菲律宾蛤仔凝集素抑菌机制的研究.pdf

第 29 卷第 5 期大连海洋大学学报Vol.29 No. 5 2 0 1 4 年1 0 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYOct . 2 0 1 4 DOI:10.3969/ J. ISSN.2095-1388.2014.05. 016文章编号:2095-1388(2014)05-0508-06 菲律宾蛤仔凝集素抑菌机制的研究 佟长青, 李琦, 曲敏, 金桥, 李伟 (大连海洋大学 食品科学与工程学院 辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室, 辽宁 大连 116023) 摘要:通过分析菲律宾蛤仔 Ruditapes philippinarum 凝集素 (MCL-T) 对细菌的呼吸代谢及细菌中总 DNA、 总 RNA 和可溶性蛋白合成的影响, 以及MCL-T 与金黄色葡萄球菌膜蛋白 (OMP) 的相互作用及其核酸酶 (RNase) 活性, 研究了MCL-T 的抑菌机制。 结果表明: MCL-T 具有抑制金黄色葡萄球菌 Staphylococcus au- reus 和枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 代谢过程中的磷酸戊糖途径 (HMP); MCL-T 与金黄色葡萄球菌或枯草 芽孢杆菌共同培养时, 随着MCL-T 质量浓度的增加, 金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌中的总 DNA、 总 RNA 和可溶性蛋白含量均呈下降趋势; 固相吸附测试表明, MCL-T 可与金黄色葡萄球菌膜蛋白结合, 两 者的结合具有浓度依赖关系, 该结合位点受 N-乙酰-D-半乳糖酰胺 (N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc) 及猪胃黏蛋白 (Mucin from porcine stomach, PSM) 的抑制, MCL-T 具有 RNase 活性。 研究表明, MCL-T 通过抑制细菌的呼吸代谢及细菌中总 DNA、 总 RNA 和可溶性蛋白来发挥抑菌作用, 同时其抑菌活性还与 凝集素的 OMP 结合结构域和 RNase 活性结构域相关。 关键词: 菲律宾蛤仔凝集素; 抑菌机制; 结构域; 膜蛋白; 核酸酶 中图分类号: Q532 文献标志码: A 目前, 已有大量文献报道了海洋贝类凝集素所 具有的抑菌现象, 但对于其抑菌机理的研究尚不完 全清楚。 抑菌剂发挥抑菌作用, 首先需要与细菌细 胞膜结合, 如具有抗菌活性的核酸酶和抗菌肽通过 结合在细菌细胞膜上的脂蛋白受体来发挥抗菌活 性1-2。 凝集素可以与细菌细胞膜上的寡糖链结 合, 但凝集素结合细菌作用与抑制细菌活性不具有 相关性, 如贻贝凝集素 (CGL) 具有凝集和抑制枯 草芽孢杆菌 Bacillus subtilis、 大肠杆菌 E. coli 的作 用, 但 CGL 对金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 却不具有凝集作用, 只具有抑制作用3-4。 凝集素 通过糖结合结构域来实现结合细菌的作用, 但凝集 素的糖结合结构域在其抑菌功能过程中不起决定性 作用, 因此, 可以通过研究凝集素参与发挥抑菌作 用的结构域来获得其抑菌机理。 本研究中, 考察了 菲律宾蛤仔 Ruditapes philippinarum 凝集素 (MCL- T) 对细菌呼吸代谢的影响, MCL-T 与金黄色葡萄 球菌外膜蛋白 (OMP) 的相互作用, 以及MCL-T 具有的核酸酶 (RNase) 活性, 旨在为全面了解凝 集素的抑菌机制提供参考。 1 材料与方法 1. 1 材料 MCL-T 由辽宁省水产品加工及综合利用重点 实验 室 制 备; 革 兰 氏 阳 性 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ATCC25923 和枯草芽孢杆菌 ATCC6633 取自辽宁出 入境检验检疫局; 酵母 RNA、 辣根过氧化物酶 (Horse radish peroxidase, HRP)、 透析袋(8000 - 14000) 购于北京索莱宝科技有限公司; 细菌总 RNA 快速抽提试剂盒、 细菌基因组 DNA 快速抽提 试剂盒、 细菌蛋白抽提试剂盒购于生工生物工程 (上海)股份有限公司; 96 孔 U 型酶标板购于丹麦 NUNC 公司; 其他试剂均为市售国产分析纯。 1. 2 方法 1. 2. 1 MCL-T 对细菌呼吸代谢的影响试验 参照 李伟等5的方法, 用牛肉膏蛋白胨液体培养基活 化枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌后, 用含 0. 15 mol/ L NaCl 的0. 1 mol/ L PBS 溶液 (pH 7. 4) 清洗 3 次, 然后用 PBS 制成 OD600 nm值为 1. 0 的菌悬液。 收稿日期: 2014-01-12 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (31071612); 海洋公益性行业科研专项 (201205022-7) 作者简介: 佟长青 (1976), 男, 博士, 副教授。 E-mail: changqingtong dlou. edu. cn 通信作者: 李伟 (1964), 男, 博士, 教授, 博士生导师。 E-mail: aisingioro dlou. edu. cn 取 15 mL PBS、 1 mL 1% 的葡萄糖溶液、 1 mL 菌悬液置于测量瓶中剧烈搅拌 5 min。 将溶氧测定 仪传感器置于菌悬液中, 密封后开动磁力搅拌器, 每隔 1 min 记录1 次, 记录10 min 内平均溶氧含量 (mg/ L), 计算空白对照的耗氧速率。 在空白溶液中分别加入 100 L 50 mg/ mL Na3PO4, 100 L 50 mg/ mL 丙二酸, 100 L 50 mg/ mL碘乙酸, 100 L 12. 5 mg/ mL MCL-T, 100 L 50 mg/ mL Na3PO4+100 L 12. 5 mg/ mL MCL-T, 100 L 50 mg/ mL 碘乙酸 + 100 L 12. 5 mg/ mL MCL-T, 100 L 50 mg/ mL 丙二酸+100 L 12. 5 mg/ mL MCL-T, 测定存在抑菌剂时菌体耗氧速率。 按照文献 6-7 中的方法, 计算抑制剂对细 菌的呼吸抑制率 IR和典型抑制剂对MCL-T 的呼吸 叠加抑制率 RR。 1. 2. 2 MCL-T 对细菌 DNA、 RNA 和可溶性蛋白 合成的影响试验 将枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球 菌在牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化 30 min 后, 分装于无菌试管中 (3 mL/ 管), 再加入不同质量 浓度的MCL-T 溶液, 36 下以 120 r/ min 在空气 浴恒温振荡器中孵育 6 h。 按照试剂盒说明书提取 DNA、 RNA 和可溶性 蛋白, 并根据二苯胺法、 光度法、 Lowry 等8的方 法分别测量 DNA、 RNA 和可溶性蛋白含量。 1. 2. 3 细菌 NOS 活性的测定 按照 “1. 2. 2” 节 方法, 将菌悬液于 4 下以 9000 r/ min 离心 20 min, 取上清液, 按文献9中方法计算 NO 含量。 1. 2. 4 金黄色葡萄球菌 OMP 的分离 取用 LB 培 养基培养的金黄色葡萄球菌, 用生理盐水洗涤 3 次 后, 在冰水浴中用超声波破碎 (400 W, 间隔时间 3 s, 工作时间 3 s, 总时间 30 min) 后, 按文献 10中的方法提取金黄色葡萄球菌的 OMP 后, 透 析、 冻干。 1. 2. 5 MCL-T-HRP 固相吸附的测试 取 5 mg HRP 溶解于 1 mL ddH2O 中, 加入 0. 2 mL 新配制 的 0. 1 mol/ L NaIO4溶液, 室温下避光搅拌20 min, 4 下在 1 mmol/ L 醋酸钠缓冲溶液 (pH 4. 4) 中 透析过夜; 将透析液中加入 20 L 0. 2 mol/ L 碳酸 盐缓冲溶液 (pH 9. 5) 后, 立即加入 10 mg 溶解 于 1 mL 0. 01 mol/ L 碳酸盐缓冲液的MCL-T, 室温 下避光轻轻搅拌 2 h; 再加入 0. 1 mL 新配的 4. 0 mg/ mL NaBH4溶液, 混匀, 4 下静置 2 h, 4 下在 0. 15 mol/ L PBS 溶液 (pH 7. 4) 中透析过夜, 制得MCL-T-HRP11。 将金黄色葡萄球菌的 OMP 溶于 0. 1 mol/ L 碳 酸盐缓冲溶液 (pH 9. 5) 中, 分别取 100 L 溶液 加入 96 孔板中, 4 下过夜; 用含 0. 15 mol/ L NaCl、 0. 05% Tween 20 的 0. 02 mol/ L PBS 洗液 (pH 7. 2) 洗涤 3 次, 每次间隔 3 min; 洗涤后, 每孔加入 200 L 含有 0. 1% BSA、 0. 15 mol/ L NaCl 的 BSA-PBS, 4 下封闭过夜。 以上述相同 方式用 PBS 洗液洗涤 3 次。 将MCL-T-HRP 溶液稀释 100 倍后, 再进行倍 比稀 释 (1 ： 100、 1 ： 200、 1 ： 400、 1 ： 800、 1 ：1600)。 取各稀释液 100 L 加入到金黄色葡萄 球菌 OMP 包被的 96 孔板中, 4 下过夜; 用 PBS 洗液洗涤 3 次, 加入 100 L 新配制的 4 mg 邻苯二 胺与 10 mL 磷酸-柠檬酸 (pH 5. 0) 的混合液, 以 及 15 L H2O2溶液, 37 下孵育 10 min, 以 2 mol/ L H2SO4终止反应, 于 492 nm 波长下测定吸 光度。 空白对照以 BSA 代替金黄色葡萄球菌的 OMP。 每个试验设 3 个重复。 1. 2. 6 pH 对MCL-T-HRP 结合 OMP 的影响试验 将 OMP 包被 96 孔板, 各孔内分别加入 90 L 0. 05 mol/ L pH 为 5. 0 的 HAc-NaAc、 pH 为 6. 0 的 NaH2PO4- Na2HPO4、 pH 为 7. 0 的 NaH2PO4- Na2HPO4、 pH 为 8. 0 的 Tris-HCl、 pH 为 9. 0 的 Gly-NaOH 溶液, 然后再加入 90 L MCL-T-HRP, 4 下过夜。 其余的洗涤、 显色反应、 吸光度测定 过程同MCL-T-HRP 的制备。 1. 2. 7 GalNAc、 PSM 对MCL-T-HRP 结合 OMP 的 影响试验 将 OMP 包被 96 孔板, 各孔内分别加入 质 量 浓 度 为 3. 25、 1. 63、 0. 81、 0. 41、 0. 20 mg/ mL的 GalNAc 20 L, 再加入稀释10 倍的MCL- T-HRP 20 L, 4 下过夜。 其余的洗涤、 显色反 应、 吸光度测定过程同MCL-T-HRP 的制备。 将 OMP 包被 96 孔板, 各孔内分别加入质量浓 度为 5. 00、 2. 50、 1. 25、 0. 63、 0. 32 mg/ mL 的 PSM 溶液 50 L, 然后再加入稀释 100 倍的MCL- T-HRP 50 L, 4 下过夜。 其余的洗涤、 显色反 应、 吸光度测定过程同MCL-T-HRP 的制备。 1. 2. 8 MCL-T RNase 活性的测定 依次在离心管 中加入 25 L 30 mmol/ L DTT, 40 L 10 mg/ mL 酵 母 RNA, 0、 10、 20、 40、 80、 160 L 凝集素溶 液, 175 L 0. 05 mol/ L NaAC-HAC 缓冲液 (pH 5. 0), 并用 ddH2O 补至700 L, 混匀后置于37 水浴锅中孵育 30 min, 冰水浴中孵育 5 min; 加入 700 L 0. 02 mol/ L La (NO3)3与 0. 2 mol/ L HCl 的 混合溶液, 混匀后于 4 下静置 10 min, 4 下以 1100g 离心 20 min; 取上清液 300 L, 加入 2. 7 905第 5 期 佟长青,等: 菲律宾蛤仔凝集素抑菌机制的研究 mL ddH2O 混匀, 于260 nm 下测定吸光度。 以双蒸 水代替凝集素做空白对照12, 每个试验设 3 个重 复, 观察MCL-T 裂解酵母 RNA 的情况。 凝集素降解酵母 RNA 的活力单位定义为: 在 37 下, 每毫升孵育液中, 30 min 催化降解酵母 RNA 生成 1 mg 产物时所用凝集素的毫克数为 1 个 活力单位 (U)。 依次在离心管中加入 25 L 30 mmol/ L DTT, 25 L 1 mg/ mL 酵母 RNA, 0、 5、 10、 20、 40、 80 L 凝集素溶液, 并用0. 05 mol/ L NaAC-HAC (pH 5. 0) 补足至 700 L, 其余孵育、 吸光度测定过程 同MCL-T 裂解酵母 RNA, 并计算MCL-T 催化降解 酵母 RNA 的米氏常数。 1. 3 数据处理 所有试验数据均以平均值标准差表示, 用 SPSS 13. 0 软件进行单因素方差分析, 用 Duncan 法 进行多重比较, 显著性水平设为 0. 05。 2 结果与讨论 2. 1 MCL-T 对细菌呼吸代谢的影响 丙二酸、 碘乙酸和磷酸钠分别抑制细菌呼吸代 谢过程中三羧酸循环途径 (TCA)、 糖酵解途径 (EMP) 和磷酸戊糖途径 (HMP)。 当两种抑制剂 共存时, 若两种抑制剂具有不同的呼吸代谢抑制途 径时, 这种共存可协同增加抑制效应, 而当两种抑 制剂具有相同的呼吸代谢抑制途径时, 这种协同效 应降低。 因此, 通过观察每种抑制剂对细菌的呼吸 抑制率以及组合抑制剂的呼吸抑制率, 可以得出未 知抑制剂对细菌的呼吸代谢抑制途径7。 MCL-T 对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌表 现出较高的抑菌活性5。 从表 1 可见: MCL-T 对 两种细菌均具有呼吸抑制作用, 其中MCL-T 对金 黄色葡萄球菌的呼吸代谢抑制率为 40. 63%, 对枯 草芽孢杆菌呼吸代谢抑制率为 19. 23%; 当MCL-T 分别与丙二酸、 碘乙酸和磷酸钠 3 种典型抑制剂组 合形成组合抑制剂后, 磷酸钠对MCL-T 的叠加抑 制率最小, 分别为 24. 21% 和 26. 67%, 这表明 MCL-T 抑制这两种菌糖氧化代谢途径中的 HMP。 2. 2 MCL-T 对细菌总 DNA、 总 RNA 和可溶性 蛋白合成的影响 从图 1-A 可见, 随着MCL-T 质量浓度的增 加, 枯草芽孢杆菌的总 DNA 含量呈现下降趋势, 表 1 MCL-T 对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌呼吸代谢 的影响 Tab. 1 Effect of MCL- T on respiratory metabolism of bacteria Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis 抑制剂 inhibitor 金黄色葡萄球菌 S. aureus 抑制率 IR/ % 叠加抑制率 RR/ % 枯草芽孢杆菌 B. subtilis 抑制率 IR/ % 叠加抑制率 RR/ % 蛤仔凝集素MCL-T 40. 6319. 23 丙二酸 Malonic acid 62. 5073. 6862. 3137. 50 碘乙酸 Iodoacetic acid64. 2934. 5059. 6238. 10 磷酸钠 Sodium phosphate60. 7124. 2122. 6026. 67 金黄色葡萄球菌的总 DNA 含量呈极缓慢下降趋势。 多重 比 较 结 果 表 明: MCL- T 质 量 浓 度 为 160 g/ mL时, 金黄色葡萄球菌的总 DNA 含量与空白 组有显著性差异 (P0. 05); MCL-T 质量浓 度为 10 g/ mL以上时, 枯草芽孢杆菌的总 DNA 含 量与空白组均有显著性差异 (P0. 05)。 从图 1 -B 可见: MCL-T 质量浓度为 0 20 g/ mL时, 随着MCL-T 质量浓度的增加, 金黄色 葡萄球菌总 RNA 含量呈快速下降趋势, 随着MCL- T 质量浓度的继续增加, 其总 RNA 含量下降速度 较慢; MCL-T 质量浓度为 0 20 g/ mL时, 随着 MCL-T 质量浓度的增加, 枯草芽孢杆菌总 RNA 含 量呈快速下降趋势, 随着MCL-T 质量浓度的继续 增加, 其总 RNA 含量变化不明显。 多重比较结果 表明, MCL-T 质量浓度为 10 g/ mL以上时, 金黄 色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌的总 RNA 含量与空白 组均有显著性差异 (P0. 05)。 从图 1 -C 可见: MCL-T 质量浓度为 0 40 g/ mL时, 随着MCL-T 质量浓度的增加, 金黄色 葡萄球菌中的可溶性蛋白含量呈快速下降趋势, 随 着MCL-T 质量浓度的继续增加, 其可溶性蛋白含 量下降趋势变缓; 而MCL-T 质量浓度为 0 40 g/ mL时, 随着MCL-T 质量浓度的增加, 枯草芽 孢杆菌中的可溶性蛋白含量下降较快, 当MCL-T 质量浓度为 40 g/ mL以上时, 其可溶性蛋白含量 下降减缓。 多重比较结果表明, MCL-T 质量浓度 为 20 g/ mL以上时, 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢 杆菌的可溶性蛋白含量与空白组均有显著性差异 (P0. 05)。 本研究表明, MCL-T 抑制了金黄色葡 萄球菌及枯草芽孢杆菌中总 DNA、 总 RNA 和可溶 性蛋白的合成。 2. 3 MCL-T 对细菌 NOS 的影响 细菌生长代谢过程中, 外界环境中的各种因素 015大连海洋大学学报 第 29 卷 注: 同一质量浓度下, 标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 (P 0. 05), 下同 Note: at same concentration, the means with different letters are significant differences at the 0. 05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia 图 1 MCL-T 对细菌总 DNA、 总 RNA 和可溶性蛋白含量的影响 Fig. 1 Effect of MCL-T on total DNA, total RNA and protein levels in the bacteria 对其产生刺激, 使得细菌产生相应的各类应激信 号。 其中一氧化氮 (NO) 是生物体一氧化氮合酶 催化产生的具有抵抗氧应激反应的物质。 NO 产生 量的多少, 在一定程度上反映氧应激的强度。 采用 Griess 试剂测定液体培养基中亚硝酸盐的含量, 可 以计算出 NO 产生的量13。 从图 2 可 见: MCL- T 质 量 浓 度 为 0 20 g/ mL时, 金黄色葡萄球菌菌悬液上清液中 NO 含 量呈上升趋势, 随着MCL-T 质量浓度的继续增加, NO 含量开始快速下降; 当MCL-T 存在时, 枯草芽 孢杆菌菌悬液上清液中 NO 含量均增加, 当MCL-T 质量浓度为 0 160 g/ mL时, NO 含量呈现急剧上 升后缓慢下降的趋势。 多重比较结果表明: MCL- T 在质量浓度为 20、 40 g/ mL时, 金黄色葡萄球 菌的 NO 产生量与空白组均有显著性差异 (P 0. 05); MCL-T 质量浓度为 10 g/ mL以上时, 枯 草芽孢杆菌 NO 产生量与空白组有显著性差异 (P0. 05)。 图 2 12 h 内MCL-T 对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆 菌 NO 产生量的影响 Fig. 2 Effects of concentrations of MCL-T on produc- tion of NO in cultivation medium of S. aureus and B. subtilis in 12 h 2. 4 MCL-T 与金黄色葡萄球菌 OMP 的相互作 用 将提取分离获得的金黄色葡萄球菌的 OMP 与 新制备的不同浓度的MCL-T-HRP 在 96 孔酶联免 疫吸附板上进行结合测试, 结果见图 3-A。 从图 3-A 可见, MCL-T 与 OMP 可以结合, 而且随着 MCL-T 质量浓度的增加, 与 OMP 结合的量也增 加, 且在MCL-T 质量浓度为 0. 25 2. 00 mg/ mL 时, OMP 与MCL-T 的结合具有含量依赖关系。 从图3-B 可见, 随着 PSM 含量的增加, MCL- T 结合金黄色葡萄球菌 OMP 的量显著下降。 这表 明, MCL-T 与 OMP 的结合受到 PSM 的抑制。 PSM 上的糖链与其核心蛋白之间是通过蛋白上 Ser 或 Thr 侧链上的羟基与 GalNAc 上的羟基通过 O-糖苷 键连接14。 PSM 含有 12 个由 1 5 个糖残基组成 的糖链, 其核心为 Gal 1-3 GalNAc -O-Ser/ Thr, 该核心结构是 PSM 执行其功能的重要部分15。 从图 3-C 可见, 随着 GalNAc 质量浓度的增 加, MCL-T 结合金黄色葡萄球菌 OMP 的量逐渐下 降。 这表明, MCL-T 与 OMP 的结合受到 GalNAc 的抑制。 从图 3-D 可见, 当 pH 值从 5 增加到 6 时, MCL-T 结合金黄色葡萄球菌 OMP 的量增加, 而随 着 pH 值的进一步增加, MCL-T 结合金黄色葡萄球 菌 OMP 的能力逐渐下降。 这表明, MCL-T 与 OMP 的结合受到 pH 值的影响, 且在 pH 为 6 时两者结 合最多。 Odintsova 等16研究凝集素 DTL 时发现, 该凝 集素不仅具有糖结合位点, 还具有胶原蛋白结合位 点, 胶原蛋白结合位点对于 DTL 黏附 HeLa 细胞活 性非常重要。 对 于 MCL- T 与 OMP 的 结 合 来 说, 115第 5 期 佟长青,等: 菲律宾蛤仔凝集素抑菌机制的研究 图 3 MCL-T 结合金黄色葡萄球菌外膜蛋白的影响因素 Fig. 3 Factors influencing MCL-T binding to out membrahe proteins (OMP) of S. aureus MCL-T 上的 OMP 结合位点受到 PSM 及 GalNAc 的 抑制。 一般来说, 凝集素上的糖结合位点具有专一 性, 因此, OMP 结合位点与糖结合位点分别存在 于凝集素上两个不同的结构域中。 本研究中, OMP 结合位点受到糖配体结合凝集素的干扰, 表明凝集 素分子不是刚性分子; 而凝集素与糖配体的结合导 致了其构象变化, 其与 OMP 的结合结构域亦发生 了改变, 以致其与 OMP 结合减少。 这表明, MCL- T 分子不是刚性分子, 凝集素与糖配体的结合导致 了其构象的变化, 其功能结构域也发生了改变。 2. 5 MCL-T 的 RNase 活性 在生物体内, mRNA、 tRNA、 rRNA 等协同作 用实现蛋白质的合成。 RNA 经降解形成寡核苷酸 后, 就丧失了其生物功能, 生物体内蛋白质代谢就 会发生混乱, 从而导致生物体死亡。 因此, 自然界 中存在大量起着抑菌作用的 RNase。 Lin 等17研究 指出, 人核酸酶 7 (hRNase 7) 具有对铜绿假单胞 菌 Pseudomonas aeruginosa 的抑菌活性。 本研究中, 在 37 下用MCL-T 进行降解酵母 RNA 试验, 结果表明, MCL-T 降解酵母 RNA 30 min, 生成 1 mg 寡核苷酸需凝集素 127. 15 mg (图 4)。 通过作 Lineweaver-Burk 图获得了MCL-T 酶解 酵母 RNA 的米氏常数 Km(37. 23) 及降解酵母 RNA 的速率 vmax(0. 52 g/ min)。 这表明, MCL-T 具有 RNase 活性, 而MCL-T 所具有的 RNase 活性 是否与其抑菌活性相关, 需进一步研究。 图 4 MCL-T 降解酵母 RNA 的 Lineweaver-Burk 图 Fig. 4 Lineweaver-Burk of RNA in MCL-T-degrad- i