（分析化学专业论文）微流控毛细管电泳分离蛋白质的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘鲎 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位敝储虢视签锢期：w 年月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权迸婆盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 脚 签字隰少份月( 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 三三著三：垒塑月了日 签字日期：抄厂年g 月、日 电话： 邮编： 浙江大学硕十学位论文 摘要 在芯片上进行蛋白质的毛细管电泳分离可以显著地提高分析速度和分离效 率，并对分析仪器的集成化、微型化与便携化的发展具有重要意义。本工作采用 激光诱导荧光检测的方法，对蛋白质在微流控玻璃芯片及短毛细管上的微流控毛 细管电泳分离系统进行研究，并成功实现了蛋白质的快速分离。 第一章介绍了微流控芯片毛细管电泳分离蛋白质的研究进展，对芯片毛细管 电泳分离蛋白质的各种分离模式进行了综述，并介绍了不同分离模式下抑制通道 内壁对蛋白质大分子吸附的各种方法。 第二章，在课题组与上海光谱公司合作研制的生化分析仪上进行了蛋白质分 离的研究。分离了c y 5 标记的0 【一胰凝乳蛋白酶原a 及其杂质蛋白，并对抑制蛋 白质吸附的玻璃芯片涂层进行了研究。该分离系统以激光诱导荧光( l i f ) 系统 作为检测器，并以夹流进样的进样模式及优化的分离条件，于2 2 5s 内实现了样 品的分离。 第三章介绍了一种基于短毛细管的毛细管凝胶电泳蛋白质分离系统。系统采 用激光诱导荧光检测系统和缺口型试样管阵列试样引入技术，实现了自动化、高 速的的毛细管凝胶电泳分离蛋白质。该系统应用于蛋白质样品的快速分离，具有 操作自动化、分离速度快、重现性好等优点。 关键词：微流控芯片；毛细管电泳；蛋白质分离；激光诱导荧光检测 a bs t r a c t i nt h i sw o r k ，g l a s sc h i p b a s e da n ds h o r tc a p i l l a r y b a s e dm i c r o f l u i d i cc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss y s t e m sw i t hl a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a sd e v e l o p e d t h e a b i l i t yt os e p a r a t ef l u o r e s c e i nd y e sl a b e l e dp r o t e i nw a ss h o w n i nt h ef i r s tc h a p t e r , t h ed e v e l o p m e n t so ft h ec h i p b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s f o rp r o t e i ns e p a r a t i o ni nr e c e n ty e a r sa r es u m m a r i z e d v a r i o u sc h i p b a s e dc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss y s t e m s f o r p r o t e i ns e p a r a t i o n b a s e do nd i f f e r e n t c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o nm o d e sa r ei n t r o d u c e d f u r t h e r m o r e ，t h ea p p r o a c h e st o s u p p r e s st h ea d s o r p t i o no fp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fm i c r o c h a n n e lo nc h i p sa r e d i s c u s s e d i nt h es e c o n d c h a p t e r , t h ep r o t e i ns e p a r a t i o n o n c h i p b a s e dc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s w a sp e r f o r m e d u s i n g al a b m a d e b i o a n a l y z e r c y 5 l a b e l e d a - c h y m o t r y p s i n o g e na a n do t h e rp r o t e i n sa r es e p a r a t e d v a r i o u sm e t h o d st os u p p r e s s t h ea d s o r p t i o no fp r o t e i n so nt h es u r f a c eo fm i c r o c h a n n e lo ng l a s sc h i p sw a ss t u d i e d t h el i fd e t e c t i o na n dt h ep i n c h e di n j e c t i o nm o d ea r ee m p l o y e df o rs a m p l ed e t e c t i o n a n di n t r o d u c t i o nr e s p e c t i v e l y u n d e rt h em o d i f i e dc o n d i t i o n s ，s a m p l ec o u l db e s e p a r a t e di n2 2 5 s i nt h et h i r dc h a p t e r , af a s tc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss y s t e mf o rp r o t e i ns e p a r a t i o n w a sd e v e l o p e db a s e do nas h o r tc a p i l l a r y t h el i fd e t e c t i o na n ds l o t t e d v i a la r r a y s a m p l ei n t r o d u c t i o ns y s t e mw a su s e d t h ep r o t e i ns a m p l ew a ss e p a r a t e du s i n gt h i s s y s t e mw h i c hh a st h ea d v a n t a g e so fa u t o m a t e do p e r a t i o n ，f a s ts e p a r a t i o na n dg o o d r e p e a t a b i l i t y k e y w o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；p r o t e i n s e p a r a t i o n ； l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n 2 浙江大学硕士学位论文 1 1 前言 第一章绪论 2 0 世纪9 0 年代初m a n z 和w i d m e r 首次提出了以微机电加工技术 ( m i c r o e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 和分析化学为基础的微全分析系统 ( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，p t a s ) 的概念【l j 。19 9 2 年m a n z 等 2 1 首次 报道了基于微流控芯片的高效高速毛细管电泳分离系统，展示了其巨大的发展潜 力。微流控芯片毛细管电泳技术将常规的毛细管电泳操作在芯片上进行，利用玻 璃、石英或各种聚合物材料加工微米级微通道，以高压直流电场为驱动力，对样 品进行进样、分离和检测。 近年来该技术发展迅速，在蛋白质、d n a 等生物大分子的分离分析中表现 出了显著的优越性。当前，随着蛋白组研究的深入和发展，如何实现蛋白质快速 高效的分离成为需要解决的重要问题。在芯片上进行蛋白质的毛细管电泳分离可 以显著地提高分析速度和分离效率，因此，这一研究方向引起了广泛关注，已有 较多论文发表。微流控芯片毛细管电泳系统应在蛋白质的分离分析方面所具有的 突出优越性，使其在临床检验及现场监测等方面的应用具有良好的发展前景，同 时，其对分析仪器的集成化、微型化与便携化的发展也具有重要意义。 微流控芯片毛细管电泳应用于蛋白质分离分析存在的重要问题是芯片通道 内壁对蛋白质大分子的吸附作用。蛋白质与芯片通道内壁之间的微小吸附效应就 会降低蛋白质的分离效率，引起峰形变宽拖尾，影响分离的重现性。目前已经有 很多研究者正致力于这一问题的解决中。 以下将对采用微流控芯片毛细管电泳进行蛋白质分离的分离模式、特点及其 蛋白吸附问题进行介绍。 1 2 微流控芯片毛细管电泳蛋白质分离模式 微流控芯片毛细管电泳与常规毛细管电泳的分离原理相同，因此在分离生物 大分子样品方面具有优势。此外，与常规毛细管系统相比，芯片毛细管电泳系统 3 浙江大学硕士学位论文 还具备以下优点：分离时间短、分离效率高、系统体积小且易实现不同操作单元 的集成【3 羽。芯片毛细管电泳上述优点使其成为蛋白质分离分析中的重要手段之 一o r o d r i g u e z 等【7 】曾分别在常规毛细管、短毛细管和玻璃芯片上，以区带电泳的 分离模式，对人免疫球蛋白g ( i g g ) 和荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) 的反应混合 物进行分离，以比较三种系统的分离性能。使用有效分离长度为3 5c m 的长毛细 管和有效分离长度为6c m 的短毛细管时，其分离时间分别为3 3 5s 和8 4s ，理论塔 板数分别为2 7 7 5 0 和4 1 8 1 6 。当使用有效分离长度仅为2 8c m 的玻璃芯片时，分离 时间缩短至1 6sn 理论塔板数达至u 4 9 0 0 0 。使用玻璃芯片进行毛细管区带电泳在 分离速度和柱效上明显优于常规毛细管电泳系统。 目前，文献报道的芯片毛细管电泳蛋白质分离系统，主要采用区带电泳、凝 胶电泳、等电聚焦、胶束电动色谱及二维电泳模式等分离模式。 1 2 1 芯片毛细管区带电泳 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 是芯片毛细管电泳蛋 白质分离中最基本的一种分离模式。它是基于不同的蛋白质分子在电场中的迁移 速率不同而实现分离的，是一种简单，快速的分离方法，采用区带电泳的分离模 式已成功分离多种蛋白质样品。 c o l y e r 等【8 】采用毛细管电泳芯片，以区带电泳模式对人血清蛋白样品进行了 分离，可分辨出四个蛋白质区带( 即i g g 、转铁蛋白、a 1 一胰蛋白酶抗体和白蛋 白区带，分别用以模拟血清蛋白样品中的np 、伍l 和白蛋白区带) 。其中蛋白质 的荧光标记在分离之后进行，由于荧光染料t n s ( 2 - t o l u i d i n o n a p h t h a l e n e 6 s u l f o n a t e ) 标记血清蛋白的灵敏度较低，所以没能实现实际人血清蛋白样品的五 区带分离。芯片构型设计如图1 所示，通道深度为1 4p m ，细通道宽6 6p m ，粗 通道宽2 4 0l a m ，分离通道长度约为4 9 “m 。 4 浙江大学硕士学位论文 图1蛋白质分离芯片通道构型示意图 x i a o 等f 9 1 采用区带电泳模式，以5 0m m 的磷酸盐缓冲液( p h2 1 5 ) 作为工 作缓冲液，在通道宽度为3 0l a m 、深度为1 0p , m 的聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 芯 片中，于3 5s 内实现了细胞色素c 和溶菌酶的快速分离，分离电压4 0 0 0v ，分 离长度3 5c m 。芯片结构如图2 所示。 图2 芯片通道构犁示意图 d o d g e 等【l o 】设计了集成多个微阀和微泵的p d m s 芯片( 如图3 ) ，通过微阀 5 浙江大学硕士学位论文 微泵实现了对液流的有效控制。首先采用区带电泳的分离模式分离牛血清白蛋白 和肌红蛋白，然后通过阀的作用将分离后的蛋白质组分分别引入微混合器中酶 解，最后对产物进行质谱分析。该工作显示芯片技术可用于质谱分析前复杂蛋白 样品的预处理。 v a l v e lw a s t e s e p a r a t i o n 图3 集成有微泵微阀的蛋白质分离和酶解芯片通道构型示意图 庄贵生等1 1 1 】在石英芯片上以p h1o 3 ，7 5m m 的硼酸盐缓冲液作为芯片电泳 缓冲体系，分离了免疫球蛋白、仅1 抗胰蛋白酶、牛血清白蛋白和铁传递蛋白， 并对经临床确诊的妊娠高血压症、风湿性心脏病、多发性骨髓瘤患者的尿液样品 进行电泳分析，在2m i n 内得到了与美国h e l e n a 电泳系统一致的分析结果，其 对四种标准蛋白混合样品的电泳分离图谱如图4 所示。 6 浙江大学硕士学位论文 图4四个标准蛋白混合样本电泳图谱 ( 1 ) 免疫球蛋白( 2 ) 铁传递蛋白( 3 ) a 1 抗胰蛋白酶( 4 ) 牛血清白蛋白 对于芯片毛细管区带电泳分离蛋白质研究，通道表面对大分子蛋白质的吸附 是所要解决的一个重要问题。在毛细管区带电泳的分离模式下，一般采用通道内 壁永久改性和缓冲液中加入添加剂进行动态修饰两种方法来抑制蛋白质的吸附。 w u 等【1 2 】采用多层8 8 水解聚丙烯醇( p v a ) 修饰p d m s 芯片，以区带电泳的 模式有效分离了两种碱性蛋白质溶菌酶和核糖核酸酶( 图5 ) ，以及两种典型的酸 性蛋白质牛血清白蛋白和p 乳球蛋白。该涂层在p h3 1 1 范围内均可抑制电渗流 的产生和蛋白的吸附作用，并且效果稳定，连续运行7 0 次后分离效果仍然很好。 该研究组【1 3 ，1 4 】随后又采用自组装方法在p d m s 芯片通道表面加工环氧修饰的聚 合物涂层，来抑制蛋白质的吸附作用，成功分离溶菌酶和核糖核酸酶a 。 7 浙江大学硕上学位论文 0 s1 0 52 0筠筠4 0 s ) 图5 溶菌酶( 1 ) 和核糖核酸酶( 2 ) 在不同处理的p d m s 芯片上的电泳图 ( a ) 末处理芯片；( b ) 0 2 等离子处理芯片；( c ) 0 2 等离子处理、1 0 0 水解聚乙烯醇修饰芯片； x i a o 等【9 1 对p d m s 芯片通道内表面进行聚丙烯酰胺表面处理，减少了通道 表面对蛋白的吸附，从而实现细胞色素c 和溶菌酶的快速分离，分离谱图如图6 所示。 c h i e m 等在运行缓冲液中加入了无机电解质n a c l 和中性表面活性剂吐温 2 0 来抑制蛋白的吸附，利用芯片毛细管区带电泳进行了单克隆抗体的分离分析， 图7 为电泳分离谱图。 8 孙勰勰舸弱筋孔嚣舷黝笱 岁一窭蕃袋西-onli 图6 蛋白质在聚丙烯酰胺处理过的p d m s 芯片上的电泳分离图 02 04 ( 6 08 0 t i m e ( s 图7f i t c 标记的人免疫球蛋白和牛血清白蛋白的电泳分离图 9 ，0v夤基霜粤口墨 浙江大学硕士学位论文 1 2 2 芯片毛细管凝胶电泳 在蛋白组学和蛋白分离的研究中，凝胶电泳是广泛使用的分离技术。它是以 凝胶等聚合物作为分离介质，利用其网络结构并依据被测组分的分子体积不同而 进行分离的一种分离模式。在芯片上采用毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 模式分离蛋白质，蛋白谱峰尖锐，柱效提高，更有利于实 现分离操作的高速度和高效率。y a o 等f 1 6 】采用s d s 凝胶电泳分离模式，对比了 芯片上的s d s 毛细管凝胶电泳与常规毛细管凝胶电泳系统分离蛋白质的性能， 前者的分离效率和分离时间明显优于后者。 与常规毛细管凝胶电泳相同，芯片毛细管凝胶电泳常用的筛分介质也分为凝 胶和非胶聚合物溶液两种。交联聚丙烯酰胺凝胶是广泛使用的一种凝胶筛分介 质，h e r r 等【1 7 】首次将传统的s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 分离蛋白质的 方法移植到芯片上，使用光聚合的方法在芯片通道内制备浓度为6 的交联聚丙 烯酰胺凝胶作为筛分介质( 如图8 所示) ，在3 0s 的时间内对分子量在6 5 3 9k d a 之间的五种蛋白质进行分离，分离距离仅为4m i l l ，分离理论塔板数达到4 4 1 x 1 0 5 。 限，舅 b 一 l 象 ， 一；卜 f e 夸 嘲 4 ； 8 ，o ，2 弘? 嗡l 。一奄 ：； s w i i3 21 獭，j 窭糍嗍嘞一： t r i m w f $ 掬坼 图8 光聚合于芯片通道内制备交联聚丙烯酰胺筛分介质的方法示意图 ( a ) 芯片通道；( b ) 通道内充满丙烯酰胺单体；( c ) 不聚合部分用掩膜遮盖，紫外光源照射 使单体聚合；( d ) 无掩模处形成聚丙烯酰胺；( e ) 蛋白质迁移分离 l o ! 兰! ! ! ：竺! 凑警一 、7 土一￥ 图9 具有试样预浓集和s d s - p a g e 分离功能的蛋白质分析芯片 a g i r r e g a b i r i a 等 1 9 1 在聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 芯片上使用s u 一8 光胶制 作微通道，采用浓度为1 2 的聚丙烯酰胺凝胶作为筛分介质分离蛋白，分离场强 3 4 3v m 。随后，该研究组删又在该芯片上集成金属电极，采用相同的分离模式 成功分离了分子量分别为2 0k d a 和9 7 k d a 的胰蛋白酶抑制剂和磷酸化酶两种蛋 白质。芯片示意图和分离蛋白谱图见图1 0 。 l 8 l c er ，u 口m ( a ) 浙江大学硕士学位论文 ( b ) 图l o ( a ) 集成金属电极的p m m a 微流控芯片 ( b ) 胰蛋白酶抑制剂( 1 ) 和磷酸化酶( 2 ) 两种蛋白质的分离谱图 然而，交联聚丙烯酰胺凝胶存在制备复杂，不易使用，使用寿命短等问题。 与其相比，线性聚丙烯酰胺( p l a ) 、聚乙烯醇( p e g ) 、聚氧化乙烯( p e o ) 、 甲基纤维素( m c ) 、葡聚糖( d e x t r a n ) 等非胶筛分介质具有制备简单，使用方 便，可以先聚合后注入通道而无需在通道内进行聚合反应等优点，适合在复杂的 通道体系中使用。因此，在芯片毛细管凝胶电泳中非胶筛分介质得到了广泛的应 用。 y a o 等【1 6 】采用s d s1 4 2 0 0 凝胶缓冲液( b e c k m a nc o u l t e r 公司产品) 比较了 使用毛细管的s d s 凝胶电泳和使用芯片的s d s 凝胶电泳效果。使用芯片大大缩 短了分离时间，通过对分离电压等条件进行优化( 见图1 1 ) ，在4 5c m 的分离长 度中于3 5s 内分离了分子量在9 1 1 6k d a 之间的六种蛋白质。 1 2 浙江大学硕士学位论文 坌 兰 2 呈 。 罂 8 篓 宝 芷 图1 l不同分离电压下芯片凝胶电泳分离六种蛋白质的图谱 ( 1 ) 钙调蛋白( 2 ) 0 t 乳白蛋白( 3 ) 胃蛋白酶原( 4 ) 卵清蛋白( 5 ) 牛血清白蛋白 ( 6 ) 1 3 - 半乳糖营酶 g i o r d a n o 等 2 1 l 将n a n o o r a n g e 染料加入样品和缓冲液中进行蛋白质的动态标 记，研究了利于动态标记蛋白质的缓冲液体系，包括筛分凝胶、离子强度和s d s 浓度的选择。该系统最终选择5 的p e o ( 1 0 0k d a ) 作为筛分介质，对牛血清白 蛋白的检出限为5 0 0n g m l ，并完成了对实际人血清样品的分离分析。 在芯片毛细管凝胶电泳中，通道内壁对蛋白质的吸附仍是所要解决的重要问 题。b o u s s e 等【2 2 】将蛋白质的分离、染色、脱色以及检测过程整合在一起，开发 了一个微型分析系统( 芯片结构如图1 2 ) 。使用聚二甲基丙烯酰胺( p d m a ) 物 理涂覆玻璃芯片微通道内壁，将电渗流降低到o 5 x 1 0 母m 2 v 。s 一，以s d s 凝胶电泳 的分离模式在4 0s 内分离了b i o r a d 公司蛋白标准样品，分离效率达到l o7 塔板 数米。图1 3 为分离结果记录图。 浙江大学硕士学位论文 图1 2 集分离、染色、脱色以及检测过程于一体的芯片结构示意图 图1 3b i o r a d 公司蛋白标准样品电泳分离图谱 n a g a t a 等【2 3 】在p m m a 芯片中使用了聚乙二醇( p e g ) 涂层，筛分介质为5 的线性聚丙烯酰胺，在分离长度为3m m 的通道内实现了胰蛋白酶抑制剂、牛血 清白蛋白和1 3 - 半乳糖苷酶三种蛋白质的高速分离，分离时间仅为8 s 。 1 4 浙江大学硕士学位论文 1 2 3 芯片等电聚焦分离 芯片等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 分离蛋白质的原理与常 规毛细管等电聚焦基本相同，都是依据蛋白质的等电点( p i ) 不同而进行分离。 h o f m a n n 等【2 4 j 首次将毛细管等电聚焦技术移植于玻璃芯片，应用于蛋白质 分析。l i 等【2 5 】在p d m s 芯片和聚碳酸酯( p c ) 芯片上进行毛细管等电聚焦分离， 分离通道宽1 0 0p m ，深4 0p m ，长1 2c n l ，阳极电解液和阴极电解液分别采用 1 0m m 磷酸( p h2 8 ) 和0 5 氨水( p h1 0 5 ) ，蛋白质样品( 2 5n g l a lb s a 和 1 0n g p l 增强型绿色荧光蛋白( e g f p ) ) 和2 的p h a r m a l y t e3 1 0 溶液充满通 道，在5 0 0v c m 的分离场强下，分离b s a 和e g f p 。分离效果如图1 4 所示。 a 瑚 瑚 o 姗瑚蛳蜘蛳瑚阳鼬 e g f p 瑚姗3 鲫锄4 弼湘脚啦圈 p 毗 图1 4p d m s 芯片( a ) 和p c 芯片( b ) 上的e g f p 和b s a 等电聚焦分离 d a s 等【2 6 1 采用高聚物芯片，在等电聚焦电泳模式下优化了分离长度及电压条 1 5 跚鲫枷瑚鼢渤鲫粕搬0 浙江大学硕士学位论文 件，最终采用长1 9c m 的通道，在1 5m i n 内分离了绿荧光蛋白和r 藻红蛋白， 分离电压为5 0 0 v 。 c u i 等2 7 】在p d m s 芯片上采用等电聚焦分离模式成功分离了重组绿荧光蛋 白、异藻青蛋白和藻红蛋白。该作者还报道，通过改变样品和分离介质中添加剂 甲基纤维素的浓度，可以改变完成蛋白质分离所需要的通道距离，结果如图1 5 所示。 ； c c l 一，一a 一一一夏 l l 一3 0受 乏o 伯国 图1 5 不同介质对p d m s 芯片等电聚焦分离蛋白质的影响 ( a ) 样品和电极液中都不含m c ( b ) 样品中含0 4 m c ，电极液中含0 2 m c ( c ) 样品中含0 4 m c ，电极液中含2 5 m c t s a i 等【2 8 】通过采用六甲基二硅氧烷等离子聚合膜修饰玻璃芯片通道的方法 抑制蛋白吸附，在等电聚焦的分离模式下分离了藻青蛋白( p i4 6 5 ) ，血红蛋白 ( p i7 0 ) 和细胞色素c ( p i9 6 ) 三种蛋白混合物，分离在3m i n 内完成，分离效 率为1 9 6 0 0 塔板数米。 h u a n g 等2 9 】在进行芯片等电聚焦蛋白分离操作时，采用在两性电解质溶液中 加入羟甲基纤维素作为添加剂的方法来抑制蛋白的吸附。 1 6 浙江大学硕士学位论文 1 2 4 芯片胶束电动毛细管电泳 胶束电动毛细管电泳( m i c e l l a re l c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 是毛细管电泳与胶束增溶色谱相结合的分离技术，其原理是在装有胶束溶液的通 道内，溶质组分在电场力的作用下根据其在胶束相和水相之间的分配不同而产生 分离。目前，最常使用的形成胶束的表面活性剂为s d s 。 j i n 等【3 0 】在玻璃芯片上进行动态标记，采用胶束电动色谱的分离模式，成功 实现了分子量在1 4 4 - - 2 0 0k d a 之间的八种蛋白质的分离。芯片通道宽1 2 0l x m ， 深3 0 “i i l ，以b i o r a d 公司的c e s d s 缓冲液作为分离介质；分离电压4 0 0v ， 进样时间5 0s ，分离电压4 2 0 0 v ，分离时间2 4 0s 。图1 6 为8 种蛋白的分离谱图。 图1 6 激光诱导荧光检测芯片胶束电泳分离8 种蛋白质 ( 1 ) 溶解酵素( 1 4 4k o a ) ；( 2 ) 胰岛素抑制剂( 2 1 5k o a ) ：( 3 ) 碳脱水酶( 3 1 ok d a ) ；( 4 ) 卵清蛋白( 4 5 0k d a ) ；( 5 ) 血清白蛋1 刍( 6 6 2k d a ) ；( 6 ) 磷酸化酶b ( 9 7 0k d a ) ；( 7 ) a 一半 乳糖苷酶( 11 6k d a ) ；( 8 ) 肌球蛋白( 2 0 0k d a ) 。 d o u 等采用b r i j 3 5 修饰p d m s 芯片通道，在胶束电动色谱的分离模式下 实现了葡萄糖氧化酶和肌红蛋白的有效分离( 图1 7 ) 。该芯片涂层在p h6 1 2 1 7 浙江大学硕士学位论文 范围内能显著降低蛋白质大分子的吸附，并减少检测蛋白质所需的冲洗时间，从 而提高分离效率。 2 2 4 0 釉l 1 2 臼 m i g r a t i o nt i m e s l l v t i 图1 7b r i j 3 5 修饰p d m s 芯片通道中连续进样电泳图 ( 1 ) 葡萄糖氧化酶( 2 ) 肌红蛋白 h u a n g 等【3 2 1 在p d m s 芯片中采用0 1 的十二烷基麦芽糖( d d m ) 和0 0 3 的s d s 作为混合胶柬，对通道进行动态修饰，可有效抑制蛋白吸附，控制电渗 流，使蛋白质在非变性条件下得到有效分离。 1 2 5 芯片二维电泳分离 芯片毛细管电泳应用的成功促进了高速高效的芯片二维电泳技术的发展。对 于多组分复杂蛋白质样品，采用传统的一维分离方法显然无法满足要求，需要采 用而未分离技术来提高分离效率，增加峰容量。与传统毛细管电泳系统相比，在 芯片上进行二维电泳分离，可以通过设计芯片通道结构实现通道的直接交叉或连 通，而无需制作复杂的二维毛细管电泳接口，从而避免了接口处死体积致使谱带 扩展的影响。 在芯片二维电泳分离蛋白质的研究中，第一维分离模式多采用基于蛋白等电 1 8 浙江大学硕士学位论文 点聚焦分离的等电聚焦模式。c h e n 等【3 3 】制作了二维毛细管电泳p d m s 芯片，利 用第一维的等电聚焦和第二维的凝胶电泳对荧光标记的牛血清白蛋白和碳酸酐 酶以及德科萨斯红标记的卵清蛋白进行分离分析。 l i 等【3 4 】设计的等电聚焦和凝胶电泳联用的二维分离高聚物芯片( 如图1 8 所 示) ，蛋白质样品在完成一维等电聚焦分离后，可在多个并行的通道内完成凝胶 电泳分离。整个分离过程在1 0m i n 内完成，峰容量达到1 7 0 0 。 图1 8 芯片二维分离结构及五种模型蛋白分离荧光图像 h e r r 等【3 5 】研制了采用十字通道构型的等电聚焦一自由区带电泳二维芯片电泳 分离系统( 如图1 9 所示) ，芯片通道宽2 0 0g m ，深2 0g m ，待测样品在横向通 道中进行等电聚焦分离，分离后的样品区带在电场驱动下进入纵向区带电泳通道 中进行第二维分离。系统采用荧光显微镜成像的方法对分离性能进行评价，5m i n 内分离的峰容量达到1 3 0 0 。 1 9 浙江大学硕十学位论文 a 罄1 一马一 一 j -一 ri 粤! d 1 i 材l e o f ：2 涎e c l o fa r e a 图1 9 芯片二维分离结构示意图 w a n g 等t 3 6 1 黼p d m s 芯片中制作微阀来防止一维等电聚焦和二维凝胶电 泳二者的分离缓冲液相混合( 图2 0 ) ，在2 0 - m i n 内有效分离了四种标准蛋白。 p e a k t 啪s f e r r e g l o n 3 嗍 ( a ) d e a dv o l u m e 弋。 j j l 卜 j g ： ，、 。 - 一吝 。 图2 0p d m s 芯片通道和四个分离步骤示意图 ! ! ! 竺! ! 竺! 也有报道在p m m a 芯片上，将s d s 凝胶电泳和胶束电动毛细管电泳相结合 的蛋白质二维电泳分离0 7 l ( 如图2 1 所示) ，该系统在1 2r a i n 内完成1 0 种蛋白 质的分离，峰容量约为1 0 0 0 。 a o 卜0 = l 豫乏 器髻警车； b 工 图2 l ( a ) 芯片二维分离结构示意图 f b ) - - 维分离交界处荧光图像 胶柬电动毛细管电泳或毛细管电色谱也多做为第一维分离模式与区带电泳 相结合，用于蛋白质酶解物的分离分析。2 0 0 0 年，r a m s c y 课题组删首次在玻璃 芯片上建立了胶束电动毛细管电泳( 第一维) 与区带电泳( 第二维) 结合的二维 分离系统，应用于细胞色素c 、核糖核酸酶、廿乳白蛋白等的胰酶降解产物分离。 后来，该课题组 3 9 1 对其进行改进，加长第一维电泳通道长度，并采用细直径转角 通道来降低扩散( 图2 2 ) ，在约1 5 m i n 内分离牛血清白蛋白酶解物，峰容量达到 4 2 0 0 。 浙江大学硕士学位论文 a 6 3 0 l l m b 图2 2 ( a ) 二维电泳芯片结构示意图 ( b ) 1 3 直径转角通道示意图 | 1 2 5 p “ 2 0 0 1 年，r a m s e y 课题组【4 0 】还研制了开管电色谱和区带电泳相结合的芯片二 维电泳系统( 图2 3 ) ，其电色谱分离部分采用长2 5c m 的十八烷基三甲氧基硅烷 涂层的环状通道，取代电泳部分则采用长1 2c m 的直形通道，在1 3r a i n 内实现 了p 一酪蛋白胰蛋白酶解产物的分离。 5c m 图2 3 二维分离芯片结构示意图 浙江大学硕士学位论文 相对一维分离芯片，二维芯片分离系统具有很高的分离效率和峰容量，预计 会在复杂蛋白质样品的分离上发挥更大的作用。 1 2 6 其他模式 除上述分离模式外，芯片自由流电泳以及芯片电色谱也是芯片电泳分离蛋白 质的重要方法。 芯片自由流电泳是指在芯片中通过外加电场使样品随缓冲液连续流动并同 时在顺电场方向进行电迁移，从而按照电泳淌度不同实现分离的电泳分离模式。 r a y m o n d 等【4 1 】采用芯片自由流电泳模式分离了人血清蛋白，缓激肽和核糖核酸酶 a ( 图2 4 ) ，其分离长度为3 1c m ，流出时间为6 2s 。 e 匕a l 列 b ；。i l l 二u 氓：歹 b 久一心 1 ) i s t u n c ea c r o s s s c l 甜r ；l l i o n 抟擘i l r a m ) 图2 4自由流电泳模式下不同场强的蛋白分离图 ( a ) f i t c ；( b ) 人血清蛋白：( c ) 缓激肽；( d ) 和核糖核酸酶a k o b a y a s h i 4 2 1 采用自由流电泳的分离模式在一个体积为5 6 5m m x 3 5 m m x 3 0 “m 的微分离室( 6 0p l ) 中实现了持续的蛋白分离，并用羟丙基甲基纤维 素涂覆来抑制蛋白吸附，在2 5m i n l 为有效分离了细胞色素c 和肌红蛋白。 一譬lll毒，11嚣一萎铷u钎翟岱茹一 浙江大学硕士学位论文 最近，k a h l h e y e r 等【4 3 1 制作了一种自由流等电聚焦分离蛋白质的玻璃芯片， 成功的将人血清白蛋白( p i4 4 ) 与等电聚焦标记物( p h3 年f 1 9 ) 分离。分离效果 见图2 5 。 1 0 刚 2 p 二 ， ，一 i ， ， - ， ； ” ， _ ，(a p j i ” ，“ - - _ ， 3 h s a p 1 4 4 i9 洌豳黧震 燃溺黝缓缓缓缓缓蠓 - a 】 e = 2 0 v m m + 州g r a d i e n t 图2 5自由流电泳分离图 芯片毛细管电色谱分离模式是采用m e m s 技术在芯片上制备分离性能良好 的电色谱柱，将高效液相色谱的高选择性和毛细管电泳的高效性结合，根据组分 在固定相和流动相之间分配系数不同以及电泳速率差异对各组分进行分离的方 法。近来，有关芯片毛细管电色谱分离蛋白质的报道较少，而较多的应用于蛋白 质的酶解物的分离分析【4 4 4 5 1 。h e 等【4 6 1 采用c 1 8 修饰的c o m o s s ( c o l l o c a t e d m o n o l i t hs u p p o r ts t r u c t u r e s ) 整体柱分离了卵白蛋白的胰蛋白酶消解产物。该s l e n t z 等【4 7 , 4 8 $ 1 j 作了c o m o s s 整体柱p d m s 芯片( 如图2 6 所示) ，并通过在c o m o s s 表 面涂敷c 1 8 - a m p s 等5 种试剂，实现了牛血清白蛋白消解产物的选择性分离。 fslitjr一ee)，；亨 扎和8”舶争 k耋譬 浙江大学硕十学位论文 1 3 总结 袅 v 吞 黧窿 q 竹 图2 6p d m s 芯片c o m o s s 整体柱分离通道结构示意图 微流控芯片毛细管电泳是一种快速、高效的分离分析技术，必将成为实现蛋 白质灵敏、快速、准确的有效分离的重要方法。微流控芯片毛细管电泳系统应用 于蛋白质的分离分析具有突出的优越性，特别是在临床检验及现场监测等方面的 应用具有良好的发展前景。另外，其对分析仪器的集成化、微型化与便携化的发 展也具有重要意义。 目前，很多科研工作者正致力于微流控芯片毛细管电泳与质谱联用技术的研 究，利用质谱分辨率高、灵敏度高、检测速度快等特点进一步提高蛋白质的分离 分析通量，以适用于复杂蛋白质样品的分离分析。相信随着研究的不断深入及相 关技术的不断发展，微流控芯片毛细管电泳蛋白质分离技术将同趋成熟，逐步实 现分析样品的多元化、分析仪器的便携化、集成化，从而实现真正意义上的小型 化实验室。微流控芯片毛细管电泳蛋白质分离技术必将在各个领域发挥至关重要 的作用，并拥有广阔的发展前景。 浙江大学硕士学位论文 参考文献 1 】m a n za ，g r a b e rn ，w i d e m e rhm s e n s a c t u a t o r sb ，1 9 9 0 ，b 1 ：2 4 4 【2 】2 m a n z a ，h a r r i s o ndj ，v e r p o o r t eem j ，f e t t i n g e rjc ，p a u l u sa ，l u d ih ， w i d e m e rh m j c h r o m a t o g r a ，19 9 2 ，5 9 3 ：2 5 3 3 】v i l k n e rt ，j a n a s e kd ，m a n za ，a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：3 3 7 3 【4 】r e y e sdr ，i o s s i f i d i sd ，a u r o u xpa ，m a n za ，a n a l c h e m ，2 0 0 2 ，7 4 ：2 6 2 3 【5 】d o l n i kv l i usr ，j o v a n o v i c hs ，e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 0 ，2 1 ：41 6 】b e l d e rd ，l u d w i gm ，e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 3 ，2 4 ：2 4 2 2 【7 】r o d r i g u e zi ，z h a n gyl e ehk ，l isfyj c h r o m a t o g r a ，1 9 9 7 ，7 8 1 ：2 8 7 【8 】c o l y e rcl ，m a n g r usd ，h a r r i s o ndj j c h r o m a t o g r a ，19 9 7 ，7 81 ：2 71 【9 】x i a odq ，l etv ，w i r t hmj a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：2 0 5 5 【10 d o d g ea ，b r u n e te ，c h e ns ，g o u l p e a uj ，l a b a sv 1 1 1 1j ，t a b e t i n gp a n a l y s t ，2 0 0 6 ，1 3 1 ：11 2 2 【1l 】庄贵生，刘菁，贾春平，金庆辉，王惠民，杨梦苏，赵建龙化学学报， 2 0 0 6 ，6 4 ：2 2 9 【1 2 】w udp ，l u oyz h o uxm ，d a izp ，l i nb c e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 5 ，2 6 ：2 1 1 【1 3 】w udp ，z h a obx ，d a izp ，q i njh ，l i nbc l a bc h i p ，2 0 0 6 ，6 ：9 4 2 【1 4 w udp ，q i njh ，l i nb c l a bc h i p ，2 0 0 7 ，7 ：1 4 9 0 15 】c h i e mn ，h a r r i s o ndj a n a l c h e m ，19 叽6 9 ：3 7 3 16 】y a os ，a n e xds ，c a l d w e uwb ，a r n o l ddw ：s m i t hkb p r o c n a t l a c a d s c i u s a ，19 9 9 ，9 6 ：5 37 2 【17 】h e r rae ，s i n g hak a n a l c h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ：4 7 2 7 【18 h a t c hav ，h e r rae ，t h r o c k m o r t o ndj ，b r e n n a njs ，s i n g hak a n a l c h e m ，2 0 0 6 ，7 8 ：4 9 7 6 【19 】a g i r r e g a b i r i am ，b l a n c of ，b e r g a n z oj ，f u l l a o n d oa ，z u b i a g aa m ，m a y o r a k ，r u a n o l 6 p e zjm e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 6 ，2 7 ：3 6 2 7 2 0 】a r r o y omt ，f e m f i n d e zlj ，a g i r r e g a b i r i am ，i b 百m e z ln ，a u r r e k o e t x e aj ， b l a n c of j j m i c r o m e c h m i c r o e n g ，2 0 0 7 ，17 ：12 8 9 2 1 】g i o r d a n obc ，j i nlj ，c o u c haj ，f e r r a n c ejp ，l a n d e r sjpa n a l c h e m 2 6 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 4