（光学工程专业论文）单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究.pdf

硕士学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 摘要 单模光纤激光共焦扫描成像显微镜是光纤技术与现代光电技术相结合的新型 扫描显微成像系统，由于采用了单模光纤作为点光源和点探测器，排除了离焦光线 对图像造成的模糊和斑点影响因而具有较高的横向和纵向分辨率，能够实现对微 小物体的三维成像，在医疗、生物、物质结构、微电子等领域均具有广泛的应用前 景。 本文从理论和实验上对单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的成像原理进行了 较深入的研究；对单模光纤共焦扫描成像系统中光学系统的光耦合从理论和实验方 面进行了较全面的研究，分析了影响光耦合效率的主要原因；详细研究了系统的扫 描驱动、数据采集、传输和处理的方法，分析了系统存在的问题并提出了解决方法， 在此基础上设计了扫描驱动、数据采集、传输和处理的电子系统并介绍了电子系 统的具体实现过程。 关键词：共焦扫描单模光纤扫描控制，耦合，数据采集 硕士学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 a b s t r a c t s i n g l e m o d ef i b e r - o p t i c a lc o n f o c a ls c a n n i n gl a s e rm i c r o s c o p yi san e ws c a n n i n g m i c r o s c o p i ci m a g i n gs y s t e mt h a ti sb a s e d0 1 1t h em o d e r nf i b e ro p t i c st e c h n o l o g ya n d e l e c t r o n i c st e c h n o l o g y d u i n gt oa p p l y i n gp o i n ts o u r c ea n dp o i n td e t e c t o r , t h es y s t e mc a n r e m o v e st h eo u t - o f - f o c u sl i g h tt h a tm a k e st h ei m a g eb e c o m eb l u r t h e r e f o r e ，i ta c h i e v e s e x c e l l e n tr e s o l u t i o ni na x i a ld i r e c t i o n ，a n dc a na c h i e v e3 - di m a g i n go fm i c r o o r g a n i s m i t h a sab r i g h tf u t u r ei nt h ea p p l i e dd o m a i n so fm e d i c a l ，b i o l o g y ，p h y s i c a ls t r u c t u r e ，a n d m i c m e l e c t r o n i c s i nt h i sp a p e r ，t h ei m a g i n gt h e o r i e so f t h es i n g l e - m o d ef i b e r - o p t i c a lc o n f o c a ls c a n n i n g l a s e rm i c r o s c o p ya n dt h ec a u s e so fa f f e c t i n gt h ef i b e r o p t i c a lc o u p l i n ge f f i c i e n c yi nt h e o p t i c a ls y s t e ma r ca n a l y z e ds y s t e m i c a l l yb a s e do nl o t so ft e s t i n ga n de x a m i n a t i o n s a c c o r d i n gt o t h ea n a l y s e sa n dt e s t i n g ，t h ee l e c t r o n i cs y s t e m ，w h i c h p r o v i d e s t h e f u n c t i o n so fs c a n n i n gd r i v i n g ，d a t aa c q u i s i t i o na n di m a g ep r o c e s s i n g ，a r ed e s i g n e da n d i n t r o d u c e di nd e t a i l s k e yw o r d s ：c o n f o c a ls c a n n i n g ，s i n g l e - m o d eo p t i c a l f i b e r ，s c a n n i n gc o n t r o l ，c o u p l i n g ， d a t aa c q u i s i t i o n 硕士学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 1 绪论 1 1课题的研究背景与意义 随着信息社会的到来，微米甚至纳米级目标的三维图像逐渐被揭示出来，在医 疗、生物、生命科学、遗传基因学、材料科学、精密机械、半导体工业等许多应用 场合，需要研究微小物体的三维结构。共焦扫描显微术具有三维( 3 一d ) 空间成像 能力，已受到国内外学术界和科学界工作者的广泛研究和关注。 普通的光学显微镜的主要缺点是分辨率受到衍射极限的限制，它的分辨率与照 明波长是一个数量级：另一个限制是它的有限焦深。这些限制使利用普通光学显微 术对具有一定厚度的物体成像很困难，普通光学显微镜的像是物面前后一定厚度内 所有断层图像的叠加，因此对厚样品不可能三维成像 j , 2 , 3 1 。激光共焦扫描显微镜是 现代光电技术结合的新型成像系统，它克服了普通光学显微镜观察景深小的缺点， 不但具有普通光学显微镜较高的横向分辨率更具有较高的纵向分辨率；它排除了 离焦光线造成的图像模糊，能够在像面上获得高对比度、高倍放大率的图像；它具 有的亚微米缴纵向分辨能力，能够实现图像的层析，建立起一系列不同高度上的高 分辨率光学断层图像，利用计算机图像处理技术，可实现细微结构的三维成像。因 此激光共焦扫描显微技术是研究细微结构的有效技术手段。 激光共焦扫描显微镜采用了点光源和点探测器，探测到焦点外的信号强度比在 焦点内的信号强度要弱很多，f 是这些焦外的信息使普通显微镜的成像变得模糊。 因此激光共焦扫描显微镜共焦平面的图像不会受到来自共焦点外的扫描反射光线 的影响而变坏，能够实现光学切片。因为激光共焦扫描显微镜突破了普通显微镜在 观察三维结构时受到的限制，它可以将一系列二维断层图片利用计算机合成三维立 体图像，所以它在许多科学领域中都具有重要的现实意义。如在生物医学领域，科 研人员在研究生物组织或样品时通常将其割开、切片，然后用普通显微镜观察，但 样品在切片过程中可能会因变形而破坏了原有结构，造成位置错位等问题，而且对 不能切割的样品将无法观察其内部结构。使用激光共焦扫描显微镜就可解决上述问 题。如在观察生物细胞接受药物处理的反应时，使用激光共焦扫描显微镜在计算机 的控制f 每隔一定时间记录下细胞图像，工作人员可以在实验后从容地观察和研究 细胞受药物作用后的变化情况。所以激光共焦扫描显微技术具有重要的应用价值。 激光共焦扫描显微镜系统中的关键元件是点源和点探测器。传统的光学共焦扫 描显微镜系统中通常利用一微米量级的针孔来构成点光源和点探测器它的结构虽 硕士学1 ：i 7 ：论文单模光纤激光- 共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 然精密但比较复杂，不易于拆卸和清洗，易受扫描机构的振动干扰。而且使用针孔 构成点光源和点探测器存在以下缺点：激光束的会聚点与针孔的对准存在偏差会产 生失真和像差。探测器针孔的对准有亚微米的移动都将导致像差及分辨率的下降； 有灰尘落到其中的一个针孔上，将会减弱信号光强并引入像差；擦除针孔上的灰尘 必将它从装置上拆除下来，而后安装时又得进行极为繁琐的重新对准；扫描结构与 点光源和点探测器等测量机构基本是一体的，因而系统结构比较复杂、笨重。光纤 是现代新技术的光信息传输介质，具有很强的光信号传输和抗干扰能力，同时光纤 还具有很好的柔性等许多优良性质。用单模光纤来代替针孔作为点光源和点探测器 的单模光纤激光共焦扫描显微镜系统，即使激光器会聚点与光纤输入端对准略有偏 差也不会对系统引入像差，所以系统安装调试过程中只需大致对准。光纤端面沾染 灰尘的可能性也大大降低，光纤端面的清洗不需要拆卸及重新对准。而且由于光纤 的灵活性使得激光器、信号探测部分可实现分布式摆放，简化了系统的结构，提 高了抗干扰能力和可靠性。 综上所述，研究单模光纤激光共焦扫描显微镜的成像特性和提高系统的成像质 景有着重要的理论意义和应用价值。 1 2 国内外研究现状 1 9 5 1 年，r o b e r t 和y o u n g 最早提出了扫描显微镜。此后紫外光源的使用和激 光的发明，对扫拙显微镜的发展起到了很大的推进作用。1 9 6 1 年，m m i n s k y 首次 在扫描显微镜的基础上提出了共焦扫描光学显微镜的概念捐1 5 。1 i j 了共焦扫描显微镜 具有纵深分辨特性【4 1 。之后有许多文献5 。2 0 l 报道了该系统在理论和实践方面的研究 工作。在理论上，更加全面的研究了系统的各种特性，提出了许多改进成像质量、 提高成像分辨率的方案。在应用方面，现围外已有正式产品投入市场。如美国 m e r i d i a n 公司制造的h 于遗传工程研究的大功率l c s m 系统，价格在5 0 万美元 左右：德困l e i c a 公刊生产的t s 4 d 型l c s m ，价格为3 0 万美元：这些产品改备 档次高、系统庞大，价格昂贵。 在利用光纤作为激光共焦扫描显微镜系统中的点光源和点探测器方面的研究， 国外是八十年代术、九卜年代初才刀：始的，这方面的研究工作已有文献报道，并在 分析研究光纤激光兆焦扫描显微系统的成像特性方面，获得了初步的研究成果，如： 荚幽得克萨斯大学的z e n g 在1 9 9 3 年激光与光电予国际会议上介绍了一种共焦显微 镜装置。该系统是用连续氩离子激光器4 8 8 n m 光束，经单模双向耦合器进入6 u m 直 径的光纤，光纤木端起共焦针孔和点探测器作用，光束经显微物镜准直和聚焦后照 明物体( 层状样品) 样品反射的荧光经光纤传入光谱引。系统的轴向分辨率为3 7 u m 。 硕+ 学位沦文 革模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术训究 它能帮助医生确定组织的层状结构和诊断反常皮肤生长，能分辨样品的分层结构、 各层厚度和各层荧光相关浓度，而常规方法却不能分辨。澳大利亚的墨尔本大学 b e n s c h o 等利用光纤技术研制了一种非常紧凑小巧的光纤激光共焦扫描显微镜。用 单模光纤连结两个系统，其一是激光器和共焦探测器，其二是扫描系统的小型盘式 读出头。它包括了激光源( 8 0 0 n m 、2 m w ) 、准直透镜、显微物镜、分束镜和用来接 收来自物体信号的四个探测器。然而，整个读出头总高为3 0 m m ，总重量仅为2 0 9 。 该显微镜能测量物体的光振幅和位相变化，并能自动对焦。 国内激光共焦扫描显微技术的研究起步较晚，近些年才有少数单位开展研究： 而在利用光纤作为激光共焦扫描显微镜系统中点光源和点探测器方面，国内更是只 有很少数单位在进行这方面的研究，目前还没有开发出产品。光纤激光共焦扫描显 微镜( l c s m ) 系统作为研究细微结构的有效工具，正在得到国内外学术界和科技工作 者的广泛关注和研究 2 1 - 2 4 。 课题正是在这样的背景下提出的，并且得到了高等学校博士学科点专项科研基 盒资助项目的支持。 1 3 课题研究的主要目的和内容 本课题研究的主要目的是探讨采用单模光纤作为点光源和点探测器构成的光 纤共焦扫描显微成像系统的新原理、新技术，研制单模光纤激光共焦扫描成像系统 数据采集、传输和处坪的实验装置。本课题的研究对于研究丌发具有重要应用前景 的单模光纤激光共焦扫描显微成像系统高新技术产品具有重要的理论与实践价值。 具体研究内容如下。 ( 1 ) 研究用单模光纤取代激光共焦扫描显微镜中的针孔作为点光源和点探测器 对系统成像特性的影响因素及规律。研究系统原理方案的技术实现与关键技术，通 过实验探讨各子模块的实现方法。 ( 2 ) 对扫描显微成像光学系统进行理论和实验研究，探讨系统中各关键节点处 影响光耦合效率的因素、规律和提高光耦合效率的方法。 ( 3 ) 从理论和实验上深入地研究单模光纤激光共焦扫描成像系统的光电探测特 性数据的采集、传输和处理方法；设计扫描驱动、数据采集、传输和处理电路系 统。 ( 4 ) 进行应用b m p 图像文件格式处理图像信号的研究，探讨如何把采集到的图 像信号以一定的图像格式存储成图像文件，便于在此基础上进行图像的后期处理。 硕士学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 2 单模光纤共焦扫描显微成像系统的理论分析 2 1共焦扫描光学显微镜的共焦特性 扫描显微成像技术是5 0 年代初由r o b e r t s 和y o n g 最早提出的。随后，随着激 光器的发明，各种扫描显微镜应运而生。这其中包括：扫描光学显微镜、扫描电子 显微镜、扫描声学显微镜、扫描隧道显微镜、扫描力显微镜、近场扫描显微镜以及 光学共焦扫描显微镜等。共焦扫描光学显微镜与普通光学显微镜的光学系统实质上 是相同的，其主要的差别在于光照射法和光探测法。共焦扫描光学显微镜的共焦特 性司以由图2 1 来说明。 焦 面 探洲器 样品 光 1 6 i 图2 1共焦扫描光学显微镜光路示意图 在图2 1 中，被光源照射的针孔，起点光源的作用；探测针孔及其后的探测器 起点探测器的作用。当光源针孔与物面、探测针孔与物面( 即像面) 都共轭时，称 为“共焦”关系。即样品位于与光源针孔、探测器针孔共轭的物面上。系统被精密 校准时，成像过程用实线表示：由光源通过针孔射出的光，经物镜形成受衍射限制 的光点，此光点照射在样品e 的一点，由该点反射回来的光线再次通过物镜及其后 的探测针孔被探测器所探测，可获得共焦图像”1 。 当样品移出焦平面，即处于“离焦”状态，则其反射光线来自物平面下方或l ： 方物面的反射，大部分反射光线经物镜后不能聚焦到探测针孔里去，而被散射到针 孔之外，使位于观察针孔后面的探测器接收到的光信号的幅度迅速地减少，如图中 用虚线所示。也就是说，位于对准面前后的物面不能成像。 在普通的显微镜中，来自物平面之外的反射光线也将进入日镜而被观察和记 录，使位于物平面上的物体图像变得模糊。因此，共焦扫描显微镜比普通显微镜所 获得的图像具有更好的对比度和更高的分辨率。故用共焦扫描光学显微镜观察一个 硕十学位论文单棋光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 透明的样品时样品的物平面可以进行轴向前后移动，从而得到样品轴向不同高度 处薄层的图像，实现了“光学切片”。这是普通显微镜所无法实现的。 共焦扫描光学显微镜使用点光源照射与点探测器探测对样品或光束进行共焦 扫描，而在某一时刻样品上仅一点被照明，所以整个图像是由一个像元接着一个像 元形成的。 2 2 薄透镜的成像原理 共焦扫描显微镜通常包括两个光学透镜：物镜和集光透镜，分别用于照明和信 号采集。薄透镜的透过率函数和三维衍射性质是理解共焦扫描成像系统中三维成像 概念的基础，因此，利用薄透镜的傅里叶光学从单个薄透镜的成像过程开始分析单 模光纤共焦扫描显微成像系统的三维成像原理。 2 2 1 薄透镜的透过率 设薄透镜由曲率半径分别为r l 和一r 2 的两个球面组成，具有均匀的折射率n ， 中心厚度为d o ，透镜上任一点的厚度为万g ，y ) 前后光场分布分别为u k ，咒) 和 u ：g ：，y ：) ，对薄透镜来悦其厚度可忽略，即可认为工= x ：= x ，y = y ：= y “1 。如图 2 2 所示。 夕 u 瓦 0 2 j。 、 u l ( x 1 1 y 1 )切 r i u 2 ( x 2 ，y 2 ) 图22 薄透镜示意图 当束波长为 的光通过一个透镜时通过透镜的光场将受到两个方面的影响 和变化：即相位和振幅发生了变化。若将透镜的透过率函数表示为 t ( x ，y ) = p ( x ，y ) e x p - i f ：p ( x ，y ) 】 ( 2 1 ) 其中，j d ( x ，y ) 8 n o ( x y ) 分别对应于光场的振幅和相位的变化。对于一个成像系统光 波通常沿着傍轴方向传播，通过傍轴近似可得 砸瓴一半( 击一击) ( 2 2 ) 由透镜造成的相位延迟为 硕十学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 妒；等面。+ 等( 川) - 设透镜的光强透过率为尸( x ，j ，) ，有时也称其为瞳函数，则透镜后的光场为 u 2 ( x ，y ) = u i b ，y ) p b ，y ) e x p 卜j 妒g ，堋 ( 2 3 ) 将公式( 2 1 ) ( 2 3 ) 代入公式( 2 2 4 ) ，并令透镜的几何光学焦距为，即 一怯剖 恻= 瓷矧嘶唧( - r k n - 6 抽铲 其中：2 石a 为波数，若忽略式中相移常量因子e x p ( - 渤面。) 过率函数可以写为 矾川e x 掣 ( 2 4 ) ( 2 5 ) ( 2 6 ) 则最终薄透镜的透 ( 2 7 ) 当一个平面波通过一个正透镜时，波场汇聚于透镜后焦距处，实际上该点的 光场并不是一个理想点，而是由于受衍射效应影响而形成的有一个分柿。下面分析 薄透镜的衍射效应。 2 2 2 薄透镜的菲涅尔衍射 设衍射面q 点和观察面p 点的光场分别为u ( _ ，y ，) 和u ，( x 2 ，y ：) ，两平面之间的 距离是z ，p 和q 之间的距离是r ，如图2 3 所示。 o i0 2 图2 3 衍射面和观察面的坐标系 当观察面和衍射面之问的距离远大于观察点与光轴之f 刚的距离时，通过菲涅尔 近似，可得菲涅尔衍射公式 ( x ! ，y ：) = i e x p 儿( i k z ) 。 r 。u i ( 孙y ，) e x p 尝l x ：一z ) 2 + ( y ：一y 。) 2 】 出。咖，( 2 8 ) 将薄透镜看作个衍射屏，假定透镜被均匀平面波照明，则透镜前的光场为： ( t ，= u 。出( 2 7 ) 中的透镜透过率公式可知透镜后的光场为 堡堂垡堡兰 苎丝些堑塑堂些堡塑堂星塑堕堡墨堑塑塑鲞墨：堡塑兰墨竺兰坚至坐塾 嘛小叩) e x p 券( x 2 ) 1 2 9 ) 进而，可由相关公式导出焦面上和离焦条件下的各有关公式： ( 1 ) 焦面上的光场分布 由菲涅尔衍射公式( 2 8 ) 可以得出焦平面z = f 上的衍射分布为 嘶川= 可i u 6e x “矿蛔 可i k ( 、x 2 。2 ) j p ( ) e x p i f ( x , x + y + y ) l d x d y ( 2 m ) 对于球对称的透镜，其瞳函数仅与半径坐标相关，即：p ( x ，y ) = j p ( r ) ，其中 r ：( x ：+ y ：) 只。若p ( r ) 是一个半径为口的均匀圆孔函数，则透镜的瞳函数可以写成 州= ：i 巍情况 泣 根据汉克尔变换的定义，忽略常量u o ，并利用径向光学坐标 v 一等 眩 可将式( 2 1 0 ) 化简为 叫小枞如咖x 一篆 掣 眨 上式中n = 告为菲涅尔数。 ， 在考虑对透镜的孔径进行归一化后 模的平方： m m ，2 掣 2 最终焦平面上的强度分布是( 2 1 3 ) 式的 ( 2 1 4 ) 浚强度分布称为爱罪斑，计算表明大约8 0 的入射光能量都集中在中间的亮圆 斑中【”1 。这表示由于衍射作用，一束平行光通过薄透镜后在透镜后焦面卜并不能成 像为一个理想点，而是个强度分布如( 2 1 4 ) 式表示的一个衍射圆。 ( 2 ) 离焦面上的光场分布： 倘若观察面不在焦面上，而是在一个离焦的位置。假定离焦距离为a z 此时观 察面到透镜的距离为z = 厂+ 出，代入( 2 8 ) 式并进行汉克尔变换，得到： 吲小_ i e x p ( r - i k f ) e x p 卜警1 r 州 。 ( 2 1 5 ) 肾i k r2 。( 7 1 一扎( 等) z 胛办 砸+ 学何论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理披术研究 户e ，：，：p c ，e x p l i i k ：r 。( 7 1 一) c ：，s ， 则从( 2 1 5 ) 式可知u ，( ) 是离焦瞳函数的二维傅立叶变换。对于半径为n 的 圆形透镜引入径向光学坐标v 和轴向光学坐标“： ，：h “、。车f 要k 。_ 2 ：r t 亏t t j 3 删。d ( 2 1 7 )忙 2 了1 7 严2 百 m d 幢j 7 “= 等a2 b 一爿“等& 笋 c ：- s ， 对于一个均匀的圆形透镜将( 2 1 7 ) 和( 2 1 8 ) 代入( 2 1 5 ) 式，则可得u 3 作为 离焦量的函数： 嘶小z 删唧( 嘣) e x 。卜t 蔫, , t xv 州钭( v p 砌7 犯1 9 式中p = 么是对透镜的孔径归一化后的半径坐标。j ：式给出了焦平面附近的三维衍 射场分析j 0 当“= 0 时，观察面就在焦平面上，此时的光强分布为 m ) = 眦，删) j 2 = 汩) 2 f 掣 。 2 0 ) 该式与( 2 1 4 ) 是相同的。 当v = 0 时沿轴向的强度分布为 m h u 3 ( v = o , u ) 卜【学 z ， 上式表示平行光束通过簿透镜后在不同离焦距离处沿光轴上的强度分响i 。 2 2 3 薄透镜的相干成像 在一个薄的振幅透过率为o ( x ，y 1 ) 物体之后d ，距离处放簧一个薄透镜，并在透 镜之后d ：距离处进行观察。物平面和像平面分别称为物而和像商，如图2 4 所示。 硕士学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 图2 4 正透镜成像坐标图 设透镜的瞳函数为p ( x ：，y ：) 。用均匀平面波照明 由菲涅尔衍射公式( 2 8 f 幽) e x p 隹b ： 引入透镜的横向放大率m ，并定义 m = d i d 2 则式f 2 2 4 ) 又町变换写成 丝! 鲨e ! 望l ! ! ! 丝 五! d ? j d g ? ) 。、p j 姿g z + z 物体，则在物体之后的波场分 ) 可得透镜前表面的场分= 1 为 一x 。) 2 + 。：一y 。) 2 n 出咖 e x p l 兰d , x ：( x 。+ 尬，) + y ：( “+ 眇，小出咖出：咖： ( 2 2 5 ) ( 2 2 6 ) ，： 柳 兰| 蛐 西 r = i _ q 剖牺 蝴冲训 面 棚 呶哟势拍舱栏一。 们 执 陆豺 取斗 攀 锄 一厂 比沩栏也 蔗弘暴耕 业m釜吐刊 菲g ，刮1瓣岫叫 ，1 4 h 以 k l矾 兰射 ，刊0 1 1 默 ，珂门川 k 一： 些m o r11t 杈 广 硕十学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传塑1 i 竺堡垫查型塑 上式即为薄透镜成像条件下像面上的场分布，进而需分析不同成像物体条件f 的成 像情况。 ( 1 ) 单个物点的成像 为求出u ，( x ，y ，) ，首先要分别对。z 和y 2 积分，进而定义h ( x ，y ) 为 0 ，y ) = 尸e ! ，y ，) e x 9 l i 兰d , & 、x + y ，v 1 1 出z 咖z ( 2 - 2 7 ) 它是瞳函数p ( x ：，y ：) 的傅旱叶变换，描述的是光场的复振幅，由于相当于单个物点 成的像，故将其称为二维振幅点扩散函数或二维点扩散函数，也可称为光学系统的 脉冲响应。对于一个好的成像系统，h ( x ，j ，) 接近于一个点脉冲函数，在零点以外下 降得很快。由此，式( 2 2 6 ) 可以写成 嘶扔) = 塑拶唧 - 等g ，2 1 1 叫。， f 。x y ) g 。+ m x 。+ m y ，k 。咖。 上式表示像场是物的透过率函数和成像透镜的二维振幅点扩散函数的卷积。在一定 的条件下，当成像透镜足够大时，可以认为二维振幅点扩散函数为 “t y ) = j ( x ) j ( y ) ，此日寸，像场可表示为 啉刈= 塑等笋趔 e x p | r 等h 订x 1 + m ) 卜鹄) 此式和几何光学的结论相同：透镜所成的像是在像平面上放大的物场的倒置。 ( 2 ) 薄物体的成像 当成像不满足像面上的成像条件时，即去2 击+ 击一手。，设离焦量为 上：土+ 上一土( 2 3 0 ) d ( 1d ld 2 ， 1 d 。是三维空间不变量，可以用于描述有限厚度物体的三维成像。将式( 2 2 7 ) 写 为 一b ，y ) = f p ( * ! ，y ，) e x 李( 专一：i + 去 。：2 + y ：2 ) 。 。：，。， e x p l _ i kn , 2 x 十j ，2j ，) l 出2 咖2 相应地，根抛图2 4 中的坐标，则称 0 ，y ) 为离焦的点扩散函数，又称为3 - - d 振幅点扩散函数，h j 于描述单物点或有限原物体成像的3 一d 特性( x ，y 离焦量) 。将d o 硕十学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 和d 2 定义为 函= d l o - 2 i( 2 3 2 ) 【d 2 = d 2 0 十z 3 其中，z 和毛分别是物面和像面离焦量，而d 。、d 。满足成像条件，即满足 l 吐。+ 1 d ：。= l f ，且z 相对于d 1 0 、z ，相对于d ：o 都是微小量，则可认为以下关系 成立： 。 fl d zl d 。( 1 + z d 。) 1 1 d ：。1 a ：。( 1 一= ，a ：。) 相应地，有 ( 2 3 3 ) 吉+ 击一专3 嘉o 卅z ，) 泣，。， 其中，m = d m a ：。将( 2 3 4 ) 式代入( 2 _ 3 1 ) 式t 并将式中的线性相位因子中的d i 近似 代换为吐。t 可得 ， 一 州) - 腓幽) e x 帕舭埘2 船帆2 ) 眩。， e x p 要0 2 x + y 2 y ) 出：砒 将式( 2 3 5 ) 代入式( 2 ，2 8 ) q b ，可得薄物体的成像公式 呱幽) = 塑磷创e x p 一筹o ，2 氓2 i l + m ) j 肼崩。) e x 牲n 耽如2 刊卜，s ) e x p 薏m t + 慨( y + 酬卜蛐z 咖： 上式给出了一个在物场z 处的薄的物平面，在像毛处可成的像。 ( 3 ) 有限厚度物体的成像 如果物体是一个有限厚度的物体，则每一个物场的垂直横截面都在像场的z ，像 面处造成个像，而在毛处的总像场是以上各个横截面所成的像的叠加。在波恩一 缴近似的情况f ，瞢加原理成立。这时，一个有限厚度的物体成的像，即1 个三维 物体成的像，是( 2 3 6 ) 式在z ，轴上的积分。；i x ( 2 3 5 ) 式并将像场u ，写为z ，的函数， 颂十学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 吣一小唧m 峨0 ) e x p 卜甏b ，2 2 1 1 圳j 。( m y t , z i ) e x p 陆0 ，一z ，) 】 g + 坛，y + m y ，z ，一m2 2 3 皿砂d z t ( 2 3 7 ) 其中 如炉，= 旦d l2 a 2 胍幽b 帕舟咄2 ) 亿。、 唧 等k 州：y ) 蚴： h ( x ，y ，z 1 称为三维振幅点扩散函数，其物理意义是对单个物点所形成的像场分布。 如果将o ( x ，y ，：) = e x p ( i k z ) 称为有效物函数，则像场是有效物函数与h ( x ，y ，z ) 的卷 积。因此，成像过程是一个横向放大率为i m ，纵向放大率为一1 m2 的三维不变过 2 3 共焦扫描显微镜的成像原理 其焦显微镜中的一个重要组成部分就是放在探测器及光源前的小孔。为了达到 先全兆焦的成像方，小孔的尺j j 是越小越好。当小孔是一个点的理想情况下，共 焦鼎微镜( 样诮为非荧光物质) 的成像过程是完全相干的，其探测到的强度可以写 成光场振幅的叠加。此时系统表现出很好的光学层析性质使得它可以对具有定 厚度的样品进行三维成像【圳。明场显微术在实际应用中有两种方式：反射共焦力式 和透射共焦方式。本论文的实验系统使用的是反射方式。 图2 5 是舆趔的反剁式共焦扫描显微镜的结构图，它盯一个点光源s 、两个透镜 ( 集光透镜只和物镜月) 、一个分光镜以及一个点探测器d 组成。其中f 用来在物 体l 形成个衍刳受限的照明，而只用来将物体反射回来的微弱光信号收集到点探 测器中。在实际的系统中，只和只是同一透镜，此时该透镜既作为照明用，又作 为采集信号用。为了分析简，尊，本节按照圈2 5 分析。 假设入剁光的波长为z 入射光场经物镜被聚集到三维物体 ：物体上被光斑 照明区域的信号则被集光透镜汇聚到一个点探测器上。如果将物体沿着轴向和横向 扫描，则可得到物体的三维像。 分别用o ，、y 和= = o ，l ，2 ) 表示光源、物面干像而的位胃坐标矢量：，物镜和 收集透镜的二二维振幅点扩散函数可由式( 2 3 8 ) 给出： r ， xy ，z ) = 旺p ，皓，7 ：) e x p l 孚皓+ ) l 删印0 = 1 , 2 ) ( 2 3 9 ) 。 l “q 硕十学位论文 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 图2 5 反射式共焦显微镜示意图 式中忽略了前面的相位因子。因为在连续光照明情况下，该相位因子并不影响探测 结果。其中可= 1 时表示物镜，q = 2 时表示收集透镜。d 。和d ：分别是物镜到光源和 到物平面的距离，也是收集透镜到物体和到探测器的距离，其距离满足高斯定理， 是物镜和集光透镜的焦距长。只( 掌，叩，z ) 表示物镜和收集透镜的瞳函数： _ 叱 ) = 嘶枷十万i k = 皓2 卅) l ( 2 4 0 ) 其中只( 掌，r ) 和只( 善，r t ) 分别是物镜和收集透镜的瞳函数。 若将点光源置于轴上，将位置矢量看作列矢量，则由( 2 3 7 ) 式可得物体上的照明 光场： 1 2 4 ，o ) e x p i k ( z 。- - z i m ，+ m 。互蛾 ( 2 4 1 ) 其中m ，表示物镜的放大因子，它是一个对角矩阵： o o 1 m f = j0m f 0 j( 2 4 2 ) l 0 0 一m l 叫 其中参数m = d d ：是物镜的放大率。设物体被扫描到位置( 石，y 。：。) ，反映物 函数的物体的振幅反射率为o ( r ) ，则照到物上的光场分布为 i d ( ) e x p k ( z 。一z 。m ，( ，0 + m ，) 砒l 。n 一 ) ( 2 4 3 ) 1 1 t ( 2 3 7 ) 式可得探测器空削的光场分布，它是物上的光场分布与透镜的三维点 振幅扩散函数的卷积： 颂一i 学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 【，( ，2 ，。) = l d “) e x p 酞( z 。一z - m t “一m - ，1 ) 氓j d 以r l ) f 2 4 4 1 e x p 陆( 一z 。一= 2 ) 】 2 “+ m 2 ，2 k 式中吖：是收集透镜的放大因子，它是一个对角矩阵： 耻胎鸩0 。01亿嘲 l 0 o 一吖：2 j 其中m ：= d l a ：是收集透镜的放大率。探测器空间的光场强度是u ( ，2 ，) 的模的平 方。如果点探测器放在( x ：。，y 。z 2 。) 处，则陔处的强度为 j ( ) = l u ( r 2 ，】d ( 一，2 。) 机 ( 2 4 6 ) ，仉) = 忆( ) o ，o ( r 】二 ( 2 4 7 ) 上式中o ，表示三维卷积。若用，和，2 分别表示位置矢量和7 则上式意味着该 共焦显微镜相当于一个振幅点扩散函数为下式的相干显微成像系统： 。r ) = e x p i k ( - z z ) l h l ( d 彳i ，归2 ( ，十 ，2 ，2 )( 2 4 8 ) 式( 2 4 8 ) 是对于光源在轴上但点探测器具有一定偏移的共焦明场显微镜的三维振幅 点扩散函数的一般形式。它适用于透射式和反射式共焦显微镜，同样也适用于具有 像差情况下的显微镜。 由( 2 4 6 ) 式可看到探测器上的振幅是物体上不同点贡献的振幅所叠加的。也就 是悦，只要是点探测器，1 i 管是否有偏移，即使系统有像差，仍然是相干的。这表 明使用了点光源和点探测器的共焦显微成像系统是一相干成像系统。 2 4 单模光纤共焦扫描显微镜的成像原理及分辨率 实际中，点光源和点探测器的实现，是靠在光源( 一般为激光器) 和探测器前 面放置一微米量级的针孔。而针孔并不能完全看成是一个理想的点，而是一个面积 相对比较小的面。所以这种情况下的激光共焦扫描显微成像系统的成像是部分相干 的。 在激光共焦扫描显微系统中，如果激光束的会聚点与针孔的剥准存在偏差将会 产生失真和像差，丽探测器前针孔的对准更为关键，亚微米的移动都将导致像斧及 分辨率的l i 降。见外，由丁其扫描结构与点源和点探测器等测量机构攮本上都是 体的，因而系统结构比较复杂、笨重。而且，激光器的振动也对系统的性能产生不 良影响；如果用光纤米代替针孔形成点光源和点探测器，将使得激光器会聚点与光 纤输入端对准略有偏差也不会对系统引入像差，因而系统安装调试过程中只需大致 硕十学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 对准即可。而且，出于光纤的灵活性，可使激光、信号探测部分实现分布式摆放， 而不用象传统激光共焦扫描显微镜那样必须安装在支撑架上一固定的位嚣，从而简 化了系统的结构，提高了抗干扰能力和可靠性【2 9 】。因此。考虑建立由光纤元件( 如 光纤、光纤耦合器等) 构成的共焦显微系统则是一个新颖而有意义的思路。这种设 计的优越性在于可以建立一个简单而小型的共焦显微系统，并且具有良好的经济效 益。 2 4 1单模光纤共焦扫描显微镜的成像原理 本论文的实验中采用的是反射式共焦扫描方式，所以这里仍只分析反射式明场 光纤共焦扫描成像的性质。如图2 6 所示，两根单模光纤f 和只分别用做照明源和 收集器。用只和只分别表示无像差的物镜和集光透镜。它们的三维振幅点扩散函数、 离焦瞳函数分别由( 2 3 9 ) 式币l j ( 2 4 0 ) 式给出。和图2 5 相比较，反射式光纤共焦扫描 是在反射式共焦扫描的装置中用单模光纤作为点光源，并在探测器前也加了一根单 模光纤，用来收集并传导从收集透镜出来的物体反射光，将其传输到探测器中。 探测器d 图26 反射式光纤共焦扫描显微系统的装置图 设一( x ，y ) 和 ( x ，少) 是光纤和e 的二二维扳幅模式包迹。甩图2 6 所示的坐标 系，根据( 2 3 7 ) 式物空间处的光场可表示为 蹦孙y 。p ( z 。) e x p 【北( z 。一z 。m 。( r o 十m ) 氐 ( 2 4 9 ) 其中d 函数意味着照明光纤的输出端置于z 。处。 哇j 骘论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 和2 3 节共焦扫描显微成像的处理方法相同，可以导出来自扫描点，。在探测空 间处的光场分布 u ( ，2 ，) = l ，虬p ( z 0 ) e x p k o 。一z t m r o + m ，1 ) d h ( 2 5 0 ) o 以一，1 ) e x p 以( z 。一z ：i l h ，“+ 如，2 地 式中o ( r ) 表示在反射式光纤共焦扫描显微系统中厚介质的三维振幅反射率，m 、 m ，和在2 3 节中的定义相同。 在光纤共焦扫描显微成像系统中，第二根光纤e 用于集光，并将光引入探测器 中。要得到探测器d 处的场振幅，须求出光场【，( ，2 ，_ ) 通过光纤e 的传输到输出端 的场振幅【26 1 。 根据a w s n y d e r 和j d l o v e 的光波导理论，一个任意的光场复振幅u ( x ，y z ) 可以在光纤中展开成一系列正交模的叠加即 u ( x ，y ，z ) = n ，g 小，j ，) e x p ( , ；e ，z )( 2 5 1 ) 上式中g ，( x ，y ) e x p ( i f l ，z ) 表示特定光纤中组完备的正交模( 是整数) ，它们是在一 定边界条件下的解，并且沿着z 方向传播没有损耗。“叫做模振幅，它由正交关系 来确定。函数q ，g ) 是垂直于z 轴的平面上光纤的模分布。如果光纤是单模光纤，即 j = 1 则光纤中只存在第一种模式，即基模口，x ) 。因此等式( 2 5 1 ) 变为 u ( x ，y ，z ) = a l q l ( x ，y ) e x p ( i f l l z )( 2 5 2 ) 其中 。：ii!q,*(x,y)u(x,y,z=o)dxdy f j q ( x ，y 1 2 a x a y ( 2 5 3 ) 考虑到光纤r 的输入端置于z 2 = 0 处，利用上两式就可推导出在第二根光纤f 2 的出射端而上点( x ，y ，) 的复振幅u ，x ，x ，z ，) 为 州k 小塑半揣岽竽s 。， 其中l 表示光纤n 的长度。假设大面积探测器d 具有对光强均匀的灵敏度，则此探 测器探测到的光强为 吨) = f p ( 一】2 d x ，a y ， 或 j ( ，、) = l j ：，( x ：，y ，) u ( x 2 , y 2o ，砂：l ( 2 5 5 ) 硕士学1 1 ：7 ：论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 上式中忽略了常数因子，j g ( 2 s 4 ) 式代x ( 2 5 5 ) 式。可以得到从扫描点，。来的可 探测的像强度 ，仉) = j ”e z ( y p ( z 。m + 0 ：，y 。弦( 乃) 啊( t o + 肘，1 ) d n 一 ) h ：“+ m ：，2 + g 。，y o 弦( z 。批g ：，2 p 0 2 如。r o + 肘l ，1 ) ( 2 5 6 ) o 以一r i ) h 2 + ( ，1 1 + m 2 r 2 ) e x p i k ( z o 一= 】一z 1 一z 2 ) 】 e x p - i k ( z o 2i z o z 2 ) j 哦d e o 奶d r l 砒d e 2 其中黑体字，表示位置矢量，+ 为共轭算符。 利用卷积的定义，( 2 5 6 ) 式可表示为三维卷积的形式： ，以) = 阮以) o ，o 纯】2 ( 2 5 7 ) 式中o ，表示三维卷积运算。等式( 2 5 7 ) 表示上面讨论的单模光纤激光共焦扫描显 微镜是一相干成像系统，它的有效点扩散函数为： 红，化) = e x p i k ( - z z ) 正 ( m x ，m y ) 圆：h l ，舭t m l ，) o ：万：( ，) j ( 2 5 8 ) 其中 ，为在横截面的二维卷积算符。 比较等式( 2 5 7 ) 和( 2 4 7 ) ，发现它们是等价的。由此可见。引入单模光纤， 并不改变激光共焦扫描显微镜独特的相干成像特性。因此，用单模光纤代替针孔来 实现激光共焦扫描成像是完全可行的。 根据已有的光纤理论可知，光纤本质上是相干探测器，所以在理论上就可以 用多模光纤代替单模光纤。可以把光纤中每一个模式想象成一个分立的相干探测 器，它的振幅探测灵敏度与相应的光纤模式成正比。例如，在采用双模光纤作为点 光源和点探测器的双模光纤激光共焦扫描显微系统中，通过探测最低阶模l p o l 就可 得到标准的共焦图像，探沏, t j - 阶模l p 。，可以得到差分图像。上面这种方法是分立探 测光纤模式的方法。也可以把两种不同光纤模式的图像信号同时投射到两个分立的 探测器上。当把两个分立的两个探测器所得的图像信号相加，可以得到真正的基焦 图像：当把分立的_ 两个探测器所得的图像信号相减，通过简单地改变光纤的长度， 就可获得振幅差分模式图像和相位差分模式图像。对比单模光纤激光共焦扫描显微 系统和双模光纤激光共焦扫描显微系统，后者具有更强大的功能，但它也需要更复 杂的探测和处理技术，如两个探测面要紧靠着，探测器的探测性能应该完全一致等。 随着模式的增多，相虚的探测手段和处理技术将会变得非常复杂。 2 4 2 单模光纤共焦扫描显微镜的轴向分辨率 单模光纤激光共焦扫描显微镜与普通显微镜相比，除了具有较高的平面分辨率 硕士学位论文单模光纤激光共焦扫描显微成像系统数据采集、传输与处理技术研究 外，更重要的是其显著的纵深( 轴向) 分辨能力。下面将通过分析单模光纤激光共 焦扫描显微镜与普通扫描显微镜在某一离焦平面上的光强分布来说明单模光纤激 光共焦扫描显微系统具有高的纵向分辨能力 2 6 1 。 ( 1 ) 普通扫描显微镜的分辨