方法的差异就集中在沉淀过程。在实验之初我们共选择了三种沉淀体系和四 种沉淀方法。后来，为了提高方法回收率，我们又对前处理的方法加以改善， 共五种方法。 ( 1 ) 亚铁氰化钾醋酸锌沉淀体系( 方案一) 唧 称量1 0 9 样品于5 0 m l 烧杯中，加入1 2 5 m i n a o h 化钠溶液，混匀后将烧 杯放入超声波水浴1 5 m i n 。冷却后，用硫酸溶液调p h 至8 0 ，加入1 m l 亚铁氰 化钾溶液和1 m l 醋酸锌溶液，混匀，静置1 5 m i n ，加入2 0 m l 甲醇，混匀后冷却 到室温，转移到5 0 m l 容量瓶中并定容到5 0 m l ，摇匀放置1 5 m i n 。 ( 2 ) 亚铁氰化钾醋酸锌沉淀体系( 方案二) 1 4 j 称量1 0 9 样品于5 0 i n l 容量瓶中，加入2 m l 亚铁氰化钾溶液和2 n l l 醋酸 锌溶液，加水至刻度，混匀后静置l 1 5 小时。 ( 3 ) 乙酸铅草酸钾一磷酸氢二钾沉淀体系( 方案三) 阴 称1 0 9 样品予5 0 i i l l 容量瓶中，加入8 m l 乙酸铅溶液和8 m l 草酸钾 磷酸氢二钾溶液，加水至刻度，混匀后静至1 5 m i l l 。 ( 4 ) 亚铁氰化钾硫酸锌沉淀体系( 方案四) 称量1 0 9 样品于5 0 m l 容量瓶中，加入2 l l 亚铁氰化钾溶液和2 m l 硫酸 锌溶液，加水至刻度，混匀后静置l 1 5 小时。 ( 5 ) 乙酸铅草酸钾一磷酸氢二钾沉淀体系( 方案五) 称1 0 9 样品于5 0 舶l 容量瓶中，加入8 l l 乙酸铅溶液和8 m l 草酸钾磷 酸氢二钾溶液，加甲醇定容至刻度，混匀后静至1 5 m i n 。 除去蛋白的滤液用1 + 1 氨水调p h 值至7 ( 方案一可以省去此步骤) ，再次 过滤后，经带o 4 5 岫滤膜的样品过滤器过滤后进样检测。 收集滤液的方式有四种：( 1 ) 直接吸取沉淀后的上清液；( 2 ) 4 0 0 0 r p m 离心 1 7 山东大学硕士学位论文 1 0 i n i n 后收集上清液；( 3 ) 过滤蛋白后收集上清液；( 4 ) 抽滤后得到上清液。 本实验中都采用抽滤的方式。 2 3 液相色谱检测方法 2 3 1 高效液相色谱条件 流动相：1 0 乙腈+ 9 0 磷酸盐缓冲液( p h 6 7 ) 色谱柱：反相c 1 8 柱 流速：l m i ，m i n 进样量：5 此 u v 检测器检测波长：2 2 7 衄 柱温：室温 2 3 2 样品的定性分析 混合标准溶液与苯甲酸标准溶液各进样一次，得到苯甲酸和山梨酸的保留 时间。 处理后的样品进样检测，通过苯甲酸和山梨酸的保留时间定性，看待测样 品中能否检测出苯甲酸和山梨酸，并观察待测组分的分离情况。淘汰分离度不 好或者与其它方法相比，峰面积明显偏低的沉淀体系或前处理方法。此步骤中， 各处理方法所用的样品应为同一袋样品。 2 3 3 标准曲线的制作 准确移取1 m 咖l 的苯甲酸和山梨酸的混合标准液o 1 m l 、o 4 m l 、o 6 n 1 l 、 o 8 m l 、1 m l 于1 0 r i l l 容量瓶中，用3 0 甲醇水定容至刻度，配制成浓度分别 为o 0 1 m 咖l 、o 0 4 m 鲈n l 、o 0 6 m g m i ，、o 0 8 m g ，m i ，和o 1 m g n 1 l 的系列梯度 混合标准液，进样检测，每个浓度标准液进样两次，峰面积取平均值。 以标准液浓度( m 咖l ) 对峰面积平均值作图，分别得到苯甲酸和山梨酸的 标准曲线。 2 3 4 样品的定量分析 1 8 山东大学硕士学位论文 用不同方法对同一样品进行处理，进样检测，根据待测组分的保留时间定 性，根据峰面积和标准曲线的回归方程定量。计算样品中能检测出的苯甲酸和 山梨酸的含量。淘汰检测含量明显偏低的方法。根据收集滤液的方法不同，浓 度与含量的换算公式如下： 检测浓度( m 咖l ) 首次定容体积( m l ) 样品中待测物质含量( 眺g ) = 样品中待测物质含量( g 瓜g ) = 样品质量( g ) 检测浓度( m 咖l ) 抽提液的体积( m l ) ( a ) ( b ) 样品质量( g ) 我们的实验中都采用抽滤的方式滤过蛋白，所以用公式( b ) 计算。为了计算 的方便，我们将滤液的体积定容到5 0 n 1 l 。 2 4 方法精密度测定 用同一方法处理四个平行样品，记录待测组分的峰面积，根据标准曲线的 回归方程计算出四个样品中苯甲酸和山梨酸的浓度，并换算成含量( 含量根据 样品前处理方法的不同以a 式或者b 式计算) 。计算四个数据的r s d 值。r s d 值应该小于2 【6 】。淘汰精密度不好的方法。 2 5 方法回收率的测定 由于实验样品的特殊性( 酸牛奶的保质期为7 天) ，不同批次的样品中待测 物质的含量有一定差异。所以在此实验步骤中，我们以国家标准中规定的酸牛 奶中苯甲酸的上限含量0 0 3 9 ，k g 的限度为基准。称取三份等质量的样品，向待 测样品中以吨分别添加高( o 1 9 ，k g ) 、中( o 0 3 9 瓜曲、( o 0 1g l 【g ) 低三个浓度 的混合标准液，按照样品处理方法处理样品。进样检测，每个浓度的样品重复 测定三次。回收率的计算按照下面的公式： 1 9 山东大学硕士学位论文 测定的样品浓度一已知的样品浓度 回收率一1 0 0 ( c ) 添加标准品的浓度 2 6 方法的推广性验证 用此方法处理纯牛奶、酸酸乳和奶粉。看此方法对于检测其它种类的乳制 品是否具有可行性。 纯牛奶和酸酸乳的样品处理，同酸牛奶的处理方法一样。 称取3 9 样品于装有5 0 n l l 温水的1 5 0 i n l 容量瓶中，震摇使其溶解，冷却 后，加入8 m l 乙酸铅溶液和8 m l 草酸钾磷酸氢二钾溶液，加入5 0 m l 甲 醇，混