（遗传学专业论文）pten在早孕小鼠子宫内膜的表达及功能研究.pdf

重庆医科大学硕士研究生学位论文英文缩写p t e nd n ar n am r n ac d n d d h 2 0b p田叮r pr n a d e p cp c re d t ae be ph r ph 2 0 2d a bk bo dp b sr t _ p c r英汉缩略语名词对照英文全称p h o s p h a t a s ea n dt e n s i o nh o m o - l o g u ed e l e t e do nc h r o m o s o m e1 0d i e t h y r i b o n u c l e i ca c i df i b o n u c l e i ca c i dm e s s e n g e rr n ac o m p l e m e n t a r yd n ad e h y d r o n i u mh 2 0b a s ep a i rd e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t er i b o n u c l e a s od i e t h y l p y r o c a r b o n a t ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ne t h y l e n ed i a m n e t e t r a - a c e t i ca c i de t h i d i u mb r o m i d ee p p e n d o r fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s eh y d r o g e np e r o x i d ed i a m i n o b e n z i d i n ek i l o b a s eo p t i c a ld e m i t yp h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o nr e v e r s et r a n s c r i p t - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nf l u o r e s c e n c e q u a n f i t a t i v ep o l y m e r -a b ec h a i nr 龇e t i 0 d r f v e l - s et r a n s c r i p t1中文全称第十号染色体缺失的具有磷酸酶活性的张力素同源基因脱氧核糖核酸核糖核酸信使r n a互补d n a去离子水碱基对脱氧三磷酸腺苷核糖核酸酶焦碳酸二乙酯聚合酶链式反应乙二胺四乙酸溴化乙锭微量离心管辣根过氧化物酶过氧化氢二氨基联苯胺千碱基对光密度磷酸盐缓冲液逆转录聚合酶链反应实时荧光定量聚合酶链反应反转录重庆医科大学硕士研究生学位论文t a qt r i st b et h e r m o s a q u a t i c u s ( d n ap o l y m c r a s c )t h c r m o s a q u a t i c u st r i s - b o r i ca c i d - e d t as e c o n dm i n u t eh o u ra n t i s e n s eo l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s2耐热d n a 聚合酶三羟甲基胺基甲烷三羟甲基胺基甲烷硼酸四乙酸缓冲液秒分小时反义寡脱氧核苷酸nd? h 删重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任学位论文作者签名：诬盛诠日期：皇回：生：卑学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关部门或机构遥交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借网。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内客除外) ，可以采用影印，缩印或其他手段保存论文论文作者签名：! 透：选硷指导教师擀：篮粤扯日期：立啤生与l重庆医科大学硬士研究生学位论文p t e n 在早孕小鼠子宫内膜的表达及功能研究摘要背景：胚胎着床是人类和哺乳动物生殖过程中妊娠建立的第一步，也是决定妊娠成功与否的关键。成功的植入取决于处于接受状态的子宫内膜和具有侵入性的胚胎间的同步协调反应。但是子宫内膜仅在某一特定时期允许胚胎着床，这一时期时间很短，代表着子宫内膜对胚胎具有容受性，称为“着床窗口期”。胚胎着床过程包括脱去透明带、定位、黏附、侵入到最后着床等几个阶段。由于涉及到众多基因的调控以及错综复杂的调节因子网络的参与，早期的胚胎发育和着床的详细分子机制尚不清楚。自1 8 2 9 年，l o b s t e i n 等提出肿瘤胚胎性起源概念以来，胚泡着床与肿瘤侵袭性转移之间相似的生物学行为就越来越受到重视，原癌基因及肿瘤抑制基因也成为了胚泡着床机制研究的热点。p t e n ( p h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o g u ed e l e t e do nc h r o m o s o m e1 0 ) ，是位于人类染色体的1 0 q 2 3 的肿瘤抑制基因，编码一个4 0 3 个氨基酸的蛋白质，是蛋白酪氨酸酶家族的一个成员，具有多种功能的p t e n 在胚胎正常发育过程中是必需的【1 1 。0 7 _ j e n lg u z e l o g l u - k a y i s l i 等发现在早孕期的蜕膜和腺体细胞p t e n 的表达比月经周期任一期的表达均高，推测可能和这一时期子宫内膜细胞增殖减少和细胞凋亡增加有关 9 1 。3重庆医科大学爵士研究生学位论文在对不同组织p t e n 基因敲除的小鼠模型的研究中发现，p t e n 等位基因纯合性敲除会导致生殖细胞、t 淋巴细胞及哺乳动物上皮细胞的肿瘤发生。总之，p 1 e n 是一种胚胎发育过程中必不可少的肿瘤抑制因子，它促进凋亡的发生。因此我们推测，在胚胎植入的过程中，p t e n 在诱导子宫内膜腔上皮细胞，蜕膜细胞及滋养层细胞的凋亡过程中发挥重要的作用。然而p t e n 在小数鼠妊娠早期子宫内膜中的表达情况国内外尚无文献报道，是一个值得研究的课题。目的：研究凋亡抑制基因p t e n 在小鼠子宫内膜表达的规律性变化及其对胚泡植入的影响，初步探讨它在小鼠生殖中的作用。方法：1 收集未孕和早孕1 、3 、4 、5 、7 天小鼠子宫内膜，共6 组，每组2 0 只小鼠。( 1 ) 运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应( f q - p c r ) 技术测定p t e nm r n a 的表达规律；( 2 ) 免疫组织化学s p 法检测小鼠子宫内膜中p t e n 蛋白的表达情况；2 于孕3 天晚8 时小鼠子宫角注射p t e n 反义寡核苷酸，于孕8天观察着床胚泡数。结果：1 f q - p c r ：早孕小鼠子宫内膜和非孕小鼠子宫内膜均有p t e n m r n a 表达，妊娠的子宫内膜组织p t e n 的表达高于未妊娠的子宫内膜组织，且随着妊娠天数的增加呈现逐渐增加的趋势，到妊娠第五天达到最高；2 免疫组织化学：p t e n 蛋白在子宫内膜广泛表达，特别是上皮4重庆医科大学硕士研究生学位论文细胞胞浆，间质细胞胞浆表达也较丰富。p t e n 蛋白的表达规律与m r n a结果基本一致。3 于孕3 天晚8 时子宫角注射p t e n 反义寡核苷酸，观察结果显示注射p t e n 反义寡核苷酸组着床胚泡数明显减少，差异显著( p o 0 5 ) 。结论；p t e n 在妊娠第5 天高表达，说明它可能与诱导子宫内膜腔上皮细胞、蜕膜细胞发生凋亡，进而协调子宫内膜的蜕膜化和滋养层细胞的侵入有关。用f r e n 反义寡核苷酸在基因水平阻断其翻译成蛋白质，进而阻断其生理功能，发现着床胚泡数明显减少，推测其很可能在胚泡着床中扮演重要的角色。关键词p t e n ，子宫内膜，着床重庆医科大学硕士研究生学位论文e x p r e s s l 0 n0 fp t e ni nt h ee n d o m e t r j u mo fm o u s ea n di t sf u n c t i o nd u r i n g t h eb l a s t o c y s ti m p l a n t a t i o na b s t r a c tb l a s t o c y s ti m p l a n t a t i o ni so n eo ft h ee a r l i e s te v e n t si nr e p r o d u c t i o no fh u m a n sa n dm a m m a l st h a td e t e r m i n e sw h e t h e rp r e g n a n c yw i l ld e v e l o ps u c c e s s f u l l y s u c c e s s f u li m p l a n t a t i o nd e p e n d so ni n v a s i v eb l a s t o c y s t ,a c c e p t i v ee n d o m e t r i u ma n dt h e i rs y n c h r o n i z a t i o n i n i t i a t i o no fe m b r y oi m p l a n t a t i o no c c u r sa tt h eb l a s t o c y s ts t a g ea n dt h e r ei sas h o r tp e r i o dd e f i n e dw i n d o w o f u t e r i n er e c e p t i v i t yf o ri m p l a n t a t i o n ，t h es o - c a l l e d “i m p l a n t a t i o nw i n d o w i m p l a n t a t i o ni na l lm a m m a l si n v o l v e ss h e d d i n go ft h ez o n ap e l l u c i d a ，f o l l o w e db yo r i e n t a t i o n ，a p p o s i t i o n ，a t t a c h m e n ta n da d h e s i o no ft h eb l a s t o c y s tt ot h ee n d o m e t r i u m t h er e g u l a t i o no fe a r l ye m b r y od e v e l o p m e n ta n dt h ed e t a i l e dm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fi m p l a n t a t i o nb yw h i c he m b r y o si n v a d ei n t ot h eu t e r u sr e m a i n sp o o r l yu n d e r s t o o d , d u et ot h el a r g en u m b e ro f g e n e sa n dt h ec o m p l e x i t yo f t h es y s t e m si n v o l v e d t h el a r g en u m b e ro f r e s e a r c h ss h o wt h a tt h l ea r es t r i k i n gs i m i l a r i t i e sb e t w e e nn o r m a le m b r y o n i cd e v e l o p m e n ta n dn e o p l a s mm e t a s t a s i ss i n c el o b s t e i ne ta li n t r o d u c et h ec o n c e p to ft h eg e n e s i so fc a n c e ri sf r o mb l a s t o c y s ti n18 9 2 , p r o t o o n c o g e n ea n dt u m o rs u p p r e s s o rg e n ei sb e c o m i n gh o ts p o ti n6重庆医科大学硕士研究生学位论文b l a s t o c y s ti m p l a n t a t i o n p t e n ( p h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o g u ed e l e t e do nc h r o m o s o m e1 0 ) i sat u m o rs u p p r e s s o rg e n el o c a t e do l lh u m a nc h r o m o s o m e1 0 q 2 3 i te n c o d eap r o t e i nw i t h4 0 3 a a , w h i e hi sam e m b e ro fp r o t e i nt y r o s i n a s e i ti sn e c e s s a r yf o rt h ed e v e l o p m e n to f n o r m a le m b r y o o z l e mg u z e l o g l u - k a y i s l ie ta lh a v er e p o r t e dt h a tt h ei m m n n o - r e a c t i v i t yf o rp t e ni ne n d o m e t r i u mo fe a r l yp r e g n a n tw a ss t r o n g e ri nb o t hs t r o m a la n dg l a n d u l a rc e l l sc o m p a r e dw i t hn o n p r e g n a n te n d o m e t r i u m i tm a yb ec o n c e r n e dw i t ht h ed e c r e a s eo f c e l lp r o l i f e r a t i o na n di n c r e a s eo f a p o p t o s i so fe n d o m e t r i u n i nt h er e s e a r c ho ft h em o d e l so ft h ed i f f e r e n tt i s s u eo fp t e nk n o c k o u tm i c e ，f o u n dt h a tp t e na l l e l eh o m o z y g o s i t yk n o c k o u tw i l ll e a dt ot u m o r i g e n e s i so f g e r mc e l l ，tl y m p h o c y t ea n dm a m m a le p i t h e l i a lc e l l i naw o r d , p t e ni sai n d i s p e n s a b l et u n l o rs u p p r e s s o rg e n ei nt h ed e v e l o p m e n tp r o c e s so f e m b r y o ，i tp r o m o t ea p o p t o s i s s ow ep r e s u m et h a tp t e nm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei ni n d u c ea p o p t o s i so fl u m i n ae p i t h e l i a lc e l l ，d e c i d u a lc e l la n dt r o p h o b l a s t i cc e l lo fe n d o m e t r i u mi nt h ep r o c e s so fb l a s t o c y s ti m p l a n t a t i o n s oi ti sas i g n i f i c a n ts t u d yt oi n v e s t g a t et h ee x p r e s s i o nr u l eo fp t e ni nt h ee n d o m e t r i u mo f e a r l yp r e g n a n tm i c e o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nr u l eo f t u m o rs u p r e s s o rg e n ep t e ni nt h em i c e se n d o m e t r i n ma n da n a l y s i si t sr o l ei nb l a s t o c y s ti m p l a n t a t i o n m e t h o d s ：1 e n d o m e t r i u mofm i c ei nt h ee a r l yp h a s eo fu n p r e g n a n c ya n dp r e g n a n td 1 ，d 3 ，d 4 ，d 5 ，d 7 e n t e r e di n t ot h es t u d y t h e r ea r e6s t u d yg r o u p s ，e a c hg r o u p7重庆医科大学硬士研究生学位论文h a v e1 0m i c e p t e nm r n aa n dp r o t e i ne x p r e s s i o nw e r ed e t e c t e di nt h ee n d o m e t r i ao fm i c eb yr e a l - t i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r ( f q p c r )a n di m m u n o - h i s t o c h e m i c a lt e c h n i q u er e s p e c t i v e l y 2 t h en u m b e ro f b l a s t o c y s ti m p l a n t a t i o nw a $ r e g l s t e r e db yi n j e c t e dp t e na n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d ei nh o r no f u t e r u sa t2 0 ：0 0o nt h ep r e g n a n td 3 ，r e s u i t s ：1 t h ep t e nm r n a p - a e t i nm r n ae x p r e s s i o ni np r e g n a n tg r o u pi sh i 曲e rt h a nt h a to fn o n - p r e g n a n tg r o u p ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dg r a d u a lh o i s tt r e n da sd a y sp a s t t h ep t e nm r n ae x p r e s s i o ni sr e a c h e dt h em a x i m u ma tp r e g n a n td 5 2 i m m u n o h i s t o c h e m i c a la n a l y s i ss h o w e dt h es a n l er e s u l ta sf q - p c r p t e np r o t e i ne x t e n s i v ee x p r e s si ne n d o m e t r i u mo fm o u $ e ，e s p e c i a l l yi nt h ek y t o p l a s mo fe p i t h e l i a lc e l l w h i l es t r o m a lc e l lk y t o p l a s ma l s oe x p r e s s3 t h en u m b e r so fb l a s t o c y s ti nh o r no fu t e r u sw h i c hw a si n j e c t e dp t e na n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d ei sf e w e rt h a nt h a to fs a l i n ei n j e c t e d c o n c l u s i o n ：p t e nm r n aw a se x p r e s s e ds t r o n g l yi nt h ee n d o m e l r i ao nt h ed a y5p r e g n a n t i tm a y b ec o n c e r nw i t ha p o p t o s i so f l u m i n ae p i t h e l i a lc e l la n dd e c i d u a lc e l l ，i ta l s oc o n t r i b u t et oc o o r d i n a t ed e c i d u a l i z a t i o no f e n d o m e t r i u -ma n di n v a s i o no f 协o p h o b l a s t i cc e l l i no r d e rt oe l u c i d a t et h ef u n c t i o no fp t e ni nt h ee m b r y oi m p l a n t a t i o n , p t e na n t i s e n s eo l i g n n u c l e o t i d ew a su s e dt oh o l db a c ki t t r a n s c r i b e ，w el o u dt h a tt h en u m b e ro fb l a s t o c y s t8重庆医科大学硕士研究生学位论文i m p l a n t a t i o nm a r k e d l yd e c r e a s e s a p o p t o s i so f e p i t h e l i a lc e l lo f e n d o m e t r i u -i ni n d u c e db yp t e nc o u l db eo n eo fm e c h a n i s m st h a te m b r y o sp e n e r t r a t e dt h ee p i t h e l i a lb a r r i e r , i tm a yp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so fk e y w o r d s ：p t e n ；e n d o m e t r i u m ，i m p l a n t a t i o n9重庆医科大学硕士研究生学位论文p t e n 在早孕小鼠子宫内膜的表达及功能研究前言胚胎着床( e m b r yi m p l 缸拄旧c o 粥) 又称为植入，是指胚泡黏附并侵入子宫内膜的过程，整个着床过程可以分为胚泡定位( a p p o 枷o n ) 、黏附( a d h e s i o n ) 和侵入) 三个阶段闭。成功的着床是母体子宫内膜和胚泡之间相互协调、精确调控的结果，一方面，胚泡为着床作好准备，子宫内膜也通过一系列变化达到接受状态；另一方面，两者的变化在时间上相一致，即胚泡与子宫内膜“着床窗口期”对话的建立，随后胚泡黏附、侵入及胎盘建立。现有研究认为，着床过程是一个渐进性的局部组织重建过程，其中甾体激素居主导地位，细胞因子、生长因子、黏附分子和蛋白酶等参与其中，并通过胞内信号转导及关键基因的表达使子宫内膜发生一系列复杂变化【3 4 j 。胚胎着床和胎盘形成过程会发生一系列的细胞间相互作用。细胞增值、侵入以及细胞凋亡等，导致着床点处组织重建。细胞凋亡在雄性苗勒氏管退化、精子发生、卵泡闭锁、黄体退化、着床前胚胎发育、着床过程中滋养层细胞侵入子宫内膜、子宫内膜蜕膜化及母胎免疫耐受等过程中起重要作用。子宫内膜细胞的凋亡是去除胚泡着床通道上内膜组织的一种重要机制，也是子宫内膜接受状态建立的一个重要特征【5 一。现已有研究证实，f 鹪l 存在于胚胎的滋养外胚层，f 嬲定位于人子宫内膜上皮细胞，f a s f 器l 介导的e e c 凋亡可能是胚泡跨跃子宫上皮障碍的一个重要机制，植入过程中f a s l 诱导的内膜间质细胞的凋亡，在胚胎滋养层细胞的侵入过程中起重要作用【l 川。第1 0 号染色体缺失的具有磷酸化酶活性的张力素同源基因( p h o s p h a t a s ea n dt e n s mh o m o l o g u ed e l e t e do hc h m l n o s 哪e1 0 ，p t e n ) 是1 9 9 7 年由s t e e k 等国际上3个科研小组分别发现并统一命名的，是继p 5 3 基因之后的一种新发现的抑癌基因，也是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因i 刁，近年来发现它在胚胎发育，细胞迁移，和细胞凋亡等中发挥作用【1 删。p t e n 蛋白是蛋白酪氨酸酶家族的1 0重庆医科大学硕士研究生学位论文一个成员。p t e n 能够对抗p 1 3 k 的活性，负调控p 1 3 k 的下游靶点一a k t ，磷酸化的活化的a k t 调控不同的下游的与细胞存活和增殖有关的的蛋白质的活性，阻断细胞的凋亡，因此眦n 能够诱导肿瘤细胞发生凋亡和对抗侵袭【”。p t e n 在子宫内膜的表达同时亦受卵巢雌孕激素的影响 8 1 。o z l e mg u t _ e l o g l u - k a y i s l i 等观察到雌激素通过增加p t e n 的磷酸化而下调p t e n 的活性，而孕激素通过减少它的磷酸化而增加p t e n 的活性。通过卵巢激素调控p t e n 的表达能够协调子宫内膜细胞增值和凋亡之间的平衡。子宫内膜细胞的凋亡在调控子宫内膜的蜕膜化和滋养层细胞的侵入方面发挥重要的作用凹。总之，现有研究认为，胚胎着床需要胚胎和子宫内膜同步发育，是一个复杂的受诸多因素精确调控的细胞或分子生物学过程。但迄今为止对这种调控网络的认识仍然十分有限。在生殖及胚胎发育方面的研究中，应用最多的研究对象就是小鼠。主要是因为小鼠的生殖周期短，易于在短期内获得较完整的研究标本，而且小鼠的基因与人类的相关基因有较高的同源性。但作为啮齿动物的小鼠( 属于第二型性周期)黄体机能不明显，排卵后黄体不产生孕激素并立即退化，受精后转化成妊娠黄体产生孕激素，维持妊娠，这是和人类不同之处【。本研究采用f q - p c r 、免疫组织化学s p 法检测p 删在早孕小鼠和未孕小鼠子宫内膜中的表达规律；用p t e n 反义寡核营酸干扰f r e n 蛋白质的翻译，观察胚泡着床数，探讨它在胚泡着床中的可能作用。重庆医科大学碘士研究生学位论文本课题研究的技术路线1 2重庆医科大学硪士研究生学位论文第一部分：p t e n 在小鼠子宫内膜的表达规律1 材料与方法1 1 标本本试验采用成年n i h 小鼠，体重2 3 - 2 5 9 ，购自重庆医科大学实验动物中心。选择动情周期中任意时期的雌鼠按雌：雄比例为2 ：1 与雄鼠合笼交配，次晨发现有阴栓者为妊娠第一天，依次计算妊娠天数。随机将未孕小鼠和孕鼠分为6 组( 分别记为d o 、d 1 、d 3 、d 4 、d 5 、d 7 ) ，每组2 0 只，断颈处死，取无菌条件下子宫内膜备用。再取处于d o 和d 1 、d 3 、d 4 、d 5 、d 7 的孕鼠，每组8 只，断颈处死，剖腹取子宫立即放在4 多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片备用。1 1 1 主要仪器低温离心机高速离心机4 冰箱- - 2 0 冰箱- - 8 0 冰箱电子天平纯水仪超净工作台凝胶成像系统梯度p e r 仪荧光定量p c r 仪超纯水生产仪电泳仪制冰机微波炉微量加样器1 3日本k u b o t ah i m a c ( 日本) 、h e r a e u s ( 德国)国产新飞日本o s t a r日本o s t a r日本岛津法国e l 波i v i i l l i p o r e国产苏州美国b i o - r a d美国b i o - r a d美国b i o r a d a b ip r i s m7 0 0 0e l i xi v i i l l i p o r e ( 美国)中国北京六一x 3 9 r - a 1 0 8 t ( 国产)p a n a s o n i c , ( 日本)e p p e d o f ( 德国)重庆医科大学磺士研究生学位论文显微镜照相系统p h 计紫外分光光度计自动台式灭菌器超净工作台电子天平1 1 2 主要试剂：1 1 3 1r t - p c r 和f q - p c r 试剂：d e p ct r i z o lm m l v 逆转录酶d n t po l i g o ( d t ) l st a q 酶大连琼脂糖e b质粒抽提试剂盒胶回收试剂盒氨苄青霉素d n am a r k e r1 1 3 2 免疫组织化学试剂：免疫组化试剂盒辣根酶标记羊抗小鼠二抗d a b 显色试剂盒苏木精鼠抗人p t e n 单克隆抗体1 4日本o l y m p u sb e c k m a n岛津u v - 2 6 5t m q r - 3 2 5 0苏州进化设备厂j a - 5 0 0 3 型( 国产)美国s i g m a美国p r o m e g a美国p r o m e g a大连t a k 冰a上海生工t a k a r a美国p r o m e g a上海生工上海华舜日本t a k a x a上海生工上海生工d l 2 0 0 0北京中杉北京中杉北京中杉美国s i g m a美国s a n t a 眦重庆医科大学硕士研究生学位论文1 2 方法1 2 1 组织总r n a 的提取1 2 1 1 器材及处理将加样枪头、e p 管、匀浆器、培养皿、手术器械完全浸泡在o i d e p c 的去离子水中处理过夜。加样枪用棉球蘸无水乙醇彻底擦试干净。比色杯用前需先经浓盐酸：甲醇( 1 ：1 ) 浸泡1 h ，后用d e p c 处理或高压消毒过的蒸馏水冲洗。所有玻璃器皿在使用前应酸洗，蒸馏水冲洗后置1 5 0 c 1 8 0 c 烘箱中烘烤4 h 以上，后经1 2 0 1 2 高压灭菌3 0 m i n ，6 0 c 烘干备用，电泳槽先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于3 h 2 0 2 室温1 0 m i n ，最后用0 i d e p c 水冲洗、晾干备用。所用试剂均用0 1 呦) e p c 水配制。1 2 1 2 总r n a 提取操作步骤( 1 ) 将e p 管、匀浆器( o i d e p c 水处理、高压消毒、烤干) 预置冰上。( 2 ) 取清洁级n i h 成年小鼠子宫内膜组织，每5 0 r a g 组织加入l m l t r i z o l提取液，放入匀浆器中于冰上研磨。( 3 ) 加入2 0 0 u l 氯仿，充分振荡混合，于低温离心机上，1 2 0 0 0 r r a i n 离心1 5 r a i n ；( 4 ) 取上清至另一e p 管，加入等体积的异丙醇，混匀，于4 c 放置5 m i n ，然后置于低温离心机上，1 2 0 0 0 r r a i n 离心1 0 m i n 。( 5 ) 弃上清，加入1 0 0 0 u l 预冷的7 5 乙醇洗涤沉淀，低温离心，1 2 0 0 0 r r a i n离心5 m i n 。( 6 ) 以相同的方法再次处理沉淀。( 7 ) 完全弃乙醇，室温挥发残留乙醇5 m i n ，加入4 0 u l 去离子水溶解沉淀。( 8 ) 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，判断总r n a 的完整性。( 9 ) - - 8 0 保存备用。参考分子克隆实验指南的方法，采用1 2 变性琼脂糖凝胶电泳检测总r n a的完整性。用紫外分光光度计测定提取的r n a 在2 6 0 r i m 和2 8 0 r i m 处的吸光度值d 2 6 0 、d 2 8 0 ，确定r n a 的纯度及浓度，r n a ( ug m 1 ) = a 2 6 0 x4 0 稀释倍数，其比值应在1 弘，2 0 之间。1 2 2 引物及探针序列1 5重庆医科大学顼士研究生学位论文p t e n 引物及探针均由上海基康公司合成，序列如下：p t e n t a t a f pa c c c g t g g c a c t g c t g t tp t e n 1 a m 眠a r pg a n 玎c a c c a c a c a c a ( 贮a a t gp i e n t l a m 限a f a mf t g g c g g a a c t r g c a a r c c t c a g t r r ( pa c t i n ：( 购自g e n e c o l )b - a c t i n - t a m r a - f pc c t g a g g c t i 舅r r r r c c a o c c口- a c t i n - t a m r a - r p 仉吼g g t c t 兀 a c g g a r ( h a a c g t8 - a c t i n - t a m r a - f a mf 1 c t t c t t g g d i ：f 姐 g g a a t c c t g t g g c - p1 2 3r t - p c r 采用两步法( 包括逆转录和p c r 两步)1 2 3 1 逆转录e d n a ( 反应体系为2 5 u 1 )试剂浓度体积终浓度总r n a5 u 1o t i g o ( d t ) 1 81 0 0 i tm 0 1 1l 弘l4 i i m o l f l混匀，7 0 ( 2 ，5 m i nj, - r i l p 冰浴，l m i nj试剂浓度体积终浓度m - 皿vb u i f e r5 5 | lll 田叮1 1 p1 0 m m 0 1 15ul2 m m 0 1 1r n a s i n2 5 u 7 l t lo 5 | i lo 5 1 1 ，i l ld d h 2 07 5 i l l混匀，3 t c ，5 m i nj立即冰鼋蛐1 6重庆医科大学磺士研究生学位论文试剂浓度体积终浓度i m m l v2 0 0 u u l1p l8 u ，p l混匀，z2 ，6 0 m i n7 0 3 2 ，1 0 i m i n ( 破gm - m l v )，j4 保存1 2 3 2 p c r 反应( 反应体系为2 5 u 1 )试剂浓度体积终浓度t a qb u f f e r ( m 9 2 + f i v )1 0 2 5 p i1 m 呵皿1 0 m m 0 1 12 l l l0 8 m m 0 1 1m g a c l2 5 m m o f i2 | ll2 m m 0 1 1p t e n 上游引物2 0 p m o l 11 o0 8 p m o l 1p t e n 下游引物2 0 r l m o l l1 o0 8 p m o l 1e d n a 模板2 | ild d h 2 01 4 3 u lt a q 酶5 u l i lo 2 i i lo 0 4 u i ll混匀9 5 5 m i n预变性1c y c l e9 5 3 0 s变性3 5c y c l e5 8 3 0 s退火7 2 4 0 s延伸7 2 1 0 r a i n延伸1c y c l e1 2 3 3 电泳( 具体方法见附录)用t b e 电泳缓冲液配置2 o 的琼脂糖凝胶，以1 2 0 v 恒压电泳约3 0m i n 后在凝胶成像仪下分析结果。1 7重庆医科大学硕士研究生学位论文1 2 4 定量p c r 反应1 2 4 1 标准曲线的制作( 具体方法见附录)操作流程：提取鼬n 逆转录p c r 斗电泳胶回收啼与t a 载体连接斗转化| 抽提质粒- p c r 鉴定卜测序卜作标准曲线1 2 4 2 构建反应体系，放入定量p c r 仪进行操作总体积：2 5 i i l试剂浓度体积终浓度t a qb u f f e r ( m 9 2 + f r e e )l o 2 5 | i ll 田娜限1 0 n u n 0 1 12 o p l0 。8 m m o l lm 9 2 c i2 5 m m 0 1 14 0 u 14 m m 0 1 1p t e n 上游引物2 0 p m o l 1o 5 p l0 4 p m o l 1p t e n 下游引物2 0 p m o l 1o 5 l i l0 4 p m o l 1t a q m a n 探针2 0 p m o l 1o 8 i i lo 6 4 p m o l 1c d n a 模板2 o l l ld d h 2 01 2 5 p lt a q 酶5 u no 2 i lo ，0 4 u | ll混匀9 5 1 0 r a i n预变性9 5 1 5 s变性6 0 3 5 s退火7 2 3 5 s延伸读板4 0 个循环1 8重庆医科大学顼士研究生学位论文1 2 5 免疫组织化学主要步骤：( 1 ) 石蜡切片经常规脱蜡、水化：二甲苯i3 0 m i w - - - - 甲苯一2 0 m i n 一无水乙醇3 r a i n - - 9 5 乙醇3 m i n - - 8 5 乙醇3 m i n - - 7 0 乙醇3 m i n 一蒸馏水冲洗一浸泡在p b s 中4 m i n 。( 2 ) 3 h z 也室温孵育1 5 r a i n ，以消除内源性的过氧化物酶的活性。( 3 ) 蒸馏水冲洗，p b s 浸泡5 m i n ，用p h 6 0 ，0 o l m o l l 枸橼酸缓冲液，9 4 - 9 8抗原热修复处理1 5r a i n 。( 4 ) 自然冷却后p b s 冲洗，5 m i n x 3 次。( 5 ) 滴加鼠抗人p t e n 单克隆抗体，3 7 ( 2 孵育2 小时，p b s 冲洗，3 n f i n x 3次。滴加山羊抗鼠i g g 抗体一 玎冲多聚体，3 7 c 孵育2 0 - 3 0r a i n 。( 6 ) p b s 冲洗，3 m i n x 3 次。( 7 ) d a b 显色剂显色：a 液、b 液、c 液各一滴加入i m l 水中，混匀，显色反应在光镜下进行。( 8 ) 苏木精轻度复染，分色、脱水、透明，中性树脂封片。( 9 ) 显微镜下观察结果并拍照。阳性标准：以出现棕黄色颗粒为阳性。1 2 6 统计处理实验结果采用s p s s i o 0 统计软件分析，采用单因素方差分析。2 结果2 1 r n a 样品的鉴定用紫外分光光度计测定r n a 的o d 2 6 0 o d 2 8 0 比值在1 8 - , 2 0 之间，说明r n a有较高纯度，浓度为0 5 - 1 o p | i l 。1 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果显示r n a基本没降解，较完整( 见图1 ) 。2 2 r t - p c r 产物电泳图r t - p c r 电泳图为胶回收前的电泳图及质粒提取后的p c r 鉴定图。1 9重庆医科大学硕士研究生学位论文圈1 甚r n a 电泳结果田f i 窖1t o t a lr n ap li m a g e2 3 测序结果目2 p c r 电泳田f i 醇e l e c t r o p b o r e g r a mo f p c rp ! n 基因片段克隆到t a 载体( p m d l 8 d 后的测序序列c c c an c 心k 藩x 掀陋吼峨k n k n & k & c 1 氏c c t g c t a a a a a a t c a c c t g g k na c a g a c c c g t x 配a c t g c t g r 丌 c a c a a g 跚r g a t g r 兀g a a a c m 蛆t c c a p d gt t c a g t g g c g g a a c t t g c a a t c c t c a g t t t g t g g t c t g c c a g c t a a a g g t g aa g a t a t a t t c c t c c a a t t c a g g a c c c a c g c g o c g g g a g g a c a a g l l c j 啪1 ac l v n g a g t t c c c t c a g c c 酆r r ( 配c t g t g t g t g g t g a i a 1 r c 测序结果表明p t e n基因片段与预期的p t e n m r n a 序列刚