微生物考试特别篇.doc

第一章 绪论1.微生物特点：体积小，面积大 ;吸收多，转化快;生长旺，繁殖快;适应强，易变异;分布广，种类多.2.历史人物：3.微生物命名：微生物的名字有俗名（common name）和学名（scientific name）两种。双名法：双名法指一个物种的学名由前面一个属名（generic name）和后面一个种名（specific epithet）两部分组成 。 属名的词首须大写，种名加词的字首须小写（包括由人名或地名等专用名词衍生的）。若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定种可用sp来表示。例如，Bacillus sp三名法：学名属名+种名+符号subsp或var+亚种或变种名. 如果是新种，则要在新种学名之后加“sp. nov.” 若为新亚种，则在亚种名称后加subsp. nov4.名词解释：微生物是所有形体微小的单细胞或个体结构较简单的多细胞，以及没有细胞结构的低等生物的通称。微生物分类学：是指根据微生物的亲缘关系把它们排列成一个有规律的分类系统的科学。分类单元：是指某一个具体的分类群。微生物分类的基本单元也是种。微生物种：是显示高度相似性、亲缘关系极其接近、与其他种有明显差异的一群菌株的总称。亚种（subspecies,subsp.,ssp.)在一个种内，根据少数几个稳定的变异特征或根据遗传性状区分成小群，从而把一个种分成两个或多个小群，这些小的分类单位称为亚种。型:是同一细菌种内显示很小生物化学与生物学差异的菌株，常用于细菌（尤其是致病菌）中紧密相关菌株的区分菌株:又称品系（在病毒中则称毒株或株）。表示任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯种群体及其一切后代。菌株常用字母或编号来表示。类群（group）:是一个在分类上没有地位的普通名词，它可非正式地指定一组具有某些共同性状的生物。态（state）:通常指微生物的菌落变异状态，如粗糙、光滑或粘液状等。 第二章 微生物的形态与分类1.细胞壁:细胞壁是细胞最外一层坚韧并富有弹性的外被，主要成分为肽聚糖，细胞壁约占细胞干重 的10-25% 。 作用: 固定细胞外形和提高机械强度 ；为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需 ；渗透屏障，阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤 ；细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性的物质基础。2.肽聚糖:也叫粘肽、葡萄糖胺肽、胞壁质或粘质复合物。少数细菌不含肽聚糖，如属于古细菌类的嗜细菌，产甲烷菌和硫化细菌。革兰氏阳性菌肽聚糖的结构每一个肽聚糖单体含有三个组分双糖单位：由一个N-乙酰葡糖胺通过 1，4-糖苷键与另一个N-乙酰胞壁酸相连，后者为原核生物所特有的己糖。四肽尾或四肽侧链：是由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成。在金黄色葡萄球菌中，接在N-乙酰胞壁酸上的四肽尾为L-Ala D-Glu L-Lys D-Ala, 其中两种D型氨基酸在细菌细胞壁之外很少出现。肽桥或肽间桥：在金黄色葡萄球菌中，肽桥为甘氨酸五肽，它起着连接前后两个四肽尾分子的“桥梁”作用。肽聚糖的多样性主要发生在肽桥上。革兰氏阴性细菌的细胞壁 肽聚糖（Eg.大肠杆菌）肽聚糖埋藏在外膜层之内，是由1-2层肽聚糖网状分 子组成的薄层（2-3nm )，含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较G+细菌弱。 细菌细胞壁成分的总结肽聚糖结构只出现在原核生物中，胞壁酸、磷壁酸（垣酸）、D-型氨基酸及二氨基庚二酸都是细菌以及与细菌相近的原核生物细胞壁中特有的成分。具有两种D型的氨基酸，即D-Ala和 D-Glu。在蛋白质中，这些氨基酸总是L-构型，D-氨基酸的存在有助于抵抗普通蛋白酶和肽酶的水解作用。革兰氏阳性和阴性菌主要由于细胞壁化学成分的差异而引起了物理特性（脱色能力）的不同，从而决定了染色结果的不同。3.革兰氏染色机理：革兰氏阳性细菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层多和 交联致密，故遇乙醇或丙酮作脱色剂处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。革兰氏阴性细菌因其细胞壁薄、外壁层的类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后细胞退成无色。再经番红等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性细菌呈红色，而革兰氏阳性细菌仍保留紫色。4.细菌结构：鞭毛生长在某些细菌体表的长丝状、螺旋的蛋白质附属物，称为鞭毛，其数目为一至数条。鞭毛的结构。（课本）G+的鞭毛结构较为简单，例如枯草芽孢杆菌鞭毛的基体仅有S和M两个环，而鞭毛和钩形鞘与G-相同。G+和G-环系上的差别说明鞭毛的运动只和S环和M环有关，与L环和P环无关。鞭毛虽然是细菌的“运动器官”，但并非生命活动所必需，它极易脱落，也会因变异而丧失。伞毛（Pilus)（菌毛、纤毛、线毛）功能：作为噬菌体的吸附位点；作为附着到哺乳动物细胞或其他物体的工具。伞毛是一种长在细菌体表的纤细、中空、短直、数量较多的蛋白质类附属物，具有使菌体附着于物体表面的功能。以革兰氏阴性细菌居多。性伞毛（pili,单数pilus）（又称性菌毛）构造和成分与菌毛相同，但比菌毛长。数量仅一至少数几根。性毛一般见于革兰氏阴性细菌的雄性菌珠中。其功能是向雌性菌珠（受体菌）传递遗传物质。荚膜(glycocalyx)包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质，称为糖被。糖被的有无、厚薄与菌种遗传性有关，还与环境条件（特别是营养）密切相关。糖被按其有无固定层次、层次薄厚又可分为荚膜、微荚膜,粘液层,和菌胶团。有明显的外缘和一定的形状，厚约200 nm，较紧密地结合于细胞壁外，又称的荚膜或 “真”荚膜，通过液体震荡培养或离心便可得到荚膜物质。荚膜功能：保护作用：保护细菌免受干旱损坏；防止噬菌体的吸附和裂解；使致病菌免受宿主白细胞吞噬。贮藏养料作为透性屏障或离子交换系介质附着作用细菌间的信息识别作用堆积代谢废物芽孢(endospore/spore)某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体。由于一个营养细胞内仅生成一个芽孢，故芽孢无繁殖功能。芽孢是生物界中抗性最强的生命体。一般的芽孢在普通条件下可保持几年至几十年的生活力。休眠期间的芽孢不能检查出任何代谢活力，称为稳生态。一般的芽孢在普通的条件下可保持几年至几十年的生活力。芽孢的抗紫外线能力一般是其营养细胞的一倍。巨大芽孢杆菌芽孢的抗辐射能力要比大肠杆菌的营养细胞强36倍。产芽孢细菌的种类：G+杆菌：好气性芽孢杆菌属，厌氧性芽孢杆菌属；球菌：芽孢八叠球菌；螺旋菌：孢螺菌属芽孢的类型。芽孢的构造芽孢特有的化学物质芽孢耐热机制是由芽孢化学组成的特点决定的含有吡啶2，6二羧酸（DPA）含有芽孢特有的芽孢肽聚糖芽孢平均含40，皮层70，多为结合水芽孢中酶的分子量较营养细胞小渗透调节皮层膨胀学说：芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差和皮层的离子强度很高，从而使皮层产生极高的渗透压去夺取芽孢核心的水分，其结果造成皮层的充分膨胀，而核心部分的细胞质却变得高度失水，因此具有极强耐热性。由此可知,芽孢整体的含水量少，并不说明其各层次的含水量是均一的,其中皮层与核心间含水量的差别是极其明显的。芽孢有生命部位核心部位含水量的稀少(10-25),才是其耐热机制的关键所在.芽孢的形成过程 束状染色质形成（轴丝形成）；细胞膜内陷，细胞发生不对称分裂，其中小体积部分为前芽孢；前芽孢的双层隔壁形成，这时抗辐射性提高；两层隔壁之间充填芽孢肽聚糖后，合成DPA，累积钙离子，开始形成皮层； 芽孢衣合成结束；皮层合成完成，芽孢成熟，抗热性出现； 芽孢囊裂解芽孢的萌发 由休眠状态的芽孢变成营养状态细菌的过程称为芽孢萌发。活化（activation)在人为条件下，活化作用可由短期热处理或用低pH、强氧化剂的处理而引起。活化作用是可逆的，故处理后必须及时将芽孢接种到合适的培养基中去。生长germination)发芽时富含半胱氨酸的蛋白质的三维空间结构发生可逆性变化，从而使芽孢透性增加，随之促进与其有关的蛋白酶的活动。外界的水分不断进入芽孢的核心部位，使核心膨胀、各种酶类活化，并开始合成细胞壁。DPA-Ca、氨基酸和多肽逐步释放。芽孢核心部分开始迅速合成DNA、RNA 和蛋白质，于是出现了发芽并很快变成新营养细胞。伴孢晶体少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体内毒素，称为伴孢晶体。5.细菌的繁殖细菌一般进行无性繁殖，即细胞的横分裂，称为裂殖。同形裂殖；异形裂殖菌落：将单个微生物细胞或一小堆同种细胞接种在固体培养基中，当它占有一定的发展空间并给予适宜的培养条件时，该细胞就迅速进行生长繁殖。结果会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态结构的子细胞团，这就是菌落。各种细菌在一定条件下形成的菌落特征具有一定的稳定性和专一性，这是衡量菌的纯度，辨认和鉴定菌的重要依据。如果菌落是由一个单细胞发展而来，则它就是一个纯种的细胞群或克隆（clone)。如果将某一纯种的大量细胞密集地接种到培养基表面，结果长成的各菌落相互连成一片，这就是菌苔。菌落特征包括菌落大小、形状、光泽、颜色、硬度、透明度等。6.放线菌放线菌的形态构造：链霉菌的细胞呈丝状分枝，菌丝直径很小，与细菌相似。其菌体由分枝的菌丝组成，由于菌丝的连续生长和分枝形成网络状结构，在营养生长阶段，菌丝内无隔，内含许多核质体，故一般成单细胞状态。基内菌丝（Substrate mycelium)：向基质的四周表面和内部伸展的菌丝，较细，颜色较淡，具吸收营养排泄代谢废物功能。菌丝大小为直径 0.2-1.2um长度100600um，可产生不同颜色的色素，水溶性色素可使培养基着色，非水容性色素可使菌落呈现相应颜色。气生菌丝（Aerial mycelium)：又称二级菌丝，生长到一定时期，在基内菌丝上不断向空间分化出较粗、颜色较深的菌丝，直径11.4m，长度不一，直形或弯曲分枝，有的可产生色素，气生菌丝生长致密，覆盖整个菌落表面，菌丝呈放射状。孢子丝(Reproductive mycelium)及孢子：当气生菌丝生长发育到一定阶段，其上分化出的可形成孢子的菌丝,即孢子丝,并通过横割分裂的方式产生成串的分生孢子。孢子的形状及在气生菌丝上排列的方式随种而异。放线菌的繁殖放线菌的发育周期是一个连续的过程，以链霉菌为例：孢子在适宜条件下萌发，长出1-3个芽管；芽管伸长，长出分枝，分枝越来越多，形成营养菌丝体；营养菌丝体发育到一定阶段，向培养基外部空间生长成为气生菌丝体；气生菌丝体发育到一定程度，在它的上面形成孢子丝；孢子丝以一定的方式形成孢子。放线菌孢子的形成横割分裂通常有两种形式：细胞膜内陷：孢子丝的细胞膜由外向内逐渐收 缩形成完整的横隔膜，使孢子丝形成许多分生孢子。细胞壁和细胞膜同时内陷：孢子丝的细胞壁和细胞膜同时内陷，向内缢缩，使孢子丝缢裂成一串分生孢子。7.酵母菌特点 ：个体一般以单细胞状态存在；多数营出芽繁殖，也有的裂殖；能发酵糖类产能；细胞壁常含甘露聚糖；喜含糖量高、酸性的水生环境生长形态和大小酵母菌是典型的真核微生物，其细胞直径为细菌的10倍，在光学显微镜下，可模糊看到酵母细胞内的种种结构分化。酵母菌的细胞形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状等多种，多为单细胞。细胞大小：1-55-10m。只有假丝酵母由母细胞和芽细胞构成集合体，可形成假菌丝。芽殖：成熟的母细胞在其形成芽体的部位长出芽细胞，芽细胞脱离母体，成为新的个体细胞。如果不脱离母细胞，又长出新芽，子细胞就和母细胞连接在一起，形成藕节状或竹节状的细胞串，称为假菌丝。 繁殖方式裂殖：少数酵母菌可以象细菌一样借细胞横割分裂而繁殖，其过程是细胞延长，核分裂为二，细胞中央出现隔膜，将细胞横分为两个具有单核的子细胞。例如，裂殖酵母 。无性酵母菌的繁殖方式芽裂繁殖：是一种界于出芽和横隔形成两者之间的一种裂殖法，这种繁殖法很少见。首先是在芽基很宽的颈处出芽，然后形成一层横隔将芽与母细胞分开。Eg.类酵母属、拿逊酵母属和瓶形酵母属。无性孢子： 掷孢子：少数酵母菌如Sporobolomyces（掷孢酵母属）可在卵圆形营养细胞上长出小梗，其上产生肾形的掷孢子（ballistospore）。孢子成熟后，通过一种特有的喷射机制将孢子射出。 单倍体：细胞中只有一套染色体双倍体：细胞中含有二套染色体 酵母菌以形成子囊和子囊孢子的形式进行有性繁殖：两个性别不同的单倍体细胞靠近，相互接触；接触处细胞壁消失，质配核配，形成二倍体核的接合子 A、以二倍体方式进行营养细胞生长繁殖，独立生活；下次有性繁殖前进行减数分裂。 B、进行减数分裂，形成4个或8个子囊孢子，而原有的营养细胞就成为子囊。子囊孢子萌发形成单倍体营养细胞 。有性假酵母（拟酵母）：只进行无性繁殖的酵母菌 真酵母：具有有性繁殖的酵母菌 生活史生活史又称生命周期：指上一代生物个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部过程。酵母生活史按其单倍体生长时间的长短分三类：营养体既能以单倍体也能以二倍体形式存在典型代表：酿酒酵母 特点：A.一般情况下都以营养体状态进行出芽繁殖 B.营养体既能以单倍体（n）形式存在，也能以二倍体（2n形 式存在 C.在特定的条件下进行有性繁殖 营养体只能以单倍体形式存在 （ 核配后立即进行减数分裂）营养体只能以二倍体形式存在 （核配后不立即进行减数分裂）酵母菌的菌落形态在固体培养基上生长的酵母菌可形成菌落，其特征为表面湿润粘稠，与培养基结合不紧密，容易挑起，比细菌菌落大而厚，外观较稠，故不透明，颜色也较单调，多数呈乳白色或矿烛色，少数呈红色，个别呈黑色。菌落老化后表面呈皱褶状。不产假菌丝的酵母菌，其菌落更为隆起，边缘十分圆整，而产生假菌丝的酵母菌，则菌落较平坦，表面和边缘较粗糙，酵母菌的菌落，由于存在酒精发酵，一般还会散发出一股酒香。在液体培养基中生长时可使清亮的培养基变混浊，这点与细菌相似，但酵母菌也表现出一定的特征，如有些种类生长在培养基的底部，并产生沉淀物；有些在液体培养基中均匀生长；有些则生长在液面，产生不同的形态的菌醭，具有一定的分类意义。8.霉菌形态构造：菌丝 菌丝体 菌丝的特化 假菌丝 霉菌营养体的单位是菌丝霉菌的菌落 由粗而长的分枝状菌丝组成，菌落疏松，呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，比细菌菌落大几倍到几十倍，有的没有固定大小。各种霉菌，在一定培养基上形成的菌落大小、形状、颜色等相对稳定，所以菌落特征也为分类依据之一。繁殖方式 断片繁殖菌丝的断片可发育成新的菌丝体无性繁殖：孢囊孢子，分生孢子，厚垣孢子，节孢子有性繁殖：卵孢子，子囊孢子，接合孢子，担孢子担子菌的生活史上，菌丝体可分五个阶段： 初生菌丝（一级菌丝）担孢子萌发，形成由许多单核细胞构成的菌丝，称为。次生菌丝（二级菌丝）不同性别的一级菌丝发生接合后，通过质配形成了由双核细胞构成的。 通过“锁状联合”形成喙状突起而连合两个细胞的方式不断使双核细胞分裂，从而使菌丝尖端不断向前延伸。 三生菌丝（三级菌丝）到条件适合时，大量的二级菌丝分化为多种菌丝束，即为。子实体： 菌丝束在适宜条件下会形成菌蕾，然后再分化、膨大呈大型子实体。担孢子：子实体成熟后，双核菌丝的顶端膨大，其中的两个核融合形成一个新核，此过程称核配。新核经两次分裂（其中有一次为减数分裂），产生4个单倍体子核，最后在担子细胞的顶端形成4个独特的有性孢子，即。9.噬菌体噬菌斑（plaque）噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬菌斑（plague）,指在含宿主细胞的培养基上，噬菌体使菌体裂解而形成的空斑。Eg： 由噬菌体在菌苔上形成的“负菌落”即噬菌斑（plaque）；由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的空斑（plaque）；由植物病毒在植物叶片上形成的枯斑（lesion，病斑）。繁殖过程病毒不存在个体的生长过程，不是以二分裂繁殖，只有核酸和蛋白质的合成与装配。 噬菌体的繁殖一般分为5个阶段，即 ：吸附 侵入 增殖（复制与生物合成） 成熟（装配） 裂解（释放） 一步生长曲线 反映每种噬菌体的三个最重要的特性参数：潜伏期，裂解期，裂解量(1)潜伏期（latentphase）指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌体粒子装配前的一段时间，故整段潜伏期中没有一个成熟的噬菌体粒子从细胞中释放出来。不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。 (2)裂解期（risephase）紧接在潜伏期后的一段宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。 (3)平稳期（plateau） 指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高点后的时期。病毒的特点：对宿主具严格专一性，只能在活细胞内繁殖。 裂解量：每个敏感细胞受噬菌体侵染后能装配、释放出噬菌体的平均数量，称为裂解量。裂解量的数值相对稳定，如T4：100；174：1000；f2：10000；谷氨酸生产菌的噬菌体为50-150。温和噬菌体侵入相应宿主细胞后，噬菌体DNA 整合到宿主的基因组上，并随宿主的复制而进行同步复制，温和噬菌体侵入并不引起宿主细胞裂解的现象溶源性或溶源现象。溶源菌凡能引起溶源性的噬菌体即称温和噬菌体，温和噬菌体的宿主就称溶源菌（lysogen或lysogenic bacteria）。溶源菌是一类能与温和噬菌体长期共存的宿主细胞。 溶源菌的显著特性： 溶原性是溶源菌的一个极稳定的遗传特性； 自发裂解（spontaneous lysis） 10e-210e-5 诱导（induction）温和噬菌体的溶源性反应： 烈性噬菌体（virulent phage）：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lytic cycle）。 温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenic phage）：感染宿主细胞后不能完成复制循 环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。 这一现象称做溶源性（lysogeny）现象，在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体） 免疫性（immunity）即其它同类噬菌体虽然可以再次感染该细胞，但不能增殖，也不能导致溶源性细菌裂解。免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白可抑制原噬菌体的合成。 复愈性：溶源性细菌细胞内原噬菌体消失 溶源转变(lysogenicconversion)：原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他的表形改变，称为溶源转变溶源菌的识别检验某菌株是否为溶源菌的方法，是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌相混合，然后与上层琼脂培养基混匀后倒平板，经培养后溶源菌就一一长成菌落。由于溶源菌在细胞分裂过程中有极少数个体会引起自发裂解，其释放的噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔，于是就形成了一个个中央有溶源菌的小菌落，四周有透明圈围着的这种独特噬菌斑。亚病毒：凡在核酸和蛋白质两种成分中，只含其中一种的分子病原体，称为亚病毒（subvirus），包括类病毒、拟病毒和朊病毒3类。类病毒：是一类只含有RNA一种成分、专性寄生在活细胞内的分子病原体，为含246375个核苷酸的单链环状RNA分子。所有的类病毒RNA均无mRNA活性，不能编码蛋白质。目前只在植物体中发现。拟病毒：拟病毒又称类类病毒、壳内病毒或病毒卫星，是指一类包裹在真病毒毒粒中的有缺陷的类病毒。细菌，酵母菌，放线菌 菌落第三章 微生物的营养与生长营养：指生物体从外部环境中摄取对其生命活动必需的能量和物质，通过吸收利用以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。 第一节 微生物的营养营养物（nutrient）：指具有营养功能的物质，那些能够满足微生物机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需的物质。 营养物质的功能： 提供结构物质、提供能量、调节代谢、稳定生理环境。 一、微生物的营养物质微生物的营养物质应满足两个条件：（1）能直接或在胞外被水解成小分子物质通过细胞膜进入细胞；（2）进入细胞后在胞内的酶体系作用下直接或经化学变化后构成细胞的原生质和细胞结构物质，并为细胞生命活动提供能量。（一）水微生物生长所需的水活度通常在0.630.99之间，细菌水活度较高为0.8，酵母菌次之，耐旱的微生物水活度为0.6，水中溶质越高水活度越低。w过低时，微生物生长的迟缓期延长，比生长速率和总生长量减少。（二）碳源（carbon source） 1、定义：凡是可以作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，称为碳源。 大量营养物碳源谱：如把微生物作为一个整体来看，其可利用的碳源范围即碳源谱。 （二）氮源（nitrogen source） 1.定义：凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源，称为氮源。 氮源谱：如把微生物作为一个整体来看，其可利用的氮源范围即氮源谱。 铵盐是绝大部分微生物的有效氮源，吸收后能被直接被利用。铵盐 Eg.(NH4)2SO4作氮源，随着NH4+的消耗培养基的pH值下降，铵盐被称作生理酸性盐。硝酸盐也能被大部分微生物利用，但吸收后需被还原成NH3才能进入合成代谢； 硝酸盐Eg.KNO3为氮源培养微生物时，由于NO3-被吸收，会导致培养基pH升高，因而将其称为生理碱性盐.。在饼粉中，氮主要以大分子蛋白质形式存在，微生物需将其降解成小分子的肽和氨基酸后才可利用，故称迟效性氮源。有利于代谢产物的形成。在玉米浆、牛肉膏中的氮主要以蛋白质的降解物形式存在，可直接为菌体吸收利用，故称速效性氮源。有利于机体的生长。（四）能源（energy source）能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物质或辐射能，称为能源。在能源中，有些具体营养物可以同时兼有几种营养要素的功能如还原态的无机物NH4+即是能源又是氮源，是双功能营养物，而氨基酸则即是碳源、氮源、也是能源，是三功能营养物，而光辐射只提供能源，是单功能营养物。 (四) 生长因子（growth factor）1.定义 指微生物生长所需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。A.生长因子自养型微生物B.生长因子异养型微生物C.生长因子过量合成微生物 2.种类 广义的生长因子： 维生素、碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、 C4C6的分枝或直链脂肪酸，以及需要量较大的氨基酸； 狭义的生长因子：一般仅指维生素。（六）无机盐（mineral salts）1.定义 无机盐（mineral salts）或矿质元素主要可为微生物提供除碳、氮源以外的各种重要元素。 生理功能 参与细胞结构物质的组成；参与酶的组成及调节酶的活性；参与能量转移；调节并维持细胞渗透压的平衡；作为某些微生物的能源物质大量元素：凡是生长所需浓度在10-6 10-4molL范围内的元素 微量元素：凡所需浓度在10-610-8molL范围内的元素 二、微生物的营养类型 营养类型是指根据微生物生长所需要的主要营养要素即能源和碳源的不同，而划分的微生物类型。 1.光能无机营养型（光能自养型）能以CO2为主要唯一或主要碳源； 2.光能有机营养型 （光能异养型）不能以CO2为主要或唯一的碳源； 3.化能无机营养型（化能自养型）能量来自无机物氧化过程中放出的化学能4.化能有机营养型（化能异养型）能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能； 5.营养缺陷型（auxotroph）和原养型（prototroph）腐生型(metatrophy)：可利用无生命的有机物(如动植物尸体和残体)作为碳源； 寄生型(paratrophy)：寄生在活的寄主机体内吸取营养物质,离开寄主就不能生存； 兼性腐生型(facultive metatrophy),兼性寄生型(facultive paratrophy)。 三、营养物质的跨膜运输1.单纯扩散（简单扩散，simple diffusion） 扩散是非特异性的，不需载体蛋白协助，不消耗能量 2、促进扩散特点：物质运输动力是细胞内外的浓度差。运输过程不消耗能量。有膜载体参加，膜载体（渗透酶）有特异性。3.主动运送（active transport）（1）定义 主动运送指一类须提供能量（包括ATP、质子动势或“离子泵”等）并通过细胞膜上特异性载体蛋白构象的变化，而使膜外环境中低浓度的溶质运入膜内的一种运送方式。主动运送是逆浓度梯度运送营养物的方式，对许多生存在低浓度营养环境中的贫养菌（oligophyte，或称寡养菌）的生存极为重要。4.基团移位（group translocation）（1）定义 需特异性载体蛋白，耗能，溶质在运送前后还会发生分子结构的变化基团移位主要用于运送各种糖类、核苷酸、丁酸和腺嘌呤等物质。 四种运送营养物质方式的比较： 四、微生物培养基培养基是指由人工配制的、专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存用的混合营养物制品。碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水是六大营养要素 （一）培养基的要素工业微生物研究和和实验室中的无数培养基必须具备如下五个要素:（1）营养物质：要素：H2O C源+能源 N 源 P、S K、Mg生长因子 含量：(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6) A.选择适宜的营养物质,实验室的常用培养基： 细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌：查氏合成培养基； 实验室一般培养：普通常用培养基； 遗传研究：成分清楚的合成培养基； 生理、代谢研究：选用相应的培养基配方； B.营养物质浓度及配比合适 真菌需CN比较高的培养基；（素食） 细菌（动物病原菌）需CN比较低的培养基（荤食） 发酵生产谷氨酸时： 碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少； 碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。 （2）水的活度： 实际上是控制好培养基中可溶物质（特别是碳源）的浓度。（3）pH值细菌：pH 7.08.0放线菌：pH 7.58.5酵母菌： pH 3.86.0霉菌：pH 4.05.8藻类： pH 6.07.0原生动物： pH 6.08.0a.pH的外源调节:从外界流加酸或碱液，以调整培养液的方法。 b.pH的内源调节:通过培养基内在成分所起的调节作用，就是pH的内源调节。第一种是采用磷酸缓冲液进行调节。 第二种以CaCO3作“备用碱”进行调节。CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培养基中分布不均匀）、NaHCO3均可用来调节培养基的pH。（二）培养基的类型1、按基质的来源（天然培养基、组合培养基、半组合培养基） （1）天然培养基 优点：营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉 。 缺点：是成分不清楚、不稳定，不适宜做精细的科学实验。 （2）组合培养基高氏一号培养基、察氏培养基等。优点：成分精确、重演性高。 缺点：价格较贵、配制较烦，且微生物生长比较一般。 （3）半组合培养基 指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。 2、按物理状态1.液体培养基 适用于大规模的培养微生物。 2.固体培养基 根据固体的性质又可把它分为4种类型：(1) 固化培养基：常用的凝固剂：琼脂、明胶、海藻酸钠、脱乙酰吉兰糖胶、多聚醇F127等。 (2) 非可逆性固化培养基 指一类一旦凝固后不能在重新融化的固化培养基。(3)天然固态培养基 由天然固态基质直接配制成的培养基。 (4)滤膜是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜。若把滤膜制成圆片覆盖在营养琼脂或浸有营养液的纤维素衬垫上，就形成了具有固体培养基性质的培养条件。 作用：可用于菌种的分离、鉴定，菌落计数，检验杂菌，选种、育种，菌种保藏，抗生素等生物活性物质的生物测定，获取大量真菌孢子，以及用于微生物固体培养和大规模生产等。 3.半固体培养基一般可在液体培养基中加入0.5左右的琼脂制成。 作用：细菌的动力观察，微生物趋化性的研究，厌氧菌的培养、分离和计数，细菌和酵母菌的菌种保藏，以及噬菌体效价测定（双层平板法）等4.脱水培养基 指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要加入适量水分并加以灭菌即可，是一类既有成分精确又有使用方便等优点的现代化培养基。 3、按目的用途基础培养基：是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的（1）种子培养基 为了在较短时间内获得数量较多的强壮而整齐的种子细胞，需要使用种子培养基。种子培养基营养丰富、氮源充足（2）发酵培养基 发酵培养基适用于合成发酵产物的培养基。 （ 3）保藏培养基细菌：营养琼脂、LB培养基 放线菌：马铃薯培养基，高氏一号培养基酵母：麦汁培养基，YEPD培养基 霉菌：麦汁培养基、察氏培养基 （4）富集培养基和选择性培养基A、富集培养基：在普通培养基（如肉汤蛋白胨培养基）中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物。 常用于菌种筛选。B、选择性培养基在培养基上加入相应的特殊营养物质,利于所需微生物的生长或加入相应化学物质以杀死或抑制不需要的微生物，这样的培养基称为选择性培养基。 用于将某种微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。加富性选择培养基 广义：选择培养基包括加富培养基。 抑制性选择培养基 （5）鉴别性培养基最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即EMB培养基。EMB培养基常用作区别大肠杆菌和产气杆菌。EMB培养基中伊红和美蓝的作用伊红Y是一种红色酸性染料，美蓝是一种蓝色碱性染料。E.coli能强烈分解乳糖产生大量有机酸，菌体常带H+，故可染上酸性染料伊红，又因伊红和美蓝结合，所以菌落染上深紫色，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。伊红和美蓝两种苯胺染料还起着抑制G+细菌和一些难培养的G-细菌生长的作用；这两种染料在低酸度时结合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。（6）生理特性测定培养基是在鉴定微生物时，用于观察微生物的培养基特征，或观测其生理生化反应所采用的培养基。第二节 微生物的生长微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养。纯培养的分离方法 单细胞挑取法 选择培养基分离法 稀释倾注平板法 稀释涂布平板法 平板划线分离法 一、微生物生长的测定微生物生长：单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化。 微生物生长的测定： 个体计数、群体重量测定、群体生理指标测定 （一）测生长量 1.测生长量直接法 （1）测体积法：粗放型，在刻度离心管中测沉降量 （2）称干重法：精确型，离心法和过滤法获得菌体细胞，微生物的干重一般为其湿重的1020。 2.测生长量间接法(1)比浊法 用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定，一般选用600700nm波段。(2)生理指标法 常用于对微生物的快速鉴定与检测。一种特定的微生物，每一个细胞中的ATP浓度几乎是一个常数，所以测定这种微生物的ATP含量，即可知其细胞数。 ATP浓度的测定： 在这个反应系统中，酶、荧光素和O2都过量时，光的强度与ATP的量成正比。可用生物发光仪测定光照强度，从而换算出ATP的浓度。 （二）计繁殖数 单细胞状态的细菌和酵母菌计算各个体的数目 放线菌和霉菌等丝状生长的微生物计算其孢子数 1.繁殖数直接计数法(1) 计数板直接计数法 指采用计数板（细菌计数板或血球计数板），在光学显微镜下直接观察微生物细胞并进行计数的方法。1ml菌液中总菌数 ：A/525104B 或A/516104B缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌难以观察；(2)染色后活菌计数法 采用特定的染色技术进行活菌染色，然后用光学显微镜计数的方法。可分别对活菌和死菌进行计数。例：美蓝染色酵母 活细胞无色 死细胞蓝色 (3)比例计数法死细胞蓝 将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度(4)过滤计数法 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上（或一定面积中）的细菌数。 (5)Coulter 电子计数器 菌体与液体导电性不同, 一个细胞通过小孔,电阻增加,形成一个脉冲。(6)菌丝长度 平板 U行管 2.繁殖数间接计数法 是一种活菌计数法，这是一种依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落的原理而设计。 最常用的是菌落计数法（colony-counting methods）。 (1)平板菌落计数法 可用浇注平板（pour plate）或涂布平板（spread plate）等方法进行。此法适用于各种好氧菌或厌氧菌。 (2)膜过滤培养菌落计数法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。(3)厌氧菌的菌落计数法 二、微生物个体细胞的生长1、细菌的生长 细菌培养物在培养条件下度过的时间称为细菌的菌龄 2、酵母菌的生长 酵母菌主要的繁殖方式是出芽，酵母菌细胞的生长芽细胞的生长。 3、霉菌的生长 丝状真菌的生长时从孢子萌发开始的，以其菌丝顶端延长的方式进行的。当菌丝伸长到一定程度后就会出现分枝 三、微生物群体细胞的生长（一）微生物生长的描述微生物生长通常以细胞重量或细胞数倍增所需要的时间为表征。在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。 （二）生物群体生长的规律1、分批培养采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。 分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期 （1）延滞期（Lag phase）又称停滞期、调整期和适应期 A、延滞期的特点:分裂迟缓、代谢活跃 生长速率常数为零； 细胞形态变大或增长 原生质呈嗜碱性;细胞内RNA尤其是rRNA含量增高； 合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP合成加速，易产生各种诱导酶； 对外界不良条件敏感，如NaCI溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。B、迟缓期出现的原因: 调整代谢 C、生产实践中缩短延滞期的常用手段 a.改变菌种的遗传特性, 使延滞期缩短； b.利用对数生长期的细胞作为种子； c.尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； d.适当扩大接种量； （2）对数期 A、对数生长期的特点 生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间代时G或原生质增加一倍所需的倍增时间最短； 细胞进行平衡生长，菌体各部分的成分十分均匀； 酶系活跃，代谢旺盛；C、影响微生物增代时间（代时）的因素 菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同； 营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短，反之则长； 营养物浓度，营养物的浓度可影响微生物的生长速率和生长总量 ，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比； 培养温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。 3.稳定期（ stationary phase）又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速率常数R等于0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中 A、稳定期特点-细胞重要的分化调节阶段 (1)细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物； (2)芽孢杆菌在这时开始形成芽孢或建立自然感受态等； (3)有的微生物在稳定期时开始合成抗生素等次生代谢产物（secondary metabolites）稳定期产物（idiolites）。B、稳定期到来的原因 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，例如CN比值不合适等； 酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等理化条件越来越不适宜等。D、延长稳定生长期的方法： 生产上常通过补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。（4）衰亡期（ decline phase或death phase）A、衰亡期的特点：个体死亡的速度超过新生的速度，整个群体呈负生长；细胞形态多样，常可见畸形和衰退型的细胞；细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现菌体自溶；有些微生物在衰亡期产生或释放对人类有用的次生代谢物，如氨基酸、转化酶、外肽酶、抗生素等；产芽孢杆菌在此期中释放芽孢。B、产生衰亡期的原因 外界环境对继续生长越来越不利，Eg.营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累等，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。真菌的生长曲线大致可分3个时期，即生长延滞期、快速生长期、生长衰退期。 2、同步生长同步培养法：使培养物中所有微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养法，称为同步培养法。同步生长：通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的状态，即同时进行分裂的生长方式，称为同步生长。同步培养物：通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。（1）环境条件控制技术（诱导法）采用物理、化学因子使微生物细胞生长进行到某个阶段而停下来，使先到达该阶段的微生物细胞不能进入下一生长阶段，待全部群体细胞都到达该 生长阶段后，再除去该因子，使全部群体细胞同时进入下一个生长阶段，以达到诱导 微生物细胞同步生长的目的。机械筛选法根据微生物细胞在不同生长阶段的细胞体积与质量或根据它们同某种材料结合能力不同的原理设计出来的方法。离心法将不同步的细胞培养物悬浮在不被这种细菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通过密度梯度离心将不同细胞分布成不同的细胞带，每一细胞带的细胞大致是处于同一生长期的细胞，分别将它们取出进行培养，就可以获得同步培养。过滤分离法：将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同微孔滤器，从而将大小不同的细胞分开，分别将滤液中的细胞取出进行培养，获得同步细胞。硝酸纤维素膜法（膜洗脱法）根据某些滤膜可吸附与该滤膜相反电荷细胞的原理，让非同步细胞的悬液流经此膜，于是一大群细胞被牢牢吸附。然后将滤膜翻转并置于滤器中，其上慢速留下新鲜培养液，最初流出的是未吸附的细胞，不久，吸附的细胞开始分裂，在分裂后的两个子细胞中一个仍吸附在滤膜上，另一个则被培养液洗脱。若滤膜足够大，只要收集刚滴下的子细胞培养液即可获得满意的同步培养细胞。硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。 4、连续培养将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获；分批培养（batch culture）或密闭培养（closed culture） 培养基一次加入，不予补充，不再更换。连续培养（Continous culture ）：又称开放培养（open culture），在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。 重要特征：使微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态连续培养的类型按控制方式分：内控制（控制菌体密度）恒浊器 外控制（控制培养液流速及R）：恒化器按培养器串联级数分：单级连续培养器 多级连续培养器按细胞状态分：一般连续培养器 固定化连续培养器按用途分：实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：大型连续发酵罐1.恒化器连续培养在整个培养过程中 ，通过控制培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于最高生长速率的条件下生长繁殖的连续培养装置。2.恒浊器连续培养在整个培养过程中，根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养。连续发酵的优点：高效，简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；自控，即便于利用各种传感器和仪表进行自动控制；产品质量较稳定；节约了大量动力、人力、水和蒸汽，使水、气、电的负荷均衡合理。连续发酵的缺点：菌种易退化由于长期让微生物处于高速率的细胞分裂中，故即使其自发突变率极低，仍无法避免突变的发生，尤其当发生比原生产菌株营养要求降低、生长速率增高、代谢产物减少的负变菌株时；易污染杂菌，在长期的连续运转中，存在着因设备渗漏、通气过滤失灵等造成的污染；营养物的利用率一般低于单批培养。第四章微生物的代谢与调节及其人工控制生物能的产生1底物水平磷酸化 物质在生物氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物而这些化合物可直接