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全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 摘要 在不可再生能源资源的目益枯竭，石油价格屡创新高以及石油燃烧所 带来的环境污染，温室效应等一系列问题的情况下，生物炼制受到世界各 国的普遍关注，生物燃料作为一种新兴产业在全球崛起。燃料乙醇被认 为最有发展前景的可再生绿色能源之一。酿酒酵母是乙醇生产的主要菌株。 本文从自然界分离得到1 6 0 株酵母，经过t t c 一级筛选、糖浓度耐性 二级筛选和葡萄糖发酵三级筛选获得7 株发酵性能较好的菌株。对g x l 、 g x 7 、g x l 4 0 菌株进行分子鉴定，结果表明三株都是酵母属( s a c c h a r o m y c e s ) 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e ss c e r e v i s i a e ) 。对g x 7 菌株g 4 18 抗性实验表明， 在l o o g g m l 时菌株不能生长，初步发酵性能的研究，产乙醇11 0 4 。 本研究克隆了酿酒酵母p g k 启动子，利用报告基因一绿色荧光蛋白 ( g f p ) 进行了活性功能验证，结果表明p g k 启动子具有活性功能。构建 了含g 4 1 8 抗性筛选标记和组成型p g k 启动子的载体p y x 4 1 8 。利用全转 录工程( g t m e ) 方法对野生型酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e ss c e r e v i s i a e ) g x 7 菌 株进行了改造。 本研究通过p c r 方法克隆获得酿酒酵母转录因子s p t l 5 基因，与表达 载体p y x 4 1 8 连接，构建了重组子p y x 4 1 8 s p t l 5 ，并对s p t l 5 蛋白的1 7 7 、 1 9 5 和2 1 7 位点进行了定点突变( p h e l 7 7 s e r 、t y r 协h i s 和l y s 2 1 8 a r g ) ，然后 醋酸锂转化入酿酒酵母g x 7 中，利用不同浓度的g 4 1 8 抗性筛选得到重组 酿酒酵母菌株g x 7 1 ，经初步研究表明：重组菌株细胞表型发生了变化， 生长速度加快，并可以利用木糖。利用5 0 9 l 的木糖发酵乙醇产量约5 7 9 l ； 木糖醇产量约1 8 5 9 9 l ，残糖1 2 7 。推测该菌株代谢途径发生了重大变化， 可能具备了代谢木糖产生乙醇的能力。本实验为构建新型工业酿酒酵母奠 定了理论基础。 关键词：全局转录工程重组酿酒酵母生物乙醇定点突变转录因子 i 【p r o v e m e n to fn e wt y p es a c c h a r o m y c e s s c e r e v i s i a eu s i n gg t m e a b s t r a c t b e c a u s eo ft h eg r a d u a ld e c r e a s eo ft h en o n r e n e w a b l ee n e r g yr e s o u r c e s ，t h e o v e r w h e l m i n gh i g hp r i c eo fp e t r o l e u m ，a n da l s od u et oa s e r i e so fp r o b l e m ss u c h a se n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o na n dg r e e n h o u s ee f f e c tc a u s e db yb u r n i n gp e t r o l e u m ， c o u n t r i e sa l lo v e rt h ew o r l dp a yg r e a ta t t e n t i o nt ot h eb i o r e f i n e r yi n d u s t r y a sa n e wi n d u s t r y , t h eb i o f u e l si sg r o w i n gu pa r o u n dt h ew o r l d e t h a n o lf u e li s c o n c e i v e da so n eo ft h em o s tp r o m i s i n gg r e e nr e n e w a b l ee n e r g yr e s o u r c e s a n d s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei st h em a i ns t r a i no f t h ep r o d u c t i o no fe t h a n o lf u e l s e v e ns t r a i n sw h i c hh a v eb e t t e rf e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c et og l u c o s ew e r e s e l e c t e dt h r o u g ht h r e el e v e ls c r e e n s ，f r o m16 0s t r a i n so fy e a s t si s o l a t e do u t s u c c e s s f u l l yf r o md i f f e r e n te n v i r o n m e n t sf o rp r o d u c i n gf u e le t h a n o l ，f i r s tt t c l e v e l ，s e c o n d t o l e r a n c eo fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nl e v e l ，a n dt h i r d g l u c o s e f e r m e n t a t i o nl e v e l t h er e s u l t so fm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o nf o rg x1 ，g x 7 ， g x14 0s t r a i n ss h o w e dt h a ta l lt h r e ea r es a c c h a r o m y c e s s a c c h a r o m y c e s s c e r e v i s i a e t h ee x p e r i m e n to fg 418 - r e s i s t a n to fg x 7 s t r a i n ss h o w e dt h a tt h e s t r a i nc a nn o tg r o wa tl0 0 p g m l ，t h ee t h a n o ly i e l do fw h i c hi s11 0 4 b y p r e l i m i n a r yf e r m e n t a t i o ns t u d y s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ep g kp r o m o t e rw a sc l o n e db yp c r ，a n dt h e a c t i v i t yf u n c t i o n a lv e r i f i c a t i o nw a sc a r r i e do u tu s i n gr e p o r t e rg e n e g r e e n 一 一一 f l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ep g kp r o m o t e rh a sa c t i v e f u n c t i o n t h e nv e c t o r - p y x 418w a sc o n s t r u c t e dw i t hg 418r e s i s t a n c es e l e c t i o n m a r k e ra n dt h ec o n s t i t u t i v ep g kp r o m o t e r t h i ss t u d yi st or e f o r mt h ew i l d s a c c h a r o m y c e ss c e r e v i s i a eg x 7b yg l o b a l ( g t m e ) t r a n s c r i p t i o nm a c h i n e r ye n g i n e e r i n g t h ef i r s ts t e pi st og e tt r a n s c r i p t i o nf a c t o rs a c c h a r o m y c e ss c e r e v i s i a es p t l 5 g e n eb y p c r ，a n di n s e r tt h eg e n ew i t he x p r e s s i o nv e c t o r p y x 418 t h e n c o n s t r u c tr e c o m b i n a n tp y x 418 一s p t l 5 ，s i t e - d i r e c t e dm u t a t i o n so ft h r e es i t e s ，a n d c o n v e r ti n t o s a c c h a r o m y c e s s c e r e v i s i a eg x 7b y l i a c ，s e l e c tr e c o m b i n a n t s a c c h a r o m y c e ss c e r e v i s i a es t r a i ng x 7 - 1a c c o r d i n gt od i f f e r e n tg e n e r a t i o no f g 418r e s i s t a n c e t h er e s u l ts h o w e dt h a t ：t h ec e l l p h e n o t y p i co fr e c o m b i n a n t s a c c h a r o m y c e ss c e r e v i s i a e s t r a i nh a v eb e e n c h a n g e d ，t h es p e e do fw h i c h a c c e l e r a t e d ，a n di tc o u l du s ex y l o s e ，p r o d u c ex y l i t o la n de t h a n o lo t h e rc h a n g e s n e e dt ob es t u d y t h ef e r m e n t a t i o n y i e l da r ea b o u t5 7 9 le t h a n o l ，a b o u t18 5 9 9 lx y l i t o la n d12 7 r e s i d u a ls u g a ru s i n g5 0 9 lo fx y l o s e i tc o u l db e c o n c l u d e dt h a tt h em e t a b o l i cp a t h w a yo ft h es t r a i nh a s u n d e r g o n em a j o rc h a n g e s a n dm a yh a v et h ea b i l i t yt op r o d u c ee t h a n o lb ym e t a b o l i z i n g x y l o s e t h i ss t u d y w i l lp r o v i d et h e o r yb a s ef o rr e f o r mn e w i n d u s t r ys a c c h a r o m y c e ss c e r e v i s i a e k e y w o r d s ：g l o b a lt r a n s c r i p t i o nm a c h i n e r ye n g i n e e r i n g ( g t m e ) ； r e c o m b i n a n ts a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；b i o e t h a n o l ；s i t e d i r e c t e dm u t a t i o n s ； t r a n s c r i p t i o nf a c t o r 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除己注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：炙 学位论文使用授权说明 1 年占月多日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 一：裴奶新签名嗤取f 憋口日 广西大学硕士学位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 第一章前言 1 1 发展燃料乙醇的现实意义 1 1 1 乙醇的主要用途和发展前景 乙醇也称酒精，在常温常压状态下是一种无色透明的液体，容易挥发，并且具有特 殊香味的易燃液体，分子式c 2 h 5 0 h ，分子量为4 6 ，用途广泛，主要用在化学工业，食 品行业，医药等领域。燃料乙醇是一种新能源，其优势在于可再生性、绿色环保，现在 一般主要以玉米、木薯、小麦、糖蜜等可再生的生物资源作为原料生产乙醇【1 】。 随着经济社会的快速发展，能源的过度开采和利用，石油等不可再生资源日益减少 和枯竭逐渐明显表现出来，现在我们迫在眉睫的问题是寻找新的能源来满足社会发展的 需求，像燃料乙醇作为能源受到社会的普遍关注【2 j 。人类开始研究和利用可再生能源己 经摸索过相当长的时间，在近几十年中巴西等发达国家对可再生和绿色生态资源一燃料 乙醇的成功利用已经向人类社会表明：人类有能力开发新的能源来解决未来能源的需 求。绿色能源还可以缓解社会的环境问题，为人类生存的空间做出重要贡献【引。燃料乙 醇的生产技术已经比较成熟，乙醇产业作为2 1 世纪的新型产业在全球崛起，为生态能 源产业提供了发展机遇和技术基础。巴西在发展可再生生物能源计划中所取得的巨大成 功，已经得到各国政府不同程度的认同，大大加快了乙醇行业的发展的速度m l 。 燃料乙醇的使用在我国已经开始推广，是在汽油或柴油中加入比例为7 1 0 的无 水乙醇，不仅可以减少石油的消耗数量，提高汽油和柴油的燃烧值，减少尾气中的一氧 化碳、氧化氮化合物和碳氢化合物的排放量，还有利于环境的保护。纯汽油作为燃料时 一般在汽油中添加含氧物一甲基叔丁基醚或醚类，来提高含氧量促使汽油燃烧充分作 为。燃料乙醇不再需要添加含氧物而且在燃烧过程中抗爆性好。当汽油中添加少量比例 的无水乙醇时，不需要对汽车的发动机进行改造；而对汽车的行驶性能无明显影响【2 1 。 有些国家目前已添加更大比例的无水乙醇或经发动机改造后可使用无水乙醇作燃料【6 】。 有研究表明：汽油中添加1 0 的无水乙醇，可以提高辛烷值，还可增加动力性能和清洁 汽车发动机1 7 j 。 仝转量工程方法( g t m e l 改电酿酒酵母的枷步研究 ( 1 ： 2 “艺：黜删8 目调 亘 图11c 0 2 的生态循环 f i g i1 e c o t y p i cc y c l eo f c 0 2 2 国内外乙醇的生产及发展概况 巴西是乙醇生产量最大的国家，已经不使用纯汽油作为汽车燃料，丰要足以甘蔗 为生产原料，也足乙醇出口量最大的国家“】。乙醇生产技术属于世界领先水平，在乙醇 工业上配备台成乙醇乙酯的生产线，当世界石油价格走高时，生产乙醇，在石油价格低 迷时深加工生成乙醇乙酯和其他化工原料。在2 0 0 1 年，无水乙醇产量就高达1 3 0 0 万吨 占石油消耗总量的1 ，4p 】。燃料乙醇及其相关产业提供了接近7 0 万个工作岗位，推动了 巴西的经济和社会的发展；给世界的生态环境带来了许多积极效应；同时也为推动了世 界科技领域的发展”1 。 美国乙醇的生产量仅次于巴西目前年生产量可达1 8 0 0 万吨，主要是以玉米和 小麦为原料生产乙醇，燃料乙醇的使用方法丰要是在汽油中添加1 0 无水乙醇f e i o ) ， 现在有接近3 5 0 万辆汽车使用，燃料乙醇的用途越来越广，推广速度加快。1 9 9 9 年发布 总统令：建立的一个委员会，专职负责研究生物质能源方面的工作，其主要目的是利用 农业和林业的废料物作为原料生产乙醇之类的燃料。因为提高乙醇产量和广泛使用，最 终需要以廉价的可再生的纤维素生物质作为原料，预计到2 0 1 0 年能使农作物和草木在 这方面的利用率将会有很大的提高。 近几f 一年来，我国经济迅速发展，石油年消耗量急剧上升，现在足世界第二太石 油进口国。我国燃料乙醇的生产起步虽晚，但发展速度快，现在已经是世界第三大燃料 乙醇生产国，现在年生产量约2 0 0 万吨。人部分片j 来加入汽油中作为燃料乙醇使用其 e 1 0 使用总量在1 0 0 0 万吨以上，约占全国汽油消费量的1 1 1 口】。在我国主要足以玉米、 广西大掌硕士学位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改昆酿酒酵母的初步研究 木薯和糖蜜生产乙醇。由于现在我国粮食紧缺，不再支持粮食作为原料生产燃料乙醇， 鼓励非粮生物制能，原料的选择遵循“因地制宜，非粮为主 的原则。广西具有大量种 植面积的木薯和甘蔗，给我国乙醇行业带来很好的发展机遇。开发新能源成为社会发展， 推动经济增长的动力，非粮生物生产乙醇作为国家战略部署的新型能源之一，减少我国 能源的危机【5 ，1 0 ，1 1 1 。 欧盟国家生产乙醇量也较大，年产量约1 7 5 万吨，乙醇汽油的使用量大约1 0 0 万 吨。1 9 9 2 年欧共体制定法律，统一石油的消费税，对可再生资源为原料生产燃料的产业， 成员国可采取免税政策，当然也包括燃料乙醇的税收优惠政策。自1 9 9 7 年京都议案 出台以来，日本一直积极采取措施来减少温室气体c 0 2 的排放量。日本政府也准备鼓励 使用燃料乙醇作为汽车燃料的相关政策。同本虽然石油消耗较大，但没有多余的粮食生 产乙醇，只能丌发农、林业秸秆等纤维废物等非粮生物制乙醇，目前主要还是依靠从国 外进口来满足对生物燃料的需求口，5 ，1 1 】。据估算，日本年消耗燃料乙醇的需求约6 0 0 0 吨。 由于现在的原油进口价格比较低廉，日本规大模生产和使用燃料乙醇还在酝酿f 1 2 1 。 1 2 乙醇发酵的菌种及发酵机理 1 2 1 乙醇发酵菌种 理想的乙醇发酵微生物应该具备快速发酵、乙醇耐受高、副产品少、发酵底物广泛、 耐渗透压和耐高温等优良发酵特性。虽然利用酵母发酵生产乙醇也有些缺点，但比其它 已知能生产乙醇的微生物更具有现实意义，现在对运动发酵单孢菌生产乙醇的研究也较 多，运动发酵单孢菌利用葡萄糖生产乙醇的速度比酵母快，乙醇产量可以达到理论值的 9 7 ，而且是厌氧发酵，能忍耐高浓度葡萄糖( 4 0 ) 发酵液，在1 4 ( v v ) 醇浓度中 可以生存f 1 3 】。即使这样，但由于运动发酵单孢菌代谢存在问题，例如用于细胞生长的能 量和副产物等，并不能在乙醇工业上取代酵母的生产地位，还需更多的研究和探索n 4 捌。 酵母菌是单细胞真核微生物，以有机碳主要是葡萄糖等单糖作为碳源和能源。在自 然界中主要分布在含糖较丰富且偏酸性的环境中，是一类重要的工业微生物。酵母菌的 种类很多，大概有6 0 个属5 0 0 多个种n 1 。乙醇工业生产上常用的酵母菌属于真菌门、子 囊菌纲、半子囊菌亚纲、酵母目、酵母科。大多数用于乙醇发酵的酵母菌都属于酵母属 的酿酒酵母、卡尔斯伯酵母及其变种。其它的属如粟酒裂殖酵母、克劳森酒香酵母、树 干毕赤酵母、脆壁克鲁维酵母、热带假丝酵母和管囊酵母等也有应用。大多数工业上常 广西大掌硕士学位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 用的乙醇发酵菌株有k 氏酵母、拉斯2 号、拉斯1 2 号、南阳1 3 0 0 酵母、南阳1 3 0 8 酵 母、古巴i 和古巴i i 等，均属于酿酒酵母。乙醇生产中对酵母菌菌株的生理特性有一定 的要求：( 1 ) 发酵能力强而且快速，有较强的酒化酶；( 2 ) 耐乙醇能力强，可以在较高浓 度的乙醇中发酵；( 3 ) 繁殖速度快，有较强的繁殖能力；( 4 ) 耐高温，能在较高温度下 发酵；( 5 ) 抗杂菌能力强；( 6 ) 耐酸力强；( 7 ) 生产性能稳定，有利于工业连续发酵生产 的要求n 6 1 。 1 2 2 酿酒酵母糖合成乙醇的代谢机理 酿酒酵母是以糖酵解途径( e m p 途径) 生成乙醇，也是是酵母代谢葡萄糖的唯一途径 【1 7 】。葡萄糖是通过e m p 途径转化为丙酮酸，丙酮酸转化为乙醛，由乙醛氧化最终生成 乙醇。由葡萄糖发酵生成乙醇的总反应式为： c 6 h 1 2 0 6 + 2 a d p + 3 h 3 p 0 4 2 c h 3 c h 2 0 h + 2 c 0 2 + 2 a t p 则每l m o l 葡萄糖生成2 m o l 乙醇，理论转化率为：5 1 1 2 4 6 0 5 1 8 0 1 1 0 0 = 5 1 1 其中上式中4 6 0 5 为乙醇的相对分子质量，18 0 1 为葡萄糖的相对分子质量。1 分子 葡萄糖理论上可以生成2 分子乙醇和2 分子二氧化碳。1 8 0 克葡萄糖在理论上可以生成 8 8 克二氧化碳，和9 2 克乙醇，但实际上乙醇生产只有理论值的9 5 ，既l 克葡萄糖在 生产中只能生成0 4 8 5 克乙醇。酿酒酵母不能直接利用淀粉和纤维素等多糖物质，现在 一般以淀粉和纤维素作为原料，原料必须需经过淀粉酶和糖化酶、纤维素酶或酸处理后 转化生成葡萄糖，才能经e m p 途径生成乙醇，现在也是研究很热的课题。细菌的乙醇 发酵主要是经过e d 途径形成乙醇。在酵母菌代谢生成乙醇过程中，研究人员对酵母菌 生成乙醇的代谢途径中相关酶以及酵母菌在乙醇耐受性的机理等问题极为关注n 引。随着 浓醪发酵技术生产乙醇在生产中的广泛应用，浓醪发酵可以提高产品质量和经济效益， 促使更多的研究人员对酵母菌代谢水平的深入研究n 引。 1 3 发酵生产乙醇存在的问题与对策 现在研究人员主要研究方向是开发酵母菌可发酵的廉价的原料( 农业和林业废弃 物) ；筛选和构建耐高浓度乙醇的酵母，进行浓醪发酵。尽管我国的乙醇工业已经取得 了巨大的成就，但技术水平与发达国家相比还有很大的差距。我国的乙醇行业存在的主 要技术问题有： 4 广西大掌硕士掌位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 ( 1 ) 乙醇糟液的污染问题 乙醇产业对环境污染较大，在生产乙醇时排放大量的发酵废液，废水的b o d 和c o d 的指标都很高，会对环境造成严重的污染。近几年d d g s 生产设备在乙醇工厂的使用可 以较好的解决酒糟的污染问题，但由于成本很高，还没有普遍应用。解决的方法：使用 蒸馏废水回用和通过浓醪发酵，减少总蒸发量，通过解决酒糟的污染问题，不仅可以保 护坏境，还可提高乙醇企业的经济效益。【2 0 】。 ( 2 ) 发酵醪中乙醇浓度偏低 尽管经过我国科学技术项目的攻关，乙醇工厂发酵醪中乙醇浓度已经提高到1 0 ， 可是与国外发酵醪乙醇的浓度1 3 以上还有相当大的差距。发酵醪中乙醇浓度偏低，使 得蒸馏能耗的浪费，在d d g s 的回收时处理量也大大增加，导致生产成本高，生产效率 不高。 ( 3 ) 生产乙醇能量消耗高 乙醇生产是高能耗的产业，从自然界筛选高温酵母和构建基因工程菌显得很重要。 原料在蒸煮后必须冷却到3 0 才能接种发酵，高温发酵和浓醪发酵不仅可以减少蒸馏耗 能，减少冷却水的使用还可提高乙醇工厂的生产效率和经济效益。 ( 4 ) 原料使用范围窄并且利用率低 在国外生产乙醇，原料成本一般占燃料乙醇生产成本的4 0 左右，国内一般以玉米、 木薯和甘蔗作为原料生产乙醇。国内原料成本较高，占乙醇生产成本的6 0 7 0 1 2 2 1 。原 料成本过高制约了乙醇作为燃料的普遍使用。我国耕地面积有限，粮食的短缺，国家政 府已经不支持利用粮食来生产乙醇眨】。必须寻找新的非粮物质作为原料，木质纤维素是 地球上最丰富、最廉价的可再生资源。研究表明，全球每年植物体的生成的总量( 纤维 素、半纤维素) 约为8 5 x 1 0 1 0 瞳1 ，如果我们可以开发利用这些资源生产乙醇，将会有大 量乙醇生成，但由于技术问题，需要经过纤维素酶或酸解和爆破技术处理后才能被酵母 利用，工业一直还不能广泛利用。纤维素和半纤维素可作为乙醇发酵的原料。乜3 2 4 l 。 在自然界中木糖的含量仅次于葡萄糖，过去一直被认为微生物不能发酵木糖生成乙 醇，1 9 8 0 年w a n g 等人研究表明一些微生物可以利用木糖发酵，并且酵母菌的木糖发酵 能力很强，可以生成乙醇【2 5 1 。现在具有工业应用潜力的酵母菌有管囊酵母、树干毕赤酵 母和休哈塔假丝酵母【2 6 】。张继泉等1 2 3 1 从自然界筛选获得一株能发酵戊糖的管囊酵母，产 乙醇能力相当于理论产量的6 0 ，耐乙醇能力为1 4 ( v v ) 。王岳五等【2 7 1 人以季也蒙假丝 酵母和酿酒酵母为亲本通过电融合技术得到能利用木糖和纤维二糖产生乙醇的融合子， 广西大掌硕士掌位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 并且能产生一定量的乙醇。 n a n c y t 2 8 1 将树干毕赤酵母的木糖代谢的相关基因转入到酿酒酵母中，构建的工程菌 可以利用木糖发酵生产乙醇。m o n i m z z 锄a n a n 【9 1 构建的酵母工程菌可以高效表达木糖还 原酶、木糖醇脱氢酶，葡萄糖和木糖共发酵可产生5 2 l 的乙醇，理论转化率为8 5 。 通过树干毕赤氏酵母和休哈塔假丝酵母的固定化研究，也获得了满意的结果，有人用葡 萄糖与木糖作为发酵培养基，进行的菌株混合发酵，与单纯菌株发酵相比，乙醇产量都 有所提高n0 剐。 乙醇生产成本较高等多方面的原因导致我国乙醇行业普遍不景气，全国乙醇厂开工 率不足5 0 ，制约了我国乙醇工业的快速发展。 1 4 高产乙醇酵母的选育及研究现状 酿酒酵母发酵性能的优劣是乙醇发酵工业的关键因素。在乙醇发酵工业中，选育发 酵性能的优良菌株可以提高乙醇的发酵效率和乙醇产业的经济效益啪1 。现在人们正在利 用和发明新的科学技术方法，从不同的角度来提高酿酒酵母的发酵性能，已经取得了一 定的成果n 朝。 ( 1 ) 传统育种技术： 育种是工业微生物发展的重要环节。传统的酵母菌育种技术主要是直接从自然界筛 选、化学和物理诱变技术育种等。在工业育种中，这些方法选育出的菌种具有生产稳定 性好、抗菌能力强、菌种适应性强的优点【3 1 1 。工厂中使用的菌株大部分是利用这种方法 选育出的1 6 , 3 1 】。目前的育种目标是选育耐高温；耐高糖；发酵周期短；能直接利用淀粉； 利用纤维素和半纤维素的菌株。王瑞明等吲人从白酒酒窖中分离到一株酿酒酵母，发酵 温度为3 5 - - 3 7 c ，在p h 2 时可正常发酵，在固态基质上发酵乙醇浓度可达到1 2 ( v v ) ， 淀粉利用率可以达到8 9 。王滨等人利用y 3 1 6 酵母菌作为实验出发菌株，经紫外线 诱变，获得乙醇高产菌株，发酵6 0 小时的发酵醪中乙醇体积分数可达1 3 5 。 ( 2 ) 现代育种技术： 经过几十年的科学技术快速发展，酵母菌育种技术从传统的方法发展到现代酵母菌 育种技术。其中主要方法有： 原生质体融合技术 原生质体融合是一种比较随机的基因重组方式，重组的频率高达1 0 一，可以打破种 6 广西大学硕士掌位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 属的界限，实现遗传物质重组【3 4 1 ，也可以和多种育种方法相结合，将多种优良性状组合 到一菌株中【3 5 】。s i p i c z l k i 和f e r e n e 首次实现酵母菌原生质体融合以后，原生质体技术成 为一项重要的育种技术在广泛利用【3 4 】。王滨等刚应用原生质体激光诱变选育出高产乙醇 酵母。通过遗传物质重组，可选育出具有淀粉糖化酶活性的酵母新菌株直接以淀粉为原 料发酵成乙醇，简化乙醇工艺中的设备，节省能源和人力，提高经济效益【2 2 , 3 6 】。国内外 已通过原生质体的方法构建许多同属、同种、不同属或不同种的融合子【2 0 , 3 7 】。庞小燕等 人3 8 】以酿酒酵母和热带假丝酵母为亲本，通过原生质体融合技术，获得了具有糖化酶活 性的高产乙醇的融合菌株，利用5 的淀粉发酵，乙醇产量可达1 1 5 ( v v ) 。 通过基因敲除技术提高乙醇产量 基因敲除技术是利用基因敲除组件提供的同源臂通过同源重组实现对目的基因的 敲除【3 9 1 。同源臂序列一般长为3 0 - - 一，4 5 个碱基，即可满足重组的需求。基因敲除技术在 酵母中的利用也逐渐成熟，科学家对酿酒酵母中将乙醇还原成乙醛的a d h 2 基因进行了 敲除，实验结果表明确实降低了乙醛转化成乙醇的量提高了乙醇的产量；酿酒酵母在乙 醇发酵过程中会有部分碳源合成甘油，有的科学家为了减少酿酒酵母的代谢副产物，阻 断甘油的合成，以改变流方向与碳流量来提高乙醇的产量【4 0 ，4 1 ，4 2 1 。 d n a 重组技术 d n a 重组技术是指把特定的基因和载体连接在一起，然后转化到不同的生物体内， 实现生物遗传特性的转移，使生物遗传性状发生改变的一种技术方法【36 | 。随着d n a 重 组技术的广泛使用，人们已经把多种其他生物的基因引入了酵母菌中，表达和分泌异源 蛋白质【l 们。其中有黑曲霉和根霉等的糖化酶基因重组到酿酒酵母中，构建了能直接发酵 淀粉的基因工程菌【4 3 讲】。 代谢途径的移植。 代谢途径的移植技术是指把特定的代谢途径转移到另一宿主以达到改变代谢途径 的一种科学技术。这一技术也开始在酵母中利用，科学家试图通过改变木糖转化成乙醇 整个代谢途径中的其他环节，从而使木糖代谢过程中细胞内的氧化还原状态维持一个平 衡状态，有效地提高乙醇的产率4 4 4 6 1 。也有科学家建立了毕赤酵母的基因片段文库，将 基因片段转入带有x y l l 和x y l 2 的酿酒酵母中，发现重组菌株可以利用木糖4 7 1 。 7 广西大学硕士学位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 1 5 全转录工程方法( g t m e ) 的研究进展 目前认为，生物体的任何一个表型都是受多个基因影响的，因此要改变生物的某种 表型，单靠改变其代谢途径中的一个或几个相关基因似乎收效甚微。因此科学家丌始将 视线转向细胞的整体表达水平，以期得到理想的细胞表型【2 5 】。全转录工程方法就是其中 一种崭新的改变细胞表型技术【4 9 , 4 9 。 全转录工程方法( g l o b a lt r a n s c r i p t i o nm a c h i n e r ye n g i n e e r i n g ，g t m e ) 是一种改变基 因转录，获得于科技应用有益的细胞表型的一种方法【5 0 1 。s p t l 5 基因是较早就已被研究 且其编码的蛋白已经结晶出来蛋白之一，它是真核生物的全局转录因子，它编码一种的 t a t a 结合蛋白类似于原核生物的。因子的作用，是诸多转录因子中关键的一种【5 1 。5 4 1 。 s p t l 5 蛋白( 图1 2 ) 是一个马鞍型的蛋白，跨在d n a 分子上，识别t a t a 框，以使 r n a 聚合酶i i 识别、结合真核生物的启动子启动转录【5 3 5 5 ，5 6 1 。因此s p t l 5 基因是g t m e 技术首选改造的靶标。此方法最先是2 0 0 6 年由美国麻省理工学院化学工程系g r e g o r y s t e p h a n o p o u l o s 教授领导的研究小组首先通过g t m e 对大肠杆菌的。因子的编码基因 r p o d 改造，改变了细胞表型，提高了细胞对乙醇和s d s 的耐受能力【4 引。随后，该小组 又将此方法应用于酿酒酵母中。他们通过易错p c r 方法构建了s p t l 5 基因的突变体库， 在酿酒酵母的一株单倍体菌株中过量表达了改造过的s p t l 5 蛋白。经过筛选，他们得到 了一株对乙醇和葡萄糖高耐性并且在2 1 h 内发酵生产乙醇比原始菌株高5 0 。 2 0 0 8 年，南京工业大学的欧阳平凯院士领导小组也将此方法应用于酵母菌的表型改 造中。利用g t m e 技术构建了共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母，该菌株能够很好的 利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖生成乙醇1 5 7 1 。 8 仝转景工程方法( g t m e ) 践魁破河醇母的初步研究 t f i i d 一 幽观锎 锵 s a g a 罔1 2 酿酒酵母p n a 聚合酶复合体 f i g l - 2c o m p o n e n t so f t h eg e n e r a lf a c t o rr n a p o li io f s n c “c e m v & i a e 1 6 定点突变技术 16 1 定点突变 定点突变( s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s ) 最大的优势在于它具有很强的可操作性，是一 种在已知d n a 序列中替换、插入或删除特定的核营酸，从而改变蛋白质分子的结构中的 个别氨基酸残基的技术5 ”。以期达到政变蛋白质性质的目的，还能够通过改变特定的氨 基酸来研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明基因的调控机理、疾病的病因和机 理。该技术在生物和医学领域中的应用非常广泛。至今，定点突变作为一种理性设计方 法仍被广泛应用千蛋白质改造中5 州“。 1 6 2 反向p c r 介导的突变法 本实验对日基因的定点突变使用的方法是反商 p c r 介导的突变法，以携带同的基因 的重组质粒为模板，使用高保真度的d n a 聚合酶和突变引物对基因的目的位点进行突 变，其原理如图1 3 所示。在特定的突变位点设计突变引物，以高保真d n a 聚合酶进行 p c r ，p c r 产物用限制性内切酶却h i 消化后转化大肠杆菌。1 0 g o l d 感受态细胞，使质 粒环化形成双链口s l 。 由：f p c r 模版质粒来源于大肠杆菌是经过d 唧甲基化修饰的，而体外台成的p c r 产物( 带突变序列的质粒) 没有被甲基化i 鳓。与使用d 坤i 晦切反向p c r 产物时，由j - d p n i 的消化对甲基化和半甲基化自4 1 d n a 是特异的，山于模板质粒由于时跏 i 敏感而容易被消 州 作 e r 日 h 怍 叫 怍 t 卅 墓 一 ；呈 广西大掌硕士掌位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 化，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，从而获得含有突变序 列的质粒【5 8 , 6 2 , 6 3 】。 s t e p1 m u t a n ts t r a n ds y n t h e s i s p e r r o r mt h e r m a lc y c l i n gt o ： a d e n a t u r ed n at e m p l a t e b ，a n n e a | m u t a g e n i cd r l me r s c o n t a i n i n gd e s t r e dm u t a t i o n c e x t e n da n di n c o r p o r a t e p r i m e r sw i t hp r i m e r s t a rh i g h f i d e l i t yd n ap o l y m e r a s e s t e p 2 d p n id i g e s t i o no ft e m p l a t e d g e s tp a r e n t a lm e t h y l a t e da n d h e m i m e t h y l a t e dd n a w i t hd p nt s t e p3 t r a n s f o r m a t i o n t a n s f o r mm u t a t e dm o l e c u l e i n t oc c i mp e t e n tc e l l sf o rn i c kr e p a i r 图1 3 反向p c r 介导的突变法示意图 f i g 1 3o v e r v i e wo f t h er e v e r s ep c r - d i r e c t e dm u t a g e n e s i sm e t h o d 1 7 立题意义和本课题研究内容 1 7 1 立题意义 目前看来，人们依然倾向于使用石油燃料，因可再生能源燃料和石油燃料的性价比 差别。但从长远发展来说，随着经济步入全球化的发展轨道，再生能源的消耗最终会增 长，从而逐步取代矿物燃料。作为可再生的绿色资源一淀粉、甘蔗、纤维素原料，但因 地域差别，技术设备有限，各自占的比重有所不同。因此应该结合地区的农业特色，开 发可以生产燃料乙醇的原料n 引。 生物质原料生产的乙醇要和其它燃料竞争，不论采用何种底物，其生产工序必须简 单，能耗低、成本低廉。随着基因技术的发展，利用基因工程手段构建和提高直接发酵 淀粉、纤维素的酵母菌在理论上是可行的，并且已获得了一些不同类型的重组菌株，而 细胞表面展示技术在实验室乙醇发酵中的成功运用又给我们了一个方向，这无疑又为乙 醇发酵工业带来新的希望，并具有很重要的意义，但仍有很多问题需要解决，如乙醇耐 l o 簟l ， 孓六 菇。氏、 p il 广西大掌硕士学位论文 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 受力、反馈抑制、基因的稳定性和发酵工艺的完善等口1 9 1 。 本文从一个全新的角度去考虑，致力于突破的实验方法中只改造代谢流中的某种或 某些酶的局限性，即通过改造野生型酿酒酵母的r n a 聚合酶i i 中关键的转录因子 s p t l 5 ，影响其部分转录机制，使蛋白质甚至代谢网络中不同水平的层叠与整合，从而 达到调节糖酵解及乙醇生成中的相关酶的量，希望从中获得具有“人工”特性的代谢途 径，以优化其发酵生产乙醇的性能。通过本实验，希望能为乙醇发酵途径的改造提供一 个全新的视角，为构建科技应用有益的细胞表型奠定理论基础。尚未见有关利用g t m e 改造野生酿酒酵母菌株的报道瞄3 | 。 1 7 2 本课题研究内容 l 本研究从自然界分离筛选发酵性能较好的野生型酿酒酵母菌株作为实验出发菌 种；根据l8 s r d n a 、i t s 和2 6 s r d n a ( d i d 2 ) 对菌株做分子鉴定；对菌株进行初步发酵 性能测试。 2 为了利用g 4 1 8 不同浓度筛选转化子，对实验菌株做g 4 1 8 抗性试验；制备酿酒 酵母单倍体。 3 克隆酿酒酵母p g k 启动子，利用绿色荧光蛋白( g f p ) 作为报告基因进行检测 活性功能。 4 以酿酒酵母表达载体p y e s 2 和毕赤酵母表达载体p p i c 9 k 为骨架，组成型p g k 启动子作为表达启动子，构建在大肠杆菌中抗卡那霉素，在酿酒酵母中抗g 4 1 8 的穿梭 载体p y x 4 1 8 ，可根据不同浓度的g 4 1 8 抗性筛选得到重组酿酒酵母菌株。 5 利用全转录工程( g t m e ) 方法对野生型酿酒酵母菌株进行改造。通过p c r 方法 克隆酿酒酵母转录因子s p t l 5 基因，与表达载体p y x 4 1 8 连接，构建了重组子 p y x 4 1 8 - s p t l 5 ，并对s p t l 5 蛋白的1 7 7 、1 9 5 和2 1 7 位点进行了定点突变，然后醋酸锂 转化入酿酒酵母。 6 利用d e e p v i e w e r 软件分析s p t l 5 蛋白的三维结构。 7 对重组菌株细胞表型变化进行研究。 全转录工程方法( g t m e ) 改良酿酒酵母的初步研究 1 8 技术路线 1 2 全转彗工牲方涪( g 州f ) 改良酿面酵母的却步研究 分了实验技术跚线 “广y 一 匙么。 s p t l d n a 广西大掌硕士学位论文 全转录工程方法( g t l v i e ) 改良酿酒酉姆的初步研究 2 1 实验材料 第二章材料和方法 2 1 1 实验菌株与质粒 野生型酿酒酵母g x 7 菌株s c e r e v i s i a ei n v s c i e c o l id h 5 a e c o l ix l l 0 g o l d 质粒p y e s 2 质粒p p