（动物学专业论文）罗氏沼虾多倍体育种的研究.pdf

篙熹 摘要 罗氏沼虾( 妇c r d 6 m c f “mr d s e 月6 p 馏f f ) 隶属于节肢动物门，甲壳纲，十足 i | ，长臂虾科，沼虾属，原产东南亚，但已被引种到世界许多地区，是一种养 殖范围很广的淡水经济虾类。罗氏沼虾自1 9 7 6 年引进中国大陆以来，由于其 肉味鲜美，营养丰富等特点，深受广大消费者的喜爱，已成为淡水养殖的重要 产品。但由于目前我国的罗氏沼虾生产几乎都是人工集约化养殖，而实践表明， 长期集约化养殖极易引起性成熟提前，个体偏小，抗逆性差等问题。因此我们 运用细胞工程技术，进行了罗氏沼虾多倍体诱导的研究，因为多倍体生物一般 具有生长快，个体大，肉质好和成活率高等优点。我们首先对罗氏沼虾卵子极体排 出时间和第一次卵裂时间进行了研究，又对正常二倍体罗氏沼虾胚胎的染色体数目 进行了计数，在此基础上，采用热休克和细胞松弛素b 两种方法成功地诱导出 了罗氏沼虾四倍体。 1 罗氏沼虾极体排出时间和第一次卵裂时问的确定 通过石蜡切片观察到，当罗氏沼虾卵子完全成熟时，第一极体已经排出。 第二极体排出的时间约在授精后5 5 分钟。经过雌性原核和雄性原核的形成、 结合，第一次卵裂的时间约在授精后2 l o 一2 3 0 分钟。 2 罗氏沼虾正常二倍体胚胎染色体数目的确定 对正常二倍体罗氏沼虾囊胚期和原肠期的胚胎细胞进行染色体统计，发现 其二倍体染色体数目为2 n = 1 1 8 。 3 热休克诱导罗氏沼虾四倍体 硕士学侄论文 、f 、fr r c ! 1 7t 气i 、 热休克诱导罗氏沼虾四倍体的最好条件是：在受精后2 1 0 分钟时，用4 0 水温处理胚胎1 5 分钟，在这种条件下，最高可以得到3 5 8 6 的四倍体率。 鼢聊 4 细胞松弛素b 诱导罗氏沼虾四倍体 细胞松弛素b 诱导罗氏沼虾四倍体的最好条件是：在受精后2 3 0 分钟，用 1 o m g l 的c b 处理 1 0 分钟，此时最高的四倍体诱导率为3 3 7 8 。 确 关键词罗氏沼虾四倍体诱导 硕士肇位论文 、：n i ；sl l l i 、- a b s t r a c t t h eg i a n tf i e s h w a t e rp r a w n ( 4 a c ，0 6 ，口c f “，玎，d s 已珂6 e ，苫f f ) i sak i n do fp r a w n w i t hg r e a te c o n o m i cv a l u ea n di sc u l t u r e dv e r ya b r o a d t h i sf k s h w a t e rp r a w nh a s b e e np o p u l a ri nc h i n e s em a i n l a n dd u et oi t sd e j i c i o u st a s t ea n da b u n d a n tn u t r i t i o n s i n c ei tw a si n t r o d u c e dh e r e n o wt h ep r a w nh a sb c e no n eo fm em o s tj m p o r t a n t a q u a t i cp o d u c t s i nt h e 矗e s h w a t e rc u l t i v a t i o n h o w e v e r ，s i n c e t h e 】o n g t e r n l a n m c i a l l yi n t e n s i v ea q u a c u l t u r e ，t h a ti st h eo n l yw a y u s e df o r t h i sp m w nn o wi n c h i n e s em a i n l a n d ，i sv e r ye a s yt oc a u s et h ep r o b l e m ss u c ha sb e i n gm a t u r ei n a d v a i l c e ， r e d u c i n g o f 血e b o d y s i z e柚dt h ew e a kr e s i s t a n c et oa d v e r s e c i r c u m s t a n c e ，s ow er e s e a r c h e do nn 坨p o l y p l o i di n d u c t i o no ft h i s p r a w nb y c ”o l o g i c a lt e c h n i q u e ss oa st os 0 1 v et h e s ep r o b l e m s g e n e r a l l yt h ep o l y p l o i d sc a j l g r o w f l a s ta n dg e tab i gs i z et h a nt h ed i p i o i d ，a n d t h e yh a v es t r o n g e rr e s i s t a n c et o d i s a d v a f l t a g e o u se n v i r o n m e n t f u r t h e n l l o r ei t s t a s t ei sa l s on i c e h e r e ，r f i r s t l y i n v e s t i g a t e do nt h et i m eo f l h ee x t n l s i o no ft h ef i f s ta n dt h es e c o n dp o l a rb o d i e sa n d o ft h en r s tc l e a v a g e t h e nis t u d i e do nt h ec h r o m o s o m en u m b e ro ft h ew i k lt y p e e m b r y o so ft h i sp r a 啪o nt h e s eb a s i s ， i s u c c e s s m l l yi n d u c e dt h et e t r a p l o i d y e m b r y o so ft h eg i a n tf r e s h w a t e rp r a w nb yh e a t - s h o c ka 1 1 dc ”o c h a l a s i nb ( c b ) t r e a t i n e n t 1 t h ei n v e s t i g a t i o no ft h ee x t r u s i o no f t h en r s ta n dt h es e c o n d p o l a rb o d i e sa n d 0 f t h e 疗璐t c l e a v a g e t h et j m eo ft h ee x 咖s i d no ft h ef i r s ta 1 1 dt h es e c o n dp o l a rb o d i e sa n do f t h e n r s tc l e a v a g ew e r ei n v e s t i g a t e db yp a r a m ns e c t i o n s w eo b s e r v e dt h a tt h en r s t p o l 盯b o d y h a db e e nr e l e a s e dw h e nm e o o c ”em a t u r e dp h y s i o l o g i c a l l y b y5 5m i n a f t e rt h el n s e m i n a t l o n ，m es e c o r i dp 0 1 a rb o d yw 丛托l e 懿e d n l cf i r s t c i e a v a 2 e i i i 3 蓟 硕士竿位论文 、1 、叫ir k | 1 7r o c c u r r e d 印p m x i m a t e l y 2 1 0 - 2 3 0m i n f 0 1 l o w i n gi n s e m i n a t i o n 2 t h ec h m m o s o m en u m b e ro fw i l dt y p ee m b r y o t h ee v a l u a t i o no ft h ec h m m o s o m en u m b e rs h o w e dt h a tt h e r ea r ell8c i l r o m o s o m e si nw i l dt y p ee m b r y o 3 i e t r a p l o i d yi n d u c t i o nb y h e a ts h o c k t h e o p t i m u m c o n d i t i o no fh e a t s h o c k a p p e a r e d t ob ea t2 l o m i n p o s t f e n i l i z a t i o n ，t r e a t i n g f o r1 5m i na t4 0 ，w h i c hc o u l d y i e l d 3 5 8 6 t e t r a p l o i d ye m b r y o s 4 i k t r a p l o i d yi n d u c t i o nb yc y t o c h a l a s i nb t r e a t m e n t u n d e rt h ec o n d i t i o no f t r e a t m e n tw i t l l1 0m lc bf o rl om i n a t2 3 0m i na r e r f e n i i i z a t i o n ，w eo b t a i n e dt h cm a ) 【i m u mi n d u c t i o nr a t eo f t e t r a p l o i d ，3 3 7 8 k e yw o r d s 如c r d 6 m c 向f “脚，e 行6 e 曙f f t e t r a p l o i d i n d u c t i o n 硕士学位论文 、：、i i j t ) l 】i h 、 一、前言 1 多倍体育种的研究意义 多倍体是指生物体细胞中含有三个或多个染色体组的个体。在自然界中， 多倍体现象在高等植物中比较普遍，在动物界中，多倍体现象不多见。 2 0 世纪6 0 年代以来，世界农业掀起了“绿色革命”。品种改良使陆地上栽 种的水稻、小麦等多种农作物产量显著增加，质量也大大提高，对全球经济产 生了巨大的影响。在此带动下，水产养殖业随之开展了鱼类、贝类等水生动物 的遗传育种基础研究及应用研究工作，并取得了许多可喜的成果。染色体倍性 操作是水生动物细胞工程育种研究中一个行之有效的途径。应用染色体组操作 技术，以期培育出生长快，抗逆能力强的新品种，是生物领域广泛研究的一项 工作。国家科委海洋高技术领域已将对虾、牡蛎、海洋鱼类等的多倍体育种计 划纳入优先资助范围，该领域已成为现代遗传育种研究的热点之一。由于三倍 体动物一般是不育的，因为它具有三套( 3 n ) 染色体，在减数分裂中，虽然n 对同源染色体可以正常的分向细胞两极，但是另一套染色体的每一条只能随机 的进入某一极。因此三倍体减数分裂后的性细胞染色体数目一般在n 与2 n 之 间，只有1 露“的机会产生染色体数为n 和2 n 的配子。由于染色体数目在n 和 2 i l 之间的 | j j 级卵母细胞是不能发育的，所以三倍体性腺发育受阻，不能生殖， 这样有可能使用于性腺发育的营养物质转变为用于肌肉的生长上，还可克服亲 本因性腺早熟及繁殖而造成成体规格小及容易死亡等问题，因此它们具有生长 快，个体大，肉质好和成活率高等特点( 楼允东，1 9 8 4 ；w u 等，1 9 9 0 ；c e s a r ， 2 ( ) 0 0 ) 。在鱼类，三倍体可比二倍体体长增加2 0 左右，最大体重增加一倍以 上( w u ，1 9 9 0 ) 。在贝类，三倍体一般可比二倍体增加4 0 的肉重( s t a n l e y 等， l ) 8 4 ) 。据c e s a r 等( 2 0 0 0 ) 研究表明，同等条件下养殖的扇贝爿懵印e c ，e h v 阴护f c d j “s ，在达到2 8 0 天时，三倍体个体重量比二倍体增加8 6 ，软体重增 加l l l ，闭壳肌增加1 8 2 。曾志南等( 1 9 9 9 ) 的研究表明，三倍体牡蛎一 年后，软体肉重、糖原等含量均比二倍体高。英国的科学工作者曾进行过品味 硕士学位论文 、1 、o i fp 、i 卜、 试验，结果表明，参加比较者偏爱三倍体雌鱼，而最不喜欢二倍体雄鱼。因此 可以推测，三倍体的水生动物应该具有广阔的市场前景，其独特的品味将具有 很强的市场竞争力。 多倍体也是物种进化的途径之一，鱼类进化史上就有这方面的生动记录， 现已查明，真骨鱼类中涉及多倍体进化的有鲟科( 一c 驴p n s p r f 出口) 、白鲟科 ( 尸( ，y d 如删缸) 、茴鱼科( 聃m 口f ，胁p ) 、鲑科( 勋砌o ”豇缸p ) 、白鲑科 ( c d 旭即月胁p ) 、胭脂鱼科( c h ，o s f 。胁p ) 、鲤科( c 炉r f 胛此如8 ) 、鳅科( c 。6 f ，f 幽p ) 和花鳅科( j d d p c f ，f 如e ) 等九科。其中鲑科和自鲑科整科地判断为四倍体科，胭 脂鱼科的大多数种类也是多倍体( 咎瑞光，1 9 8 4 ) 。据分析鲑鳟鱼类的祖先为 二倍体，它在冰川的影响下，经过四倍化而演变为今天的四倍体类型，其祖先 可能是鲱鱼( 李树深，1 9 8 0 、1 9 8 1 ) 。就目前的鲤目鱼类而言，位于不同地理 带的鱼类，其染色体数目不同，北极带鱼类区系的平均数为8 0 ，北方带为7 0 ， 温带为6 0 ，皿热带为5 0 ，热带仅4 8 2 。另方面，位于相似地理带的鱼类如 鲱形目，其海洋鱼类的平均染色体数为4 7 ，其淡水鱼类为7 5 。这些资料不仅 说明，鱼类的演化与不同的环境条件相关，而且还说明多倍体是鱼类和其他水 产生物形成新种、亚种、变种的一条重要途径。在高山和北方寒冷地区发现多 倍体出现的概率比较大，也进一步说明，多倍体生物具有更强的抵抗外界恶劣 的自然环境的能力。 2 水生经济动物多倍体育种的研究进展 关于人工诱导三倍体水生经济动物的研究，最早可追溯到2 0 世纪三十年 代。f a n i ( 1 l a u s e r 和g r i f f i t h s 于1 9 3 9 年报道，在蝾螈中成功地诱导出了多倍体。 但真正诱导三倍体成功的可算是s w a m p ( 1 9 5 6 ) ，他不仅以低温诱导出了三棘 刺鱼( 6 饥馆，口盯“阳f “如口，嬲) ，而且还饲养至成鱼。自2 0 世纪7 0 年代以来， 已有2 0 余种鱼类诱发获得了多倍体( 楼允东，1 9 8 4 ；桂建芳等，1 9 9 l ：f e l i d a 等，2 0 0 1 ) 。在此带动下，贝类的多倍体研究自8 0 年代开始以来，取得了快 速发展( a l l e n 等，1 9 8 2 ，1 9 9 2 ；林琪等，2 0 0 l ；常亚青等，2 0 0 2 ) 。有的多倍 体已经应用于生产养殖上，并带来了巨大的经济效益。例如在美国，牡蛎的三 倍体苗种生产已达到商业化规模( 王清印，1 9 9 6 ) 。 相比之下，十足类甲壳动物的多倍体育种则起步较晚，其抱卵孵化的特性 是进行多倍体育种最大的难题，加之对十足类动物自身的某些生殖生理学特殊 性和细胞遗传学的研究极为缺乏，使得该领域的研究进展不快，至今仅有3 4 种十足类进行过多倍体诱导的实验或研究( l u 等，1 9 9 3 ：c h e n 等，1 9 9 7 ；q i u 等，1 9 9 7 ) 。相建海等以锐脊单肢虾为材料，最早开始虾类染色体组操作的可 行性研究。之后，他们用细胞松弛素b ( c b ) 和温度休克两种方法成功诱导 了中国对虾多倍体，结果显示，与对照组相比，实验虾平均生长都较快( 相建 海等，1 9 9 2 ) 。 我国从9 0 年代中后期，启动了“8 6 3 ”海洋生物技术研究计划，通过多年 努力，目前已在一些主要经济和养殖虾蟹、贝类等动物开展了多倍体研究，取 得了良好的成绩，特别是在产业化生产方面进展迅速，通过生产多倍体动物， 提高了养殖动物的成活率，增强了动物的抗逆能力，提高了生长速度，缩短了 养殖周期。目前我国的对虾、长牡蛎、鲍、合浦珠母贝、栉孔扇贝的多倍体诱 导技术和产业化水平已具世界先进行列。 我国对于多倍体诱导的一些基础研究相对落后，其他一些养殖动物的多倍 体研究尚待进行，诱导技术有待进一步完善，另外应加强四倍体诱导研究，并 实现三倍体苗种生产的规模化生产，以达到提高多倍体诱导效率，促进我国海 水和淡水养殖业健康、持续发展的目的。 3 多倍体诱导的原理和方法 人工诱导多倍体的原理，主要是通过阻止卵母细胞第一极体或第二极体的 排出，使得受精卵中染色体组加倍，形成三倍体。或者在受精卵第一次卵裂时， 在不影响染色体复制的前提下，阻止细胞质分裂，这样使得复制后加了倍的 染色体合在一起形成四倍体。 目前，水产生物多倍体的诱导方法主要有：温差处理、药物处理、静水压、 杂交等。 温度处理包括冷休克和热休克两种方法。一般以略低于或略高于致死温度 硕士学位论文 、1 、叭r s i i 【 的热休克或冷休克方法抑制极体排出或第一次卵裂来获得三倍体或四倍体。温 度休克法费用低，适宜在生产中应用，但可能对卵子的损伤较大，处理后胚胎 的死亡率较高。a r a i 等( 1 9 8 6 ) 根据2 0 下皱纹盘鲍在受精后1 5 2 0 分钟排 出第一极体，3 5 4 0 分钟排出第二极体的特点，于授精后1 2 或3 2 分钟分别用 3 的低温处理受精卵1 5 分钟，获得了7 0 8 0 的三倍体。陈立侨等( 1 9 9 7 ) 用热休克的方法诱导出中华绒螫蟹的三倍体胚胎和四倍体幼体。 用来处理受精卵以获得多倍体的常用药物一般有：细胞松弛素b ( c b ) 、 秋水仙素、咖啡因、6 二甲基氨基嘌呤( 6 d m a p ) 、和聚乙二醇等( 常亚青等， 2 0 0 2 ) 。细胞松弛素b 通过抑制微丝的组装，使细胞质不发生分裂，但并不阻 止染色体的复制，从而诱导多倍体。d o m i n g 等( 1 9 8 7 ) 在2 5 下，以1 m l 的细胞松弛素b 处理受精后3 0 4 5 分钟的太平洋牡蛎( c r n s 5 0 曲e 口g 堙口s ) 1 5 分钟，诱发了8 8 9 的三倍体；秋水仙素诱发多倍体的机制在于它不影响合 子或细胞内染色体的复制和分裂，但它能抑制微管的组装，使已有的微管解聚， 从而阻止纺锤体的形成或破坏已形成的纺锤体，使细胞的染色体加倍而不分 裂。s i m i t h 等( 1 9 7 9 ) 曾用o 0 1 秋水仙素溶液处理西红点鲑( 勋，v p 砌淞 口o n ，加口加) 的受精卵，获得多倍体；6 一d m a p 是蛋白激酶抑制物，可以破坏细 胞分裂中期纺锤丝的形成，从而诱导三倍体；咖啡因对微管具有特异性作用。 可阻断微管蛋白组装成微管结构，从而阻止细胞分裂，一般与热休克结合使用。 聚乙二醇是常用的细胞融合剂，通过细胞融合而使细胞染色体加倍。 静水压能破坏细胞分裂的纺锤丝，从而抑制受精卵的极体排出。现在这种 方法已被广泛应用于水产生物多倍体的诱发。y a m a z a k i f l 9 8 3 ) 用6 5 0 7 0 0 k c m 2 的压力在虹鳟授精后5 1 5 分钟开始处理，并持续6 7 分钟，获得 多倍体：桂建芳等( 1 9 9 0 ，1 9 9 l ，1 9 9 5 ) 采用静水压休克的方法获得了批量三 倍体和少数四倍体水晶彩鲫，并对用静水压休克的方法获得三倍体和四倍体的 细胞学机理进行了探讨，认为静水压休克能够促使第二极体保留和抑制第一次 卵裂的最显著作用是静水压处理破坏了有丝分裂器中的纺锤丝，即纺锤体和星 体，从而暂时阻断了有丝分裂进程。 种间杂交也是诱导水生生物多倍体的方法。现在，人们已经在不同亚科间 的杂交中发现多倍体现象。如草鱼早三角鲂6 子l 代为异源三倍体( 刘思阳， 4 1 9 8 7 ) ，种间杂交时会导致第二极体不排出，其原因还不是特别清楚。在种内 杂交中不排出第二极体的现象十分罕见。 4 多倍体的鉴定 多倍体的产生途径有多种，诱发率的多少和被诱发个体的染色体组数，再磊 不同的材料和条件下，往往不同。因此，对于多倍体的鉴定是多倍体育种必不 可少的环节。目前鉴定多倍体的主要方法有： ( 1 ) 染色体数目或组型分析 染色体数目或组型分析是鉴定多倍体最准确、可靠的方法，能为多倍体的 遗传组成和诱发率提供直接证据。姜卫国等( 1 9 8 7 ) 在诱导合浦珠母贝多倍体 时，就用压片法制作早期胚胎的染色体，将染色体数为4 2 的个体鉴定为三倍 体，测出各种条件下对三倍体诱发率的影响。 f 2 1 核仁数目的银染法测定 细胞的核仁数目一般随所含染色体组数的增加而按比例增加，单倍体细胞 含一个核仁，二倍体，三倍体和四倍体细胞分别含有二，三和四个核仁。人们 已利用这个原理，采用银染法分析胚胎细胞的核仁分布情况，鉴定出鲫，鲤， 虹鳟，革胡子鲶等多倍体( 容寿柏等，1 9 9 0 ) 。 ( 3 ) 细胞核体积的测量和比较 同一研究对象的二倍体和多倍体个体，细胞核大小不同。单倍体细胞核的 体积只有二倍体的一半，三倍体，四倍体的核体积分别为二倍体的1 5 和2 0 倍左右。因此，可以从相同组织细胞核体积的比较来鉴定多倍体。但是，该方 法一般仅限于鉴定同一物种或亲缘关系较近的物种之间具有不同染色体倍性 的个体。国外已用这种方法鉴定过鲑鳟鱼、银鲫、鲽、罗非鱼、鲶等鱼类多倍 体。 ( 4 ) d n a 含量的测定 同一物种的二倍体细胞，不管它属于什么组织，部位或结构，也不管它分 化程度如何，功能差异多大，细胞核的d n a 含量基本上是相同的。精子是单 倍体，d n a 含量正好是体细胞的一半。在同一物种内，染色体的组数和d n a 藏篇需、 含量成比例关系。利用这些特点，测定研究对象的d n a 含量并比较它们的关 系，来鉴定多倍体也是合理的。在有对照组的情况下，用该方法对所诱发的多 倍体进行鉴定也是严格可靠的，但是难以提供多倍体遗传构成的证据。 流动细胞测定法，t a b a r i n i ( 1 9 8 4 ) 以海湾扇贝的外套膜为材料，用矫形 诊断系统的5 0 h 型细胞荧光计数器( o n h od i a g n o s t i cs y s t e m sm o d e l5 0 h c ”o m e t r y ) ，将样品细胞核的荧光在y 轴上用细胞频率表示，x 轴代表d n a 的相对含量，实验证明，三倍体的d n a 比二倍体多5 0 ，细胞荧光测定与染 色体制片所得结果一致。流式细胞测定法的优点是：能够将大量染过色的细胞 荧光快速测出，因而可以快速推算出d n a 含量，现已用于多种鱼类多倍体的 鉴定( 楼允东，1 9 8 4 ) 。 显微荧光测定法，我国的李渝成等( 1 9 8 3 ) 就采用这种手段，用f e u l g e n 染色法，在显微分光光度计下对我国十四种淡水鱼的红血球细胞核d n a 的激 发荧光强度进行测定和比较，测得泥鳅细胞核d n a 含量大约是大鳞付泥鳅细 胞核d n a 含量( 2 2 p g ) 的2 倍，进一步证明泥鳅是四倍体类型的鱼。可见， 该方法对于确定亲缘类群、亲缘种、亚种或类型的染色体组数也是可以借鉴的。 同位素标记测定法，该法用”p 脱氧核苷标记受测个体和对照组个体，然 后，用放射自显影技术或液体闪烁器进行定量测定，从实验结果的比较中，判 定受测个体的染色体组数。 采用d n a 测定法鉴定多倍体，虽然有快速的优点，但是，对于设备或仪 表的要求较高，对于异源多倍体的遗传构成难以提供准确的证据。 ( 5 ) 极体观察记数 诱导的三倍体合子只放出1 个极体，因此对于极体容易观察的贝类，可通 过观察处理后的早期胚胎极体排出的数量来估计三倍体早期胚胎的倍性，该方 法在大扇贝和珍珠贝中有效。 ( 6 ) 同工酶电泳法 该方法是通过定量比较同工酶各组成电泳带的相对染色强度或根据电泳 异型酶是否存在进行倍性判定的。a l l e n 等在砂海螂的三倍体鉴定中采用了这 一方法。 目前鉴定多倍体的方法仍在改进和发展中，还会有新的方法出现，但是无 6 硕士学位论文 、”ir i ) l 1 ： 论哪种方法，它的产生和发展都要以染色体数目或组型的分析为基础，才能做 出可信的判断，甚至在依据细胞核大小或d n a 含量进行鉴定时，也有人同时 进行染色体分析，因为多倍体的直接证据只能来自个体的染色体数目或组型。 罗氏沼虾( 如c r d 6 r 口c m m ，0 s p n 6 p 曙田又名马来西亚大虾，属于节肢动物门 ( 爿，f ，印口出) ，甲壳纲( o w m c p 口) ，十足目( d p c 印。如) ，长臂虾科 ( p d 肠p 州d n f 出p ) ，沼虾属( 朋a c ，d 6 阳c m 所) ，是 于印度太平洋区域和亚热带地区，包括东巴基斯 济虾类。原产 马来西亚等。 幼体生活在盐度为8 2 2 的咸淡水中，仔虾和成虾生活在淡水中。生存温 度为1 5 3 5 ，生长适温2 2 3 2 。池塘养殖5 个月左右，体长可达8 9 c m ， 体重可达2 0 2 5 9 。罗氏沼虾在原产地，最大个体可长达4 0 厘米，体重6 0 0 多克( 王玉党，1 9 9 4 ) 。我国台湾省于1 9 7 0 年首先引进试养，大陆地区于1 9 7 6 年秋由中国农业科学院从日本引进该虾。1 9 7 7 年首孵成功，经多年的实践，解 决了越冬保种、苗种繁殖、幼虾培育、商品虾养殖等技术问题，现已发展成为 我国虾类淡水养殖业的支柱产业。1 9 9 3 1 9 9 7 年是罗氏沼虾养殖发展的高峰 期。9 0 年代中后期，养殖技术趋向成熟。养殖方式有单养和混养、池塘养殖和 稻田养殖。池塘养殖有的还改进为不同规格套养、一次放足多次捕捞( 捕大留 小) 和全年放养2 批等养殖模式。饲养方法也趋于多样化。单产可达7 5 0 0 k 鲫1 n 1 2 ， 利润高达1 8 万元1 1 i i l 2 。技术的突破和产量的提高极大地推动了罗氏沼虾的养 殖，全国的罗氏沼虾茁种生产从1 9 9 3 年的1 0 多亿尾增长至2 0 0 0 年的约1 5 0 亿尾，养殖产量也从o 3 8 万吨增加到9 7 4 万吨。其规模化养殖所形成的苗种、 饲料、养殖技术和销售等多种体系增强了该品种的生命力和竞争力，近几年内 罗氏沼虾的养殖将继续受到重视和持续发展( 黄玉玲，2 0 0 3 ) 。罗氏沼虾被引 进中国大陆以来，由于其肉味鲜美，营养丰富等特点，已成为淡水养殖的重要 产品。其肉含蛋白质2 0 5 ，脂肪0 4 8 ，属高蛋白、低脂肪的优良水产品种。 尽管如此，由于目前我国的罗氏沼虾生产几乎都是人工集约化养殖，成本较高。 且易引起性成熟提前，个体偏小，抗逆性差等问题。因此我们采用细胞工程技 术，对罗氏沼虾进行优良多倍体的选育研究。这不仅对种质的鉴定、保护、优 良种质资源的有效利用研究和遗传育种研究具有重要的理论意义，而且对降低 7 嘲篇羔、 生产成本，提高经济效益，促进和带动其它虾、蟹类等甲壳动物遗传育种工作 的开展，对全面推动水产养殖事业的发展，实现“蓝色革命”的到来，有着广 阔的应用前景和重要的社会经济意义。 要进行多倍体的研究，首先要对罗氏沼虾卵子的极体排放时间和第一次卵 裂的时间进行初步研究。另外还要对其正常胚胎的染色体数目有一个明确的了 解。关于罗氏沼虾染色体的研究已有报道( c l a v e z ，p ，口，1 9 9 1 ) ，但报道中所 取的材料是来自成体组织，本研究首先对罗氏沼虾极体排出的时间以及正常胚 胎的染色体数进行了研究。在此基础上，采用温度休克和细胞松弛素b ( c b ) 的方法对罗氏沼虾多倍体诱导进行了研究。 硕士学位论文 j j 卜i 、e j i f 、 二、材料与方法 1 材料 1 1 实验用虾 实验所用的罗氏沼虾由武汉市柏泉虾业公司罗氏沼虾种苗场友好赠送或 购自武汉市大东门市场，选其中活泼健壮的个体作为实验材料。 1 2 实验药品 ( 1 ) 秋水仙素( 2 ) k c i( 3 ) 无水乙醇 ( 4 ) 冰醋酸( 5 ) 吉姆莎( g i e m s a ) 染液 ( 6 ) 细胞松驰素b ( c b ) ( 7 ) 波恩氏液( 苦味酸：甲醛：冰醋酸为1 5 ：5 ：1 ) ( 8 ) 埃利氏苏木精( 9 ) 二甲苯 ( 1 0 ) 5 的福尔马林 ( 1 1 ) o 2 的伊红( 1 2 ) 正丁醇( 1 3 ) 氯仿 ( 1 4 ) 松油醇( 1 5 ) 石蜡 ( 1 6 ) 二甲基亚砜( d m s o ) ( 1 7 ) 中性树胶 所用化学试剂均为分析纯，除细胞松驰素b ( c b ) 为美国s i g m a 公司产品 外，其余都是国产。 吉姆莎( g i e m s a ) 母液的配方：g i e m s a 粉剂o 5 9 ，甘油3 3 m l ，甲醇3 3 m l 。 将g i e m s a 粉末先加入少量甘油，在研钵内研磨至无颗粒为止，再将剩下的甘 油全部加入。于5 6 温箱内保温2 小时，再加入甲醇，保存于棕色瓶中，置于 冰箱内。 埃利氏苏木精配方： 甲液：苏木精l g ，纯酒精6 m 1 。 乙液：铵矾饱和水溶液1 0 0 m l 。 丙液：甘油2 5 m l ，甲醇2 5 m l 。 将甲液一滴一滴的加入乙液，并随时用玻棒搅动，然后暴露于阳光和空气 中约一周到十天。再加入丙液将混合液静置1 2 个月至颜色变深后过滤。 9 熟慧未羔 1 3 仪器设备 ( 1 ) 水族箱( 2 ) 加氧泵 ( 3 ) 控温器 ( 4 ) 台式高速离心机( 5 ) 生化培养箱 ( 6 ) n i k o n 照相显微镜 ( 7 ) 石蜡切片机( 8 ) 水浴锅 除照相显微镜为日本产外，其余都是国产。 2 万 去 2 1 亲虾培育、产卵与授精 将购买回来的罗氏沼虾放在水族箱中饲养，并用加氧泵充氧，温度每天升 高1 2 ，最后恒定在2 8 。每天分早晚两次投喂新鲜碎肉，每两天换去约1 3 的水，使亲虾在良好的培养条件下发育成熟。当雌虾生殖蜕皮后，将其与一只 雄虾一起饲养，待雌虾腹部附有精荚时，把雄虾移走，雌虾单独培养，同时昼 夜连续观察雌虾行为，等待产卵。 2 2 罗氏沼虾卵子极体的排出和第一次卵裂时间的确定 当发现交配后的雌虾有产卵行为时，取出雌虾，先取出其腹部附着的精荚， 在小容器中用少量水搅碎，使释放出精子。再剪开背部头胸甲，取出卵巢，释 放出其中的成熟卵子，与精子充分混合，5 分钟后将授精卵放入调好水温的干 净大玻璃缸里的绢布上培育，同时进行充氧，再按照设定的时间取样。将取出 的授精卵用玻恩氏液固定6 一1 2 小时后，去掉固定液，用7 0 的酒精反复冲洗 受精卵，除去内含的酸类，用5 的福尔马林液保存。脱水时，先用5 0 和7 0 的酒精各浸泡5 一1 0 分钟，再投入脱水甲剂( 纯酒精：氯仿：冰醋酸为6 ：3 ： 1 ) 1 5 3 0 分钟，更换脱水乙剂( 正丁醇：氯仿：冰醋酸为6 ：3 ：1 ) ，经1 0 一2 0 分钟后，再用松油醇( i ) 处理2 0 分钟，松油醇( i i ) 处理l o 分钟，l 2 松油醇+ l 2 石蜡5 一1 0 分钟，纯蜡i 、i i 各1 0 分钟，然后石蜡包埋，8 1 0 um 连续切片，苏木精一伊红染色。染色过程如下：二甲苯i ( 1 5 分钟) 一二 甲苯i i ( 1 5 分钟) 一1 ，2 二甲苯+ l 2 纯酒精( 3 分钟) 一纯酒精( 3 分钟) 一 1 0 9 0 酒精( 2 分钟) 一8 5 酒精( 2 分钟) 一7 0 酒精( 2 分钟) 一5 0 酒精( 2 分钟) 一蒸馏水( 2 分钟) 一埃利氏苏木精( 3 0 分钟) 一流水( 1 5 分钟) 一1 盐酸数秒至受精卵呈微红色一流水( 1 5 分钟以上) 蒸馏水( 2 分钟) 一5 0 酒精( 2 分钟) 1 0 酒精( 2 分钟) 一8 5 酒精( 2 分钟) 一9 5 酒精配制 的o 2 伊红( 5 分钟) 一9 5 酒精( 5 分钟) 一纯酒精i ( 3 分钟) 一纯酒精 i i ( 3 分钟) 一l 2 二甲苯+ l 2 纯酒精( 5 分钟) 一二甲苯i ( 5 分钟) 一二 甲苯i i ( 5 分钟) 一中性树胶封片，日产n i k o n 显微镜下镜检并拍照。 2 3 罗氏沼虾胚胎染色体的研究 发现产卵时，记为受精零时。分别于受精后2 1 小时( 囊胚期) 和4 5 小时 ( 原肠期) ( 赵云龙，1 9 9 2 ) + ，取腹部胚胎约l o o 粒进行染色体制片。将取出 的胚胎用5 0 0 u g m l 秋水仙素在1 6 的生化培养箱中培养3 4 小时，去掉秋水 仙素液，用o 1 m o l ，lk c l 于3 7 低渗处理2 0 - 3 0 分钟，小心移去低渗液，加入 预冷至4 的卡诺氏固定液( 无水乙醇：冰醋酸= 3 ：1 ) ，于4 固定至少1 5 小时，中间更换卡诺氏固定液两次，再用预冷至4 的后固定液( 无水乙醇： 冰醋酸= l ：1 ) 于4 进行后固定。制片时，取3 5 个固定后的胚胎于塑料离 心管中，加入5 0 一6 0 醋酸使其软化，用镊子和解剖针迅速捣碎，使胚胎细胞 解离分散，再在7 0 0 0 r p m 下离心1 5 分钟倒去上层的液体，加少许新鲜固定 液用吸管吹打均匀，在预冷的干净载玻片上滴2 3 滴这种细胞悬液，在酒精 灯火焰上微烤，后用2 0 的g i e m s a 染液( p h 7 2 的磷酸缓冲液配制) 染色3 0 分钟，慢慢冲去染液，空气中自然干燥后，以中性树胶封片，日产n i k o n 显微 镜下镜检并拍照。 2 4 罗氏沼虾四倍体的诱导 2 4 1 热休克处理诱导四倍体 按照设计的处理起始时刻，达到处理时刻后，取出抱卵雌虾，用干净纱布 ( 或其他干净的防滑布) 将虾的头胸甲轻轻包裹住，将其抱卵的腹部浸入调好 赵云龙1 9 9 2 罗氏沼虾胚胎发育的研究华东师范大学博士学位论文 l l 硕士学位论文 、”州i r sl 【：卜 水温( 3 9 4 1 ) 的水浴锅中，其问轻轻晃动虾体，使附肢上的受精卵得到均 匀充分的热休克。处理完毕后，将虾放到原环境中继续精心饲养。分别十受精 后2 l 小时( 囊胚期) 和4 5 小时( 原肠期) 取腹部胚胎至少1 0 0 粒进行染色体 制片。并取数个不经温度休克的虾胚胎作对照。 2 4 2 细胞松弛素b ( c b ) 处理诱导四倍体 将cb 溶于00 1 二甲摹亚砜( d m s o ) 中，配成10 mg ，l 母液，置于4 冰箱中保存。实验时用00 1 一甲基亚砜，将c b 配成浓度分别为05 、1 0 和 l 5 m l 的溶液。达到处理时刻后，将抱卵雌虾取出分别置于浓度为0 5 1 5 m l 的c b 溶液中处理，到预定时间( 1 0 2 0 m i n ) 后，再用o0 1 的d m s o 将雌虾清洗两次，每次1 0 分钟，再用清水泡1 0 分钟，最后将雌虾放同2 8 水 族箱中孵化，每个实验至少采用3 个平行处理。对照组只用00 l 的d m s o 处理，处理完后同样放入2 8 水族箱中孵化。分别于受精后2 l 小时( 囊胚期) 和4 5 小时( 原肠期) 取腹部胚胎至少1 0 0 粒进行染色体制片。 硕士学位论文 、f 、叫1 1 r s f f ! 。、 三、实验结果 1 罗氏沼虾卵子极体排出时间和第一次卵裂时间的确定 切片观察表明，从正在排卵的雌虾卵巢中取出的成熟的卵子，卵质中充满 卵黄，在卵膜边缘可以见到排出第一极体( 图1 ) ，此时在卵内，细胞核物质为 开始第二次成熟分裂做准备。大约在授精后5 5 分钟，可以见到第二极体排出 ( 图2 ) 。以后，精核和卵核逐渐形成雄性原核和雌性原核，并向卵的中央迁移， 一般雄性原核比雌性原核要小。在授精后2 1 0 分钟左右，可以观察到雌雄原核 会合，出现第一次卵裂的图象( 图3 ) 。大约在授精后2 3 0 分钟，可以看到第一 次核分裂的完成，授精卵中出现两组核物质，即姊妹染色体团块分离，形成两 个子核，但这时还没有细胞质分裂的迹象( 图4 ) 。 图1 成熟的卵子( 箭头示排出第一极体) 。kq o f i g - lr j p ee g g ( t h ea r r o ws h o w st h ee x t r u s i o no ft h ef i r s tp o l a rb o d y ) 硕士罕位论父 1 “lr i t s 】f i n i 、 图2 授精后约5 5 分钟，第二极体也排出( p b ：极体) ，口t f i g 2t h es e c o n dp o l a rb o d yr e i e a s e da t5 5m i np o s t i n s e m i n a t i o n ( p b ：p o i a r b o d y ) 图3 授精后2 1 0 分钟，雌雄原核靠近( p n ：原核1 加t 吣 f i g 3b y2 1 0m i na f t e rt h ei n s e m i n a t i o n ，t h ef e m a i ea n dm a i ep r o n u c i e ic l o s e w i t he a c ho t h e r ( p n ：p r o n u c l e u s ) 1 4 硕士学位论文 、1 u il r sl i j i o 卜 图4 授精后2 3 0 分钟，第一次卵裂后期，两个子核( d n ) 已经分开，一疋u 。 f i g 4 2 3 0m i nf b i i o w i n gi n s e m i n a t i o n ，t h ea n a p h a s eo f t h en r s tc i e a v a g e ( t h e a r r o wi n d i c a t e st h es e p a r a t e dt w o d a u g h t e rn u c l e i ) 罗氏沼虾胚胎染色体的研究 通过对罗氏沼虾囊胚期、原肠期胚胎细胞的染色体制片观察与统计，分析 得出正常二倍体虾的染色体数2 n - 1 1 8 ( 图5 ) ，从表1 可以看出，有一些胚胎 细胞具有1 0 0 1 0 9 条染色体，还有一些细胞具有7 0 7 9 条染色体( 13 5 ) 。 图s 罗氏沼虾胚胎的染色体( 2 n = 1 1 8 ) 口x ， f i g 5 t h e d i p l o i dc h r o m o s o m eo f z ，琊阴6 p ，：窖靠( 2 n = 1 1 8 ) 1 5 辫 矿隅弋 潺慧蒸、 = _ l - ! _ _ ! ! ! ，_ ，! ! ! ! ，! ! ，一 表l 各染色体数区段所占比例 t h b l elt h ep r o p o r t i o no f t h ec h r o m o s o m en u m b e rs e c t i o n s 染色体数 所占百分比 t h ec h r o m o s o m en u m b e r t h e p r o p o n i o n ( ) 1 1 5 一1 1 9 1 1 0 一1 1 4 1 0 5 一1 0 9 1 0 0 1 0 4 9 0 9 9 8 0 一8 9 7 0 7 9 6 0 6 9 5 0 5 9 3 罗氏沼虾四倍体的诱导 3 1 热休克诱导罗氏沼虾四倍体 根据结果1 和前人的研究( 陈立侨等，1 9 9 7 ；q i u ，1 9 9 7 ) ，我们确定如下 试验方案( 表2 ) 。 实验结果表明，用热休克诱导产生罗氏沼虾四倍体，其染色体数目约为2 3 6 条( 图6 ) ，对照组即正常条件下二倍体虾的染色体数是1 1 8 条。从表3 的1 到3 组我们可看出，受精后2 1 0 分钟时在3 9 下热休克处理受精卵i 5 分钟， 其四倍体率为2 0 5 4 ，当温度为4 0 时，四倍体的诱导率较高( 3 4 6 2 ) ， 而当温度升高到4 1 时，诱导率有所降低( 2 8 6 3 ) 。 1 6 3 6 3 5 6 j ，五m舶m舶；呈。舶 硕士学位论文 1 、j i k 、l i j t 3 i 、 表2 热休克诱导罗氏沼虾四倍体的实验因子水平表 t h b l e2t h ef a c t o r sa n dt h e i rl e v e i su s e df o rt h ee x p e r i m e n to f t e t r a p l o i d y i n d u c t i o nb yh e a ts h o c k i n 坦，哪l p 月6 p ，苫豇 表3 中的第4 组到第6 组是