（发酵工程专业论文）裂褶菌胞外多糖的研究.pdf

天津科技大学硬士学链论文 攮要 本文对裂裙菌施井多糖韵发酵条件，提取工艺及结构迸行了研究，确 定了裂褶蘩产糖静最佳培养蒸、涪养条件、提取工茳条件及多糖韵结构。 研究懿主要内容释结论据下： 1 。在裂褶甍藏崧多糖懿发簿研究中通过擎因子试验帮正交试验确定了裂 耱藏产糖静最优培养蒸配方为：葡萄糖4 5 9 l ，酵母膏3 9 l ，k f i ：p o 。 0 。5 9 l ，m g s o 。7 f i 。00 。5 9 l ；最遥发酵条传为：接释龄6 6 h ，接释量 1 0 ，壤葵瀑度2 7 ，装液量2 0 ，秘始p h 自然。褥到摇糕条件下菡体 最大 ! 譬搴2 0 。7 5 9 l ，腿终多糖最大褥率2 7 0 9 l 。经7 毛发释罐熬分批发 酵褥至b 蓝丝于羹产搴为8 。8 1 9 l ，腿终多糖产率必0 。8 4 9 l 。多糖与菌体 比为1 ：1 0 。枣 水壤驿发黪试验结果必薰丝于重褥率t 9 。9 8 9 l ，裂褶萤 胞夕 多糖褥率l 。8 9 9 l ，分别必分批发酵麴2 。2 7 馈秘2 2 5 倍，露多糖 萤体比朱变。 2 对裂褶菌胞外多糖的提取工艺进霉亍了初步磷究。确定了最佳的脱色方 法为活性碳吸附法，最适加量为0 5 。最佳脱蛋白方法为等电点法与 s e v a g 法2 次棚结合的方法。工艺路线为：发酵波一除去萤体一堰烛碳脱 色一浓缩一脱蛋白一乙醇沉淀一复溶一沉淀一纯裂褶菌胞外多糖 3 进行了裂褶菌胞外多糖的结构分析。由凝胶柱腰析，聚丙烯酰胺凝胶 电泳，高效液稠色谱分析可知裂褶菌胞外多糖为均一组分，分子量4 1 0 4 u 。通过完全水解，纸层析，气相色谱分析单糖组分，红外光谱，酶 解爱应，高磺酸氧化和圆体核磁共振分析结构，证明了裂褶菌胞矫多糖 是菇葡萄糖为攀一组分的t b 一( i 一3 ) 一d 葡聚糖，其中每三个葡萄糖分子上 涟青一个t 3 一( 卜6 ) 翡分支。 失键谒：裂摆蘩，裂褶藩黢终多糖，发酵，提取，结构鉴定 a b s _ h 澉t a b s t r a ct t h ef c r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，t h ee x t r a c t i o nm e t h o d sa n dt h e s t r u c t u r eo fs c h i z o p h y l l a nw e r es t u d i e di nt h i st h e s i s t h em a i nc o n t e n t s a n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： f e r m e n t a t i o n s c h i z o p h y l l a nb ys c h i z o p 砂l l u m c o m m u n ew a s o p t i m i z e d t h er e s u l t so fs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n ts h o w e d t h a tt h eo p t i m i z e dm e d i u mc o m p o s i t i o n c o n t a i n e d ：g l u c o s e4 5 9 l ，y e a s t e x t r a c t 3 9 l ，k h 2 p o ao 5 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 l t h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n sw e r ei n o c u l u m a g e6 6 h ，i n o c u l u m s i z e1o ，t e m p e r a t u r e2 7 v o l u m eo fm e d i u m2 0 a n dp h6 m a x i u my i e l do f s c h i z o p h y l l a na n d m y c e l i u m o ff l a s kw e r e 2 7 0 9 l a n d 2 0 7 5 9 lr e s p e c t i v e l y b u t t h e y i e l d s o f s c h i z o p h y l l a n a n d m y c e l i u m w e r e o 8 4 9 l a n d 8 8 1 9 l r e s p e c t i v e l yi nb a t c hc u l t u r e t h er e s u l to fw a t e r - f e de x p e r i m e n ts h o w e d t h a tt h ey i e l d so f m y c e l i u ma n ds c h i z o p h y l l a nw e r eg r e a t l yi m p r o v e da n d t h e mw e r e1 9 9 8 9 la n d1 8 9 9 lr e s p e c t i v e l y t h ee x t r a c t i o nm e t h o do fe x o p o l y s o c c h a r i d ef r o m s c h i z o p h y l l u m c o m m u n e b ys u b m e r g e d c u l t i v a t i o nw a ss t u d i e d t h ee x t r a c t i o n t e c h n o l o g yw a si m p r o v e da n dt h eb e s tm e t h o d so fr e m o v i n gc o l o ra n d p r o t e i n sw e r ea c h i e v e d t h es t r u c t u r eo fs c h i z o p h y l l a nf r o m s c h i z o p h y l l u m c o m m u n eb y s u b m e r g e dc u l t i v a t i o n w a sa l s or e s e a r c h e d ，t h ep u r i f i e d s c h i z o p h y l l a n w a s p r o v e d t ob e h o m o g e n e o u s w i t hm o l e c u l a r w e i g h t 4 10 4 u b y s e p h a d e xg - 2 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，p a g ea n dh p l c i t sm o n o m e r w a sd e t e r m i n e db yh y d r o l y s i s ，p c ，g ca n di t ss t r u c t u r ew a sa n a l y z e db y i r ，e n z y m o l y s i s ，p e r i o d a t e o x i d a t i o n ，c p m a s ”cn m r ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a ts c h i z o p h y l l a nw a so n l yc o m p o s e do f g l u c o s ea n d i tc o n s i s t e d o fab a c k b o n ec h a i no f1 ，3 1 3 - d - g l u c o p y f a n o s eu n i t sl i n k e dw i t hs i n g l e 1 ，6 一b d - g l u c o p y r a n o s e s a ta b o u te v e r yt h i r d g l u c o s em o l e c u l e i nt h e b a s i cc h a i n k e y w o r d s ：s c h i z o p h y l l u mc o m m u n es c h i z o p h y l l a n f e r m e n t a t i o n e x t r a c t i o ns t r u c t u r e i l 天津科技大学硕士学位论文 第一章前言 本论文旨在对裂褶菌进行深层培养，提高胞外多糖产量，同时优化裂 褶菌胞外多糖的提取工艺，并对其结构进行鉴定。 1 1 概述 1 1 1 裂褶菌 本课题研究的裂褶菌( s c h i z o p 砂l l u mc o m m u n e ) ，属担子菌纲伞菌 目裂褶菌科裂褶菌属。其担子果初为杯状后成盘状，由一狭窄基部与基 物相连，子实体层体假菌褶，自基部辐射而生，有裂褶，单系菌丝，罕二 系，孢予光滑，无色非淀粉质，是很常见的普通裂褶菌，也称白生，嫩时 可食”3 。其子实体可供药用，在云南的民间常用裂褶菌子实体与鸡蛋炖 服，治疗妇女白带，效果非常显著b 1 。裂褶菌生长环境主要为阔叶和针叶 树的枯枝、倒木、腐木和枕木上。在我国2 0 多个省市均有分布，资源非 常丰富“1 。其子实体形态见图卜1 。 图卜1裂褶菌子实体照片 1 1 2 裂褶菌胞外多糖 裂褶菌胞外多糖( s e h i z o p h y l l a n ，简称s p g ) ，又称裂褶菌素，是一 种水溶性的b 一9 - 葡聚糖。它有一条( 卜3 ) 一连接的1 3 一d - 吡喃型葡萄糖残 基所构成的主链，在主链上每三个糖残基处，有一个( 卜6 ) 一连接的b o - - 吡喃型葡萄糖侧链，其结构见图卜2 拍1 。 第一章前富 厂f “。c 1 车；- “、门 “、。l 乳糖 麦芽糖 果糖 山梨 醇，菌丝生长效果则为：葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖 果糖 山梨醇。葡萄 糖作为碳源时多糖及菌丝产量均为最高，蔗糖次之，其它几种碳源多糖及 菌丝产量均较低。故选择葡萄糖作为碳源。 3 i 1 2 不同浓度的葡萄糖对菌丝生长和胞外多糖形成的影响 在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，分别加入1 5 ( w v ) 5 种不 同浓度的葡萄糖，接种后，在2 7 ，1 6 0 r m i n 下振荡培养5 d ，测定菌 丝和多糖产量。结果如图3 2 所示。 从图中可以看出，3 和4 ( w v ) 葡萄糖浓度的试验组多糖和菌丝产 量均高，其中4 葡萄糖浓度的多糖和菌丝产量最高。而1 、2 葡萄糖浓 度的产量较低，原因是由于碳源不足，菌体生长不好而使多糖分泌较少。 第三章结果与讨论 5 葡萄糖浓度的试验组菌体产量较高而多糖产量较低，原因为过多的、 剩弱不宠戆蘩莓糖夜培莠鏊中搀铡了多糖浆分泌。 馥3 - 2 不鬻麓蔫耱滚凄对多糖释蕴丝产茧影璃 3 。l 。1 。3 苓阏氦源慰蔻丝生长摹| 熬耱多糖形成戆影魂 按2 1 2 3 的方法，改变发酵培养基中的氮源，分别加入0 3 ( w v ) 的辩母浸囊粉( 避日) 、酵母鹰( 国产) 、蛋白胨、尿素、 ( n h 。) 。s o 。、n 吼n o 。6 种氮源，接种后，农2 7 ，1 6 0 r m i n 下振荡培养 5 d ，测定菌熊和多糖产量。结果如图3 3 所示。 圈3 - 3 不同氮深对多糖和蔼丝产萋酶影响 不褥氮深试验缀多糖产整为：辩霉浸膏耪( 遴麓) 酪母膏( 国产) 蛋白胨 尿素 硝酸铵 硫酸铵，菌丝产量为酵母没膏粉( 进口) 酵母鬻 天津科技大学礤士学位论文 ( 国产) 蛋白胨 尿素 硫酸铵 硝酸铵。觚鬻3 - 3 鞠鑫着密袁穰l 氮深 的多糖及菌体产量明显优于无机氮源，其中进口酵母浸膏粉多糖及菌丝产 麓最每，国产酵母膏鹣多糖及蔼丝产豢与进瓣簿母浚 骜粉接避。考臻弱竭 产酵母鬻的成本大大低于进口酵母浸街粉，敞选择国产酵母膏替代进口酵 母浸毒粉，露瓣最挠氮滚。 3 1 1 4 不同酵母膏浓度对菌丝生长和胞外多糖形成的影响 在以簿母篱为氮源熬发酵墙葬基中，分别趣丸0 1 o ，5 ( w v ) 5 种不同浓度的国产酵母膏，接种后，在2 7 ，1 6 0 r m i n 下振荡培养 5 d ，测定萤丝翻多糖产量。结果如图3 4 所示。 图3 - 4 不同酵母膏浓度对多糖和菌熟产量影响 跌醋中可隧着出，0 3 、0 4 和0 5 ( w v ) 簿母膏浓度静多糖和 稿丝产量均高于其它浓度，其中浓魔为0 3 的试验组多糖产量最高， 0 镐浓度静蘸丝产量最高。0 1 骺、0 2 蔼浓痰豹试验缀在发簿结素辩发酵 液颜色为白色，说明氮源不足，故多糖及菌丝产量较低。由此说明0 3 鹣酵母鬻浓度醚完全瀵是蘩髂囊长嚣产穆形袋。 3 1 1 5 发酵熔养基的筛选 攘撰鞋上试验结祭，遥耀麓楚耱、葵母舞、k 磁p 0 ；、m g s o ；7 h 。o4 个因子，进行l 。( 45 ) “7 1 正交试验，葡萄糖和酵母膏浓魔在其已选出的 最佳浓发范围选择。试验续累觅表3 一l 霸表3 2 。 通过正交试验及其方差分析可知，葡萄糖为主翳因素，其具有箍著性 影响。k 氇p o t 次之，m g s o 。再次之、黪母膏最次。比较4 个围素不周水平 下各自的均值，得出最佳发酵培养基配方为恕b 。c 。o 。，即葡萄糖为4 5 、 酵母膏为0 3 、k h ：p 0 。为0 0 5 、m g s o 。7 h 。0 为0 0 5 。 第三章结果与讨论 表3 - 1裂褶菌发酵培养基优化l 。( 4 5 ) 正交试验结果 试 因素及水平 验 abcdey 葡萄糖酵母膏k h 2 p o 。 m g s 0 4 误差列裂褶菌多糖干 号 ( )( )( )( )重( g l o o m l ) 13o 2 50o10 1 1 4 6 23 0 3 0 0 5 o 2 52o 13 6 3 33o 3 50 1o 0 53o 1 2 5 8 4 30 4o 1 50 0 7 54o 1 3 3 4 53 5o 2 50 0 5o 0 5 4 0 1 4 8 7 63 50 3o0 0 7 530 1 3 5 4 73 5o 3 50 15o 2 o 1 3 6 6 83 50 4 0 1 0 0 2 5 lo 1 2 2 7 9 4o 2 5o 1o 0 7 52o 1 3 9 2 1 040 3o 1 50 0 5 10 1 6 7 l l 4 o 3 5 0 0 0 2 5 40 1 1 6 6 1 240 4o 0 5o 3 0 1 6 1 3 4 5 o 2 5o 1 5 0 0 2 5 3 o 1 7 3 4 1 44 50 30 1o 4 o 1 6 7 6 1 5 4 6o 3 5o 0 50 0 7 51o 1 9 0 8 1 64 5 o 4 oo 0 5 2 o 1 7 9 5 m 10 5 1 0 1o 5 7 5 90 5 4 6 1o 5 7 8 8o 5 9 5 1 m 2 0 5 4 3 40 6 0 6 3 0 6 3 5 80 5 4 9o 5 9 1 6 m 3o 5 8 2 80 5 6 9 80 5 5 5 3 0 6 2 l0 5 9 4 6 m 40 7 1 1 30 1 4 40 6 1 0 40 5 9 8 80 5 6 6 3 t = 2 3 5 7 6 m lo 1 2 7 5 o 1 4 4 0 1 3 6 50 1 4 4 70 1 4 8 8平均值 m 2o 1 3 5 90 1 5 1 60 1 5 90 1 3 7 3o 1 4 7 9= o 1 4 6 7 m 3o 1 4 5 7o 1 4 2 5o 1 3 8 8 o 1 5 5 3 0 1 4 8 7 m 40 1 7 7 80 1 4 8 9 o 1 5 2 6o 1 4 9 70 1 4 1 6 r 0 0 5 0 30 0 0 9 10 0 2 2 5o 0 1 80 0 0 7 2 表3 - 2裂褶菌发酵培养基优化正交试验方差分析表 对最佳发酵培养基作验证试验，接种后，2 7 ，1 6 0 r m i n 下振荡培 养5 d ，测定菌丝和多糖产量。得到最佳培养基配方的菌体干重值为 1 9 2 3 9 l ，胞外粗多糖得率为2 2 6 9 l 。 天津科技大学硕士学位论文 3 1 2 摇瓶培养工艺条件的优化试验 3 1 2 1 不同种龄对菌丝生长和胞外多糖形成的影响 接种龄的控制是发酵能否正常进行的关键因素之一。髓着种子培养时 间的延长，菌丝量逐渐增加，当菌丝繁殖到一定程度之后，由于养分耗竭 以及代谢产物的积累，菌体量就不再继续增加，而是趋于老化。通常，接 种龄以菌体处于分裂旺盛的对数生长中期为宜，此时的种子分裂旺盛、质 量高，接入发酵培养基后能很快进入对数生长，有利于缩短发酵周期和提 高产量。 将覆有菌丝的斜面培养基接入种子培养基中，2 7 ，1 6 0 r m i f i ，振 荡培养7 d ，以菌丝干重为测定指标，作种子生长曲线如图3 5 。 宴 呈 3 1 | 吲| h _ 埘l 橱 02 44 87 29 61 2 01 4 41 6 8 时间( h ) 图3 5 种子生长曲线 图3 6 种龄对多糖和菌丝产量影晌 第三章结果与讨论 种子生长曲线大致分为四个阶段：l 、调整期：0 2 4 h ，菌体生长缓 慢，发酵液澄清。2 、增殖期：2 4 1 2 0 h ，菌体生长旺盛，菌丝迅速分散 为大量的萌发点。但由于多糖分泌与菌体生长相偶连，7 2 h 之后，多糖及 其它代谢产物增多，发酵液浑浊粘稠，因此种子以7 2 h 之前的为佳。3 、 稳定期：1 2 0 1 4 4 h ，多糖大量产生，菌球密集，发酵液粘稠。4 、衰老 期：1 4 4 h 之后，菌丝团松散，有自溶现象。 为确定最佳接种龄，选择菌丝生长旺盛的4 8 h 、5 4 h 、6 0 h 、6 6 h 、 7 2 h 不同培养时间的种子进行摇瓶发酵。接种后，在2 7 ，1 6 0 r m i n 下 振荡培养5 d ，测定菌丝和多糖产量。结果如图3 6 所示。 由图3 6 可知，接入6 6 h 的种予，多糖得率最高，而7 2 h 的种子菌 丝产量最高。小于6 6 h 的试验组多糖得率明显减少，这是由于在菌体生 长初期菌丝适应能力差，种子浓度低，菌种不够粗壮，从而导致得率降 低。种龄在7 2 h 的试验组由于此时发酵液中多糖及一些代谢产物分泌较 多，这些物质在接入新鲜培养基后对多糖的产生已有一定抑制作用，所以 引起了多糖产率的降低。而6 6 h 的种子正处增殖期，菌丝细小，生命力 旺盛，菌体浓度高，因此选择6 6 h 的种龄为最佳。 3 1 2 2 不同接种量对菌丝生长和胞外多糖形成的影响 在优化过的发酵培养基中，选择6 6 h 菌龄的种子，对4 、6 、8 、 1 0 、1 2 、1 4 6 个不同的接种量进行试验。在2 7 ，1 6 0 r m i n 下振荡 培养5 d ，测定菌丝和多糖产量。结果如图3 7 所示。 图3 - 7 接种量对多糖和菌丝产量影响 从图中可看出，多糖和菌丝产量随接种量的变化呈正态变化，当接种 量小于1 0 时，随着接种量的增加，多糖及菌丝得率明显增加，当接种量 大于1 0 时发生下降。这是因为接种量少，菌体密度小，多糖和菌体得率 天津科技大学硕士学位论文 自然也就少。接种量过大，单位体积内的养料和溶氧供应不足，菌丝得不 到充分生长，干扰代谢，从而导致了产量降低。接种量在1 0 时多糖及菌 丝产量达到最大，故选择接种量1 0 为最佳接种量。 3 1 2 3 溶氧量对菌丝生长和胞外多糖形成的影响 在一定转速下，摇瓶装液量不同，其溶氧水平不同。本试验在5 0 0 m l 摇瓶中，分别装入7 5 m l 、l o o m l 、1 2 5 m l 、l5 0 m l 发酵培养基，在2 7 、 1 6 0 r m i n 转速进行试验。结果如图3 - 8 所示。 图3 1 8 装液量对多糖和菌丝产量影响 图3 9 温度对多糖和菌丝产量影响 由图3 - 8 可知，5 0 0 m l 摇瓶中装液量为l o o m l 时裂褶菌多糖及菌丝 产率最高。过大、过小的装液量均对菌丝生长和多糖分泌不利。装液量过 小，溶氧太多，菌丝生长快，使基质过多的用于菌丝生长，导致菌体量大 但多糖合成少。装液量过大，溶氧较少，造成菌体供氧不足，形成菌球 第三章结果与讨论 大，菌体数量少，不利于多糖的产生。所以选择1 0 0 m l 为5 0 0 m l 摇瓶发 酵最佳装液量。 3 1 2 4 温度对菌丝生长和胞外多糖形成的影响 在发酵培养基中，接入种子，分别在2 4 、2 7 、3 0 、3 3 、3 6 5 种不同的温度下，1 6 0 r m i n ，振荡培养5 d 。测定菌丝和多糖产量。 结果如图3 - 9 所示。 从图3 9 可看出，多糖产率呈正态分布，2 7 时多糖产量最大。2 4 时，由于温度低，菌体生长缓慢，菌球较大，多糖分泌也较慢。培养 5 d ，并末发育完全，故菌体及多糖产率低。3 0 、3 3 随着温度的增 高，菌体迅速生长，菌丝细而密，因此菌体产量极高。然而，适合的生长 条件，使基质均用于菌体繁殖，单位体积内的养料和溶氧供应不足，菌丝 得不到充分发育，干扰了正常代谢，从而导致了多糖产量的下降。3 6 时，温度过高，抑制了菌体生长和多糖形成，故产率也很低。所以确定 2 7 为裂褶菌的最佳培养温度。 3 1 2 5 初始d h 对菌丝生长和胞外多糖形成的影响 将发酵培养基p h 分别调为5 、6 、7 、8 ，其中发酵培养基自然p h 为 6 。接种后，在2 7 下，1 6 0 r m i n ，振荡培养5 d 。测定菌丝和多糖产 量。结果如图3 - 1 0 所示。 图3 一l op h 值对多糖和菌丝产量影响 从图3 - 1 0 可知，p h 值在5 、6 、7 时菌丝产量基本相同，而p h 为 6 0 ，即自然时多糖产率最大，说明p h 自然有利于多糖的形成。p h 为8 时，p h 过高，菌体在其中生长较差，故多糖及菌丝产量均有所下降。因 此选择6 0 为最佳初始p h 。 天津科技大学顽学位论文 3 1 3 裂褶菌摇瓶发酵过程中菌体生长和多糖的形成 对所优亿的培养基和发酵工麓条件进行验证并观察裂褶菌在摇瓶发酵 中的菌体生长和多糖形成情况。5 0 0 m l 摇瓶中，装入l o o m l 发酵培养 基，蓊始p i 自然，接入6 6 h 的种子，在2 7 ，1 6 0 r m i n 条彳牛下，振荡培 养1 6 8 h 。结果翔鹜3 一l l 掰示。 杂 搿 撩 徽 2 5 2 0 出 幅毫 1 0 型 载 5 掘 0 o2 44 87 29 61 2 01 4 4 1 6 8 时问( h ) _ 残糖菌鳇干重p ho 雾糖千重 图3 11 裂撰菌涤屡培养健谢蝗线 3 2 5 2 毫 侣坦 ，絮 8 5 0 由豳3 - 1l 可鳃，裂褶萤深熙培养的生长熬线大致分必蹬个玲段： l 、调整期：0 1 6 h ，菌体生长缓慢，处于代谢调整期。2 、增皴期； 1 6 1 2 0 h ，菌体生长遮度大大增加，菌体于重与时间近似呈正比例关 系。3 、高峰期：1 2 0 1 5 2 h ，生物量达到最大慎，单位时间内菌体于匿 变化不大，其中1 5 2 h 时菌体于重最大为2 0 7 5 9 l 。4 、衰老期；1 5 2 h 之 后，随着时间的增加，菌丝体开始自溶，菌丝干重逐渐减少，呈下降趋 势。 耱井多糖在2 4 h ，部菌谇增殖期初期开始分泌。2 4 1 6 0 h 多糖分泌 迅速增擒，1 6 0 h 辩达到最大值2 7 0 9 l ，多糖分泌与菡体生长蘩本一 致。多糖后期略骞下海憝势胃熊楚由予蓄体自溶，菜些酶解多糖静酶释放 刭鼹终，傻多糖降然爨致。 由予莹体快速熬生长期产物形成，蹶糖在翦、孛期迅逮鼓攀翔。在 1 6 0 h ，即胞终多糖达到最大值时，还原糖降奎最低壤2 。5 9 l ，之爱还原 糖略有升高趋势，这是因为胞终多糖被降解成还驭糖的缘故。 p h 俊变化波动不大，总体为下降趋势。初始p h 值为6 0 ，发酵结束 时p h 值下降为5 0 。造成这种变化的原因是由于菌体进入增殖期时，向 辆秘；5；赫於馋5 o 第三章结果与讨论 胞外分泌代谢产物造成的。这与文献报道裂褶菌可产苹果酸等有机酸是一 致的。 菌体形态变化为：调整期菌体形态为星状，菌丝较长呈放射状，但分 支较少，生长不显著。发酵液澄清。增殖期菌丝迅速分散为大量的萌发 点，并由较小的星状开始生长，菌丝变得较为粗壮，分支增加，后期菌丝 体形成球状，表面有大量放射状突刺。此时，发酵液稠度逐渐增加。高峰 期菌丝球表面趋于光滑，菌球密集，发酵液粘稠，可形成拉丝。衰老期菌 丝球光滑，但菌丝团松散，有自溶现象。 通过以上分析可知：当还原糖降至0 2 5 ，p h 值降至5 0 以下，菌 丝球表面呈光滑，菌丝团松散，有自溶现象时，可终止发酵。初步得到菌 体干重最大值为2 0 7 5 9 l ，胞外粗多糖得率最大值为2 7 0 9 l 。 3 1 47 l 发酵罐分批发酵放大试验 采用优化的培养基进行裂褶菌深层培养的放大试验，结果如图3 一1 2 所示。在7 l 发酵罐中裂褶菌生长同样可分为四个时期，只是时间略有改 变：o 1 6 h 调整期。1 6 h 之后进入增殖期。4 8 6 4 h 为稳定期。6 4 h 之后 为衰亡期，在7 2 h 终止发酵。 1 0 饔 7 5 巽 栅。 蚩蔫5 姐 = 三 2 5 0 5 0 4 0 3 0 乏 2 0 姆 髅 1 0 0 o81 62 43 24 04 85 6 6 47 2 时间( h ) 残氮菌丝干重一p i 残糖 。多糖干重 图3 - 1 2 裂褶菌7 l 发酵罐发酵放大试验 从图中可知，胞外多糖在1 6 h 开始分泌，1 6 5 6 h 多糖分泌迅速增 加，在5 6 h 之后，多糖分泌速率减慢。还原糖在前、中期迅速被利用， 后期下降缓慢，7 2 h 时仍剩余6 0 ，氮源基本呈直线下降趋势，但在终止 发酵时也剩余5 7 。p h 值波动不大，在5 0 与6 o 之间变化。 经分批发酵得到菌丝干重产率为8 8 1 9 l ，胞外多糖产率为 0 8 4 9 l 。多糖菌体比为l ：1 0 。 。一j栅卜耱水 7 5 2 1 o o 0 0 天津科技大学磷士学位论文 经综合分柝，藏次分孰发辩袭褶蓠箍拜多糖产鬟较低，箕主要琢因是 出于发酵后期随着多糖的产生，发酵液变得游于粘稠，罐内氧传递差，导 数蔼髂撵蘩鑫辫，碳源稳氮源承能宠企被稳燃瓣缘赦，其审楚莓耱仅程弼 了4 0 ，氮源利用了4 3 。菌体生长的不完众就导致了产糖水平的下降。 羧藏这次分懿发酵生产裂摇蓥多糖存在以下几个闳题：( 1 ) 在麓捧生长 期搅拌转速和通气量较低，发酵液中的氧含量不足，菌体生长不完全。 ( 2 ) 产糖期，多数溶织氧劳凑均匀懿分散凌发酵液，露是在黏稠发酵波 中呈大气泡逸出，发酵罐内氧传递速率低，氧气不能满足荫体生长需要。 ( 3 ) 繁体的生长不完全，导数了碳氮源的利用不充分，从面使糖产量下 降。考虑至日氧传递速率童接影响菌体生长和产糖情况，故决定采用箭期调 节转速釉通气擞来提高溶氧，后期补加无菌蒸馏水降低培养接粘度促进菌 体氧吸收的稀释发酵方法来调节罐内裁传递速率，增麴裘磁萤对谈氮深懿 利用率，提高裂褶菌胞外多糖产量。 3 。l 。5 裘褥蓥季 采稀器发酵试验 补水稀释发酵菌体生长周期缩短为4 8 h 。其中0 1 2 h 为调整期，菌 体生长缓攫，溶氧交缀较蠢、。1 2 3 2 h 增夔期，蘩丝大量生长，发黪液溶 氧迅速下降。当溶氧在2 3 h 降至2 8 9 时，通过加大搅拌转速和通气量维 持溶氧簌3 0 - ；4 0 之闻。姥瓣由予转速较大，萤体星细小援状。3 2 h 进 入稳定期，裂褶菌胞外多糖大肇产生，粘稠的发酵液导致罐内氧传递能力 减弱，藏俸出现囊溶现象，溶氧开始上升。警溶氧超过4 0 时，向发酵罐 中补加茏茵蒸馏水，稀释发酵液将溶毓维持程4 0 左右，燕迟菌体震老速 度，促使其继绥生长。4 0 4 8 h 衰亡期，菌体呈细梭状充满整个发辩罐， 菌丝表面变的光滑，裔大量自溶现象，4 8 h 辩终止发酵。 2 5 2 0 拦 强毫 1 0 掣 袋l 5 耀 o 时间( h ) - 糇多禧筏蘸 罄丝予黧。p ho 残耱( g l ) 图3 - 1 3 裂褶蔺补水稀释发酵试验 一。毫船鼷 鲫 柏 ； 协 o 4 5 3 5 2 5 ，5 e 3 2 1 0 丑) 蜮擞，螂姆酶 第三章结果与讨论 从图3 - 1 3 可知，还原糖和氮源从增殖期望迅速下降趋势，发酵终止 时碳源被消耗掉7 0 ，氮源消耗掉9 0 ，氮源基本被耗尽。p i 慎波动不 大，同样也在5 0 与6 。0 之阅变亿，总体量下降趋势。 与分批发酵稻眈，补水稀释发酵试验通过调节转速、通气量掇高溶解 氧和 翱无菌蒸镩东控销了氧传递遴率的方法，饶住了罐肉发酵条件，键 进了萤体对碳氮深貔充分利用。井曼由予魏法发酵条彳争受加适宜，生长溺 期也隧之缩短。这对减少真菌染蓬几率极其有利。 李b 水耩释发酵试验萤丝予鬟褥攀1 9 9 8 9 l ，裂耀懿黢外多糖零辜 1 。8 9 9 l ，分别为分批发酵螅2 2 7 馈和2 。2 5 倍，藤多糖菌体比未变。 综上所述，采用前期调节转速和通气量提高溶氧，后期补加无菌蒸馏 水降低发酵液粘度增加菌体氧吸收率豹稀释发酵法，可有效的控制罐内氧 传递速率，一增加菌体对碳氮源的利用率，提高胞外多糖产鬣。此方法对发 酵法生产真菌多糖有麓广泛的意义。 3 2 裂褶茸施外多糖提取工艺的研究 本论文以真菌多糖传统的提取工艺：发簿液一离心去蓠体一真空薄膜 浓缩一无永乙醇沉淀- - 9 5 乙醇菠复洗涤一冷冻干燥一租多糖一复溶一离 心去豫不溶物- * s e v a g 法脱蛋南一透祈一无承乙醇沉淀一笺溶一沉淀一统 胞外多糖，对裂褶萤发酵液中臆磐多糖进行提取，发现传统工艺路线中存 在以下缺点： ( 1 ) 由予发酵液中黪母套含杏黄色素，浓壤羼蕨色变涤，导致新撮多羲蕨 色望黄色，降低了产品质量。 ( 2 ) 离心无法去除绷小菌丝，使其在后处理对与多糖一起沉淀，增加了多 糖中的杂质。多次乙醇沉淀，浪费溶剂。 ( 3 ) s e v a g 法脱蛋自，溶剂消耗量较大，操作繁琐。 改进的工艺路线主要对脱色和脱蛋白工艺进行了优化。现分剐讨论 如下一 3 2 1 脱色方法静优纯 由予裂褶菌腿外多糖发酵液串存在酵母鹰等含有较多色素的物质，在 乙簿浣淀时，隧着多糖浆精爨，惫素会夹杂在其孛，导致所提多糖颜毡发 黄，虽此韩色素势不易被除去，因此在沉淀多糖懿瘦先对发酵滚递簿脱 色，以提高多糖纯度。 本论文主要试验了三种戏色方法：活性碳吸附法，氧化脱色法，五酵 反复冲洗法。试验结果如表3 - 3 所示。 天津科技大学硕士学位论文 表3 - 3裂褶菌胞外多糖脱色方法的比较 根据上述试验结果，选择了活性碳吸附法和氧化脱色法进行了进一步 的比较。 活性碳吸附法：按方法2 4 ，2 1 将5 0 m l 发酵液稀释一倍后分别加入 0 2 5 、0 5 、0 7 5 、1 的活性碳，考察不同活性碳浓度的脱色效果。 试验结果见图3 1 4 。当活性碳用量为0 5 时白度为1 5 3 2 ，发酵液透明 无色，脱色效果最好。活性碳用量过大，发酵液呈灰色，有细微活性碳颗 粒剩余，不利于后提取。此法为物理方法，发酵液粘度不变。 赵 皿 毯 皿 oo 2 5o 5o 7 5 1 活性碳浓度( ) 口一白度+ 粘度 图3 1 4 不同活性碳浓度对脱色和 多糖粘度的影响 051 01 5 2 0 双氧水浓度( ) 一白度+ 粘度 图3 1 5 不同双氧水浓度对脱色和多 糖粘度的影响 侣侣拍侣惶 第三章结果与讨论 氧化脱色法：将发酵液稀释一倍后，按方法2 4 2 2 在发酵液中分 别加入5 、1 0 、1 5 、2 0 浓度的h 。0 。，观测不同浓度h 。0 。的脱色效果及 其对发酵液粘度的影响，试验结果见图3 一1 5 。由图可知，随着h 。0 。浓度 的增加，发酵液白度由最初的1 3 1 4 增加至1 5 4 1 ，脱色效果逐渐增 强，其中h 。0 。浓度为2 0 脱色效果最佳。但发酵液粘度也随之降低，这说 明h ：0 。对裂褶菌胞外多糖有降解作用。 由试验结果可知活性碳吸附法和氧化脱色法均能对裂褶菌胞外多糖溶 液起到很好的脱色效果，但考虑到氧化脱色法作用较为剧烈，可引起多糖 的降解，因此选择0 5 活性碳作为最佳脱色方法。 3 2 2 脱蛋白方法的优化 本文主要试验了三种脱蛋白的方法，即s e v a g 法、三氯醋酸法、等 电点法。 选择脱色后的发酵液，分别采用以上三种方法进行脱蛋白试验，之后 所得多糖用微量凯氏定氮法测定其蛋白含量，所得结果见表3 4 。 表3 - 4不同脱蛋白方法对裂褶菌粗多糖蛋白含量的影响 由表3 4 可知，采用三氯醋酸法脱蛋白后的裂褶菌胞外多糖的蛋白含 量与未去蛋白的粗多糖的蛋白含量相同，说明三氯醋酸法并不适合于裂褶 菌胞外多糖中杂蛋白的去除。而s e v a g 法重复5 次便可将粗多糖蛋白含量降 至0 2 5 ，虽然溶剂消耗量较大，操作繁琐，但去蛋白效果很好。使用等 电点法多糖中蛋白去除的不完全，但操作简单且一次可去掉4 0 左右的蛋 白。由以上试验结果，经综合考虑选择将等电点法与s e v a g 法结合，进行 脱蛋白试验，结果见表3 5 。 表3 5s e v a g 法去蛋白次数对裂褶菌粗多糖蛋白含量的影响 从表3 5 可看出，将等电点法与s e v a g 法结合后，先使用等电点法脱去 大部分蛋白，随后s e v a g 法只需重复2 次即可将蛋白含量降至0 6 9 9 6 ，去蛋 白效果极好，采用此种方法既简化了工艺又节约了溶剂，因此确定等电点 法+ s e v a g 法2 次为最佳脱蛋白工艺。 通常真菌多糖脱蛋白选用的是酶法和s e v a g 法，酶法去蛋白不完全， 将两者结合，蛋白酶的引入又增加了s e v a g 法的负担。而本文所提出的等 天津科技大学硕士学位论文 电点法与s e v a g 法相结合的新方法，还朱有文献报道。此方法简便裔效， 戈茭逶予蛋是含爨较低豹龚墓多糖。 3 3 3 最傣工艺路线的确定 据多次试验确定了裂摆莹艨乡 多羧提取靛最佳工芑路线必：发黪滚一 离心或布氏漏斗抽滤去菌体一缴酵液稀释1 倍一活性碳脱色一布氏漏斗抽 滤去活性碳一真空薄膜浓缩一镰电点+ s c r a g 法2 次脱矮自一9 5 乙酚沉淀 一复溶一沉淀一缝裂褶茵胞外多糖。 该工慧路线的优点为； ( i ) 增加满往碳脱色步骤，多糖聚自色掇高了产品质量。 ( 2 ) 确定等电点法+ s e v a g 法2 次的脱蛋白方法，简便肖效，节约溶剂。 ( 3 ) 壤麓獭滤步骤，去豫活性碳瓣薅龟去除了缀夸蔫丝。 ( 4 ) 省去提取粗多糖这步，缩减了提取步骤，节约了溶剂。 ( 5 ) 震9 5 乙醇我磐了无零乙醇，降毵了残本。 3 3 裂褶荫胞外多糖的结构分析 3 3 ，l 纯澄分板 s e p h a d e x g 一2 0 0 凝股柱层析结果如图3 - 1 6 所示为单一峰，聚丙烯酰 胺凝胶电泳为单一条带，疑效渡糨色谱结果如躅3 - 1 7 所示为擎一峰，说 明裂褶菌施外多糖为均组分。 05 01 0 0l 嚣o2 0 02 5 03 0 03 5 0 v 0 1 u m e ( m l ) 图3 1 8 裂褶黼胞外多糖s e p h a d e x g 一2 0 0 凝胶柱层析图谱 袭褶麓施井多糖紫舛扫摇结果如凿3 一1 8 所示，束发袋核酸吸收峰 ( 2 6 0 2 9 0 n m ) 及蛋白质吸收峰( 2 5 0 3 0 0 n m ) ，证明裂褶菌胞外多糖 溶渡孛无孩酸及鬣鑫。 心 撼 皓 o o & e 良 蓥w豢吖 第三章结果与讨论 - v l i 柏 1 4 拍 1 2 0 图3 1 7裂褶菌胞外多糖高效液相色谱图 mq咖嘶 图3 一1 8裂褶菌胞外多糖紫外图谱 3 3 2 分子量测定 经w a t e r s 2 4 4 型高效液相色谱测定，w a t e r s 4 1 0 视差检测器检测，裂 褶菌胞外多糖出峰时间与分子量为4 1 0 4 u 的标准蓝色葡聚糖一致，故确 定裂褶菌胞外多糖分子量为4 1 04 u 。 3 3 3 单糖组分分析 纸层析结果为裂褶菌胞外多糖水解液为单一斑点，其r f 值与葡萄糖 一致，证明裂褶菌胞外多糖是由葡萄糖组成的。 天津科技大学硬士学位谂文 标准单糖与裂褶菌胞外多糖单糖组分的气相色谱如图3 1 9 、3 2 0 所 示。圈3 一1 9 有5 个峰，分羽为木糖、内标物、曾露糖、葡萄糖、半乳 糖。萁中葡萄糖的绝对傈滔辩问为1 9 4 8 2 ，相对僚留时间为1 0 8 4 。而 图3 一1 9 鸯2 个蜂，其一为海椽峰，勇为裂褶瞽胞矫多糖韵擎糖缎分 峰。单糖缓分峰熬缝对僳鍪露阕为1 9 3 8 2 ，相辩保留瓣溺蔻1 0 6 9 ，与 标准单糖图谱中黪蘩鹫糖一致，故霹涯踺裂授萤难辨多糖是彦单一缀分蓠 莓糖赝浆合露成的。 胬3 - 1 9标准举糖气穗色谱静溯定 圈3 - 2 0袭褶菌胞外多糖单糖缀分气相色谱的澜寇 3 ，3 4 毁静毙漤分析 红辩光谱魏国3 - 2 1 所示，显示裂褶藤熬外多糖在3 2 0 0 3 6 0 0 c m 。翡 宽蜂是0 一 镩缭摄动。2 8 0 0 3 0 0 0 c m 。1 的峰为糖类e 一 ll 枣镶振动，在这 个聪域的吸收蜷是糖类驰特薤吸收烽。1 2 0 0 1 4 0 0 c m 。1 蛇不太尖的吸收峰 是c - 1 1 的变角振动。i 0 0 0 1 2 0 0 c m “的比较大的吸收峰是出两釉c - o 伸 缩振动所引起的。8 8 8 8 7 c m 。1 处的吸收峰为毗喃糠b 型c h 的变角振动的 4 l 第三鞋螭果与讨论 特征吸收峰，呋喃糖是不会有这种吸收峰的，故可知糖苷键为b 型，糖环 形态为吼喃糖环。 3 3 5 酶解反应 经筵棒法灞定，淀粉酶 n 一淀粉酶和糖化型淀耪酶) 酶解产物中未 检瓣毒还漂糖，诞弼畿藉蔼稳矫多糖不含有a ( i 一4 ) 糖苷键。雨裂褶菌稳 终多糖溶液哥救蜗牛酶酶解，表爨含有1 3 ( 1 - - 3 ) 糖赘键。 3 3 6 褰碘黢襞他 裂耀菌胞处多糖缀裹碘酸镳氧化1 4 d ，平均每摩客已糖消耗毫碘羧盐 0 5 8 m o l ，产生甲酸0 2 8 m o l ，赢碘黢的消糕是甲酸生成的2 倍，多糖中 以l 一6 位键合的糖基或非还原束端基经高碘酸氧化，消耗2 分子高碘酸 同时释放。1 分子甲酸，由此可知，裂褶菌胞辨多糖含有b ( 1 6 ) 糖萤 键。 3 3 7c p m a s ”cn m r 分析 多糖c p m a s ”c n j j r 图谱结构分析中，糖环上不同位置的碳原子发生 取代后，不管怒二糖、寡糖及多糖，只婺取代基的缔构相同，其向低磁场 仡学位移也基本相识，另一个有需静原猁是，糖环上发生取代盼碳原予的 仡学位移膏较大静交纯，来发生取彳弋鹃c 一2 、c - 3 、c - 4 静住学位移遗常 在7 0 7 7 p p m ，磐在7 8 p p m 潋上骞共振倍罨，剿哥黻费定c 一2 、c - 3 、c - 4 中熬菜一羰鼹予上学取代。朱发生取代豹c - 6 懿纯学挺移遽常焱6 g 6 4 p p m ，发生取代艨则位移到6 7 7 0 p p r a 。擞据以上规律，参考羲穗裁残 基缎成的裁聚糖的”c - n m r 化学位移袭来确定裂裰菌腿终多糖的结槐。 图3 - 2 2 为裂接菌胞外多糖的c p a s ”cn m r 图谱，参照嬲谱，考查 相应范围的信号，确定了取代的发生，结果见表3 - 6 。图谱中8 7 1 1 4 p p r a ( 第2 个峰) 处有信姆出现，说明c - 3 位置发生取代；6 3 0 7 4p p m ( 第 6 个峰) 处的峰说明裂褶茵胞外多糖中存在未发生取代的c 一6 ， 6 9 6 3 0 p p m ( 第5 个峰) 处有信号，说明c - 6 位置发生取代，它是末发生 取代的c 一4 和发生取代c - 6 的峰的叠加。c - 3 和c - 6 位置的取代通常是 与c - 1 发生的，而c - 1 位嚣发生鞭代之衙纯学位移移至1 0 4 p p m 第1 个 峰) 左右。因魏哥叛确定c - i 彼蓬也发生了取代。丽7 5 2 1 5 p p m ( 第4 个蜂) 赴静信号必朱发生凝代熬c 2 、c 一3 蜂静煮翔。 在裂摇萤爨雏多糖c p m a s ”cn m r 图谱中，器峰熬糠对褰度：第l 蜂： 第2 峰：第3 峰：第4 蜂：第5 峰：第6 峰：1 5 1 。2 4 ：1 0 2 7 9 ：1 4 3 5 5 ：1 7 8 。3 8 ： 1 7 l 。5 7 ：1 0 0 。因为峰藏与羰暇子数呈一定芷摆关，筵2 蜂与第8 烽，第1 蜂 与第3 峰的峰高均接近，说明发生取代的c 一3 与束发生取代的c - 6 原子数