（制糖工程专业论文）猴头菌多糖的提取及理化性质的研究.pdf

中文摘要 摘要 猴头菌多糖是猴头菌的主要活性成分之，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血 脂、降血糖、抗突变、防辐射等作用。本文以猴头菌子实体为原料，对猴头菌多糖的提 取、脱蛋白、脱色以及多糖的一系列理化性质进行了研究。 本文对比了猴头菌多糖提取的几种方法，实验结果显示微波浸提效果较好。在单因 素实验的基础上，通过正交实验得到的优化实验工艺条件为：液料比l o ：l ，微波功率 4 8 0 w ，微波处理5 m i n 。 比较了s e v a g e 法和t c a 法脱蛋白的效果，发现t c a 法脱蛋白效果更好，实验以t c a 对猴头菌粗多糖脱蛋白，脱蛋白时t c a 的用量为o 1 ( 对浓度为1 的多糖溶液) 。 比较了活性炭脱色和h 。0 。脱色的效果，结果表明活性炭脱色效果更好，通过单因素 实验得到较好的实验工艺条件为：活性炭用量为1 ( 对浓度为1 的多糖溶液) ，脱色 温度为3 0 ，脱色时间为l h 。 通过s e p h a d e xg 一7 5 柱层析对猴头菌多糖进行分离纯化，得到较纯的猴头菌多糖， 此多糖的相对分子质量为2 0 9 9 6 ，对其进行气相色谱分析，结果表明：此猴头菌多糖由 葡萄糖、d 一半乳糖、l 阿拉伯糖及d 甘露糖组成。 探讨了猴头菌多糖的溶解性及粘度特性。多糖溶解性实验表明，猴头菌多糖溶解性 受温度影响较大，低温难溶，溶解性受酸、碱以及盐的影响较小。多糖粘度特性实验表 明猴头菌多糖溶液的粘度随其浓度的增大而增大，随其温度的升高而降低，对热处理具 有一定的稳定性，在酸性或碱性条件下粘度略有降低，在剪切作用下粘度下降，剪切作 用消失粘度可恢复。 本文把猴头菌多糖与其它几种物质分别配成混合溶液，结果表明猴头菌多糖与其它 物质相互作用既可产生稀化现象又可产生增稠现象。 关键词：猴头菌多糖提取脱色溶解性粘度特性 英文摘要 a b s t r a c t h 8 r f c f “me 一，l 口c e “sp o l y s a c c h a r i d e s ( h e p s ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a ma n dm a i n a c t i v a t e dc o m p o n e n t so f 矗p r f c m m8 ，加口c e “sp e r s ，h e p sh a sm a n yb i 0 1 0 画c a la c t i v i t i e s i nt h i s p a p e r t h es y s t e m a t i c s t u d i e s r e l a t e dt od i f r e r e n te ) 【t r a c t i o n m e t h o d s ，p u r i f i c a t i o na n d p h y s i c o c h e i l l i c a lc h a r a c t e r so f 玎弹sw e r ec a m e do u t 、 、，豇i o u se ) ( t r a c t i o nm e t h o d so f h e p sw e r es t u d i e dc o m p a r a t i v e ly t h er e s u l t s8 h o w e dt h a t m i c r o w a v e a s s i s t e de ) ( t r a c t i o nw a sb e t t e rt h a no t h e re ) ( t r a c t i o nm e t h o d st h eo d t i m u m c o n d i t i o n so b t a i n e db yo n h o g o n a le x p e r i m e m sw e r ea sf o l l o w s ：t h er a t i oo fl i q u i dt os o l i d ， 1 0 ：1 ；r n i c r o w a v ep o w e l4 8 0 w ；e ) ( t r a c t i o nd u r a t i o n ，5 i n i n t w om e t h o d s ( s e v a g em e t h o da n dt c am e t h o d ) t od e p r o t e i nf r o mc m d eh e p sw e r e s t u d i e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e1 a t e rw a sm o r ee 髓c t i v e ，t h ed o s a g eo ft c a w a so1 r e l a t i v et ot h e 珀ss o l u t i o n t h ed e c o i o r a t i o no fa c t i v ec a r b o na n dh 2 0 2w e r es t u d i e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta c t i v e c a r b o nw a sm o r e 豳c t i v et od e c o i o r 旺p s ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t h e d o s a g eo fa c t i v ec a r b o n ，1 ；t h ed e c o i o r a t i o nt e m p e r a t u r e ，3 0 ；t h ed e c o i o r a t i o nd u r a t i o n ， l h t h eh e p sw a sp u r i f i e db ys e p h a d e xg 一7 5c o l u m n ，t h em 0 1 e c u l a rw e i g h to fp u r i n e d h e p sw a s2 0 9 9 6t h eg a sc h m m a t o g r a p h ya n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eh e p sw a sc o m p o s e do f a u c o s e ，d g a l a c t o s e ，l 舡曲i n o s ea n dd m a n n o s e t h es 0 1 u b j 】j t ya n dv j s c o s i t yo fh e p sw e f es t u d i e dt h es o l u b i j i t vo fh e p sw a sr e l a t i v e t ot 1 1 et e m p e r a t u r e 皿p sw a sh a r dt od i s s o 】v ea t1 0 wt e m p e r a t u r e ，t h ee 肫c to fa c j d a l k a j j a n ds a l to ns o l u b i l l t yo fh e p sw e r em i k l e x p e m e n t ss h o w e dt h a tt b ev j s c o s i t yo fh e p s s o l u t i o n s y s t e m i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fc o n c e n t r a t j q no rt h e d e c r e a s j n g o f t e m p e r a t u r e ，i td e c r e a s e ds l i g h t l ya ta c i d i co ra l k a l i n ec o n d i t i o na n dd e c r e a s e dw h e nw a s s h e a r e d w h e nt h e ! p sa n do t h e rp 0 1 y s a c c h a r i d e sw e r ec o n c o m i t a n ti nt h es o l u t i o n ， t h e v i s c o s i t yo f t h es y s t e mc o u l di n c r e a s eo rd e c r e a s e k e yw o r d s ： 胁，f c m 肌p ，f ，船c p 甜sp o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t i o n d e c o l o r a t i o n s o l u b i l i t y s c o s 时 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期：砂n 年月肛日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名：熏数 日期：沙年月侈日 江南大学硕士学位论文 第一章绪论 1 o 引言 猴头菌( 陀r 地f “me ，破c e “5 ) 在分类学上隶属菌物界( k i n g d o mf u n g i ) ，担子菌门 ( b a s o m y c o t a ) ，猴菇目( h e r i c i a l e s ) ，猴菇科( h e r i c i a c e a e ) ，猴菇属( h e r i c i u m ) 。由于 其子实体形状像猴子的脑袋，且颜色像猴子的毛，故取名“猴头”。各地人们对猴头菌 的叫法不一，因而又有如下别名：猴头、猴菇、猴菜、猬菌、猴头菌、阴阳蘑、对脸蘑、 花菜菌m ”。 1 1 猴头菌的生态特点 猴头菌属于腐生菌，野生猴头菌多生长在深山密林中阔叶树的腐木或立木的受伤 处，主要树种有橡树和胡桃等，少数见于松树和桦树上。野生猴头菌在我国主要分布在 东北大兴安岭，西北的天山和阿尔泰山，内蒙、河南、河北、四川、湖北、广西、浙江 等省区也有生产，在国外，美国、日本、原苏联和西欧等均有生产【4 j l 。 猴头菌由子实体和菌丝体组成，子实体生长在基物表面，为生殖器官，是供人们食 用的部分，子实体鲜时为白色，干后由浅黄色至褐色，基部狭窄或略有短柄，菌丝体为 白色，是营养器官，生长在基物内，能够分解基质，吸收营养成分形成子实体1 6 】。 猴头菌属低温型食用菌，生长温度范围为1 0 3 4 ，子实体生长温度低于菌丝体 生长温度，菌丝体的最适生长温度为2 1 2 4 ，子实体的最适生长温度为1 5 1 8 ”j 。猴头菌是好光性菌类，子实体必须有光照才能良好生长，但应是散射光，直射光对 子实体生长有抑制作用，菌丝体可在黑暗环境下生长，光照会抑制其生长，但光照是菌 丝体分化为子实体不可缺少的条件【嚣】。猴头菌的菌丝体生长对空气要求不严格，但子实 体对通风要求严格，二氧化碳浓度过高将抑制其生长【9 l 。 猴头菌的繁殖方式分为无性生殖和有性生殖两种，有性生殖经过担孢子一菌丝体一 子实体一担孢子几个连续发育阶段，无性生殖是从菌丝体一子实体。猴头菌完成整个生 活史在自然条件下要相当长的时间，子实体在人工培养条件下有性生殖要4 1 2 个月， 且子实体小，无性生殖只需要2 0 天左右1 1 0 1 1 】。 1 2 猴头菌的营养价值和药用价值 猴头菌肉嫩味美，营养丰富，很早以前人们把它与熊掌、海参、鲨鱼翅并列为“四 大名菜”，有“山珍猴头，海味燕窝”的美称，在古代被作为贡品【”l 。 研究结果表明，猴头菌属于高蛋白低脂肪食用菌，对猴头菌子实体及菌丝体中氨基 酸含量分析发现，猴头菌中氨基酸种类丰富，含有多种人体必需的氨基酸，另外猴头菌 第一章绪论 中含有多种维生素与微量元素，它的蛋白质和磷、钾、镁等矿物质含量与其它食用菌品 种相比都居前位”j 。据分析，猴头菌干品所含的营养物质如表1 一l 所示： 表i i 猴头菌主要营养成分1 日 1 铀l - 1t h em a i nn u 仃i t i o nc o m l p o n 锄临o f m 玎c m 研e r 加口c p 凇p e r s 猴头菌性平、味甘，能利五脏、助消化、滋补、抗癌、治疗神经衰弱等，国内已经 广泛用于医治消化不良、胃溃疡、食道癌、胃癌、十二指肠癌等消化道系统的疾病与肿 瘤【l “。猴头菌在医学上主要有如下几方面的价值：( 1 ) 抗溃疡和抗炎症作用；( 2 ) 抗肿瘤 作用；( 3 ) 抗衰老作用；( 4 ) 抗疲劳作用；( 5 ) 提高肌体耐缺氧能力；( 6 ) 增加心肌血 液输出量，加速机体血液循环；( 7 ) 降血糖作用；( 8 ) 保护肝脏作用：( 9 ) 降血脂降血 压作用等。 1 3 猴头菌活性成分研究进展 已研究报道的猴头菌活性成分主要有多糖、甾醇类、萜类、脂肪酸、酚类等化合物 其中猴头菌多糖一直是研究的焦点。 1 3 1 多糖类物质 猴头菌中糖类物质主要以多糖、糖蛋白及糖苷的形式存在，根据存在的部位可分为 胞内多糖、胞外多糖和细胞壁多糖，总含量在2 0 左右，不同的分析样品( 如子实体、 菌丝体和发酵浸膏等) 其测定结果差异很大，此外，猴头菌种不同及生长条件不同都会 影响其含量i l ”。多数研究认为，猴头菌多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖组成，以葡萄糖 为主，是由b ( 1 3 ) 键连接的主链和b ( 1 6 ) 键连接的支链构成的葡聚糖【1 9 2 “。 1 3 2 萜类物质 除多糖成分外，近年来猴头菌的非糖成分越来越引起关注，在萜类物质的研究中， 主要是日本和欧美些国家开展的比较多，研究的内容主要是c y a t h a n e 骨架类型的二萜 江南大学硕士学位论文 类化合物。k a w a g i s h ih 等从猴头菌中提出3 种c y a t h a n e 骨架类型的二萜类化合物，这 些化合物多数以木糖苷的形式存在2 ”。上海医药工业研究所谢斐君是国内较早开展猴头 菌化学成分研究的学者，1 9 8 2 年从猴头菌培养物中首次分离出以齐墩果酸为苷元的三萜 类物质( 2 2 j 。 1 3 3 酚类物质 猴头菌中酚类物质种类也很多，有的是神经生长因子合成的促进剂，有的有细胞毒 作用，表现出抗肿瘤活性，有的是植物花粉生长的抑制剂2 ”。 1 3 4 甾醇类物质 日本学者1 址a i s h i ，y ( 1 9 9 1 ) 从猴头菌子实体中分离出麦角甾醇葡萄糖苷化合物【2 5 】。 近年来国外研究表明，甾醇类物质对胃黏膜有保护作用，猴头菌药物产品对胃炎、十二 指肠溃疡等有较好疗效，可能与猴头菌中的甾醇类物质有关。 i 3 5 脂肪酸类物质 除具有营养作用的脂肪酸类物质外，在猴头菌中还发现一些具有某些特殊作用的脂 肪酸类化合物，k a w a g i s h ih ( 1 9 9 0 ) 从猴头菌子实体中提取出四种十八碳烯酸衍生物，它 们在农业上对茶树花粉生长有抑制作用2 6 1 。 1 4 猴头菌的开发应用 国外对猴头菌做过研究的主要是日本，日本从猴头菌子实体中提取有效的成分，开 发研制了c y a t h a n e 制剂并用于医药。经临床医学研究证实，菌丝体和子实体的效果完全 相同【2 ”。目前市场上流通的用猴头菌开发的医药品有：山珍精、猴菇菌片、胃乐宁、胃 乐新和猴头浸膏 2 q ；用猴头菌开发的饮品有：金针菇猴头菌口服液、猴头粒粒露、猴头 补酒、猴头露、太阳神猴头菌口服液；用猴头菌开发的其它食品有：猴头罐头、猴头燕 窝、猴头晶、猴头强化健身粉、猴头强力营养粉、猴头乳晶、猴头肉松、猴头蜜饯、冰 糖猴头等”j 。 1 5 真菌多糖研究进展 多糖是来自于高等植物、动物、微生物细胞膜和细胞壁的天然大分子物质，是所有 生物有机体的重要组成成分与维持生命所必须的结构材料，人们对多糖的认识首先是把 它看作食物中的能量来源【3 1 ”】。近几十年来，由于相关研究包括膜的化学功能、免疫物 质的研究以及对新药物资源的寻找等，人们发现多糖类在物质体中不仅是作为能量资源 或结构材料，更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动，具有许多方面的生物活 性，多数无毒，是比较理想的药物，如香菇多糖、银耳多糖、灵芝多糖、酵母葡聚糖、 茯苓多糖、枸杞多糖等具有增强免疫功能和抗癌等作用阢“l 。近十几年来，糖类结构测 第一章绪论 定和生物活性研究取得了明显进展，大量实验事实揭示糖类是重要的信息分子，参与许 多生理和病理过程，有关研究渗透到各个领域。随着现代医学研究的进步以及糖类合成 化学和结构鉴定技术的发展，人们逐步认识到寡糖和多糖的结构涉及到许多生命历程 【3 5 】。 由于多糖是自然界中含量最丰富的多聚物以及其特有的性质，它们很早就应用于医 药领域。如淀粉、糊精等多糖，无毒无副作用，可被淀粉酶降解，是药物理想的赋型剂； 琼脂作为微生物培养基早己广泛应用：又如植物车前种子中的粘液质多糖具有很强的吸 水性，在民间用于治疗腹水。总的来说，多糖的应用可分为两类，一类是利用多糖独特 的理化性质，如易形成凝胶、高渗透压、高粘度和吸水性来制备医药材料、药物缓释剂、 血浆代用品等；另一类是利用多糖的抗原性、抗肿瘤等生物功能或活性制备疫苗或新药。 此外，多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用3 7 3 8 3 9 】。 近年来，多糖的研究逐步活跃起来，其中，一些分子量在几千以上，具有很强生物 活性的活性多糖的研究受到日益重视，它们的生理功能、化学结构以及构效关系等正成 为多糖研究的前沿阵地，取得了很大进展，而关于多糖分离、纯化和结构测定的方法也 不断发展和完善。 1 5 1 真菌多糖的提取 真菌多糖的提取原料按来源可以分为子实体、固体菌丝体、液培菌丝体、液培发酵 液、菌核等几类，提取的方法按提取溶剂的不同可以分为热水浸提法、酸提法、碱提法、 有机溶剂提取法、双酶提取法、复合酶提取法等f 4 。其中较常用的是水提法和碱提法， 当用稀碱液提取时，常加入硼氢化钠或硼氢化钾防止多糖降解。真菌多糖提取前，可用 酶、微波、超声波或低温冻融等方法使细胞破碎，提高多糖的溶出率，然后用乙醇、乙 醚等有机溶剂处理来脱脂和使糖苷酶失活，减少多糖的降解1 4 1 ，4 2 l 。 1 5 2 真菌多糖的分离 a 、除蛋白f 4 3 ，“，4 钉除蛋白质一般有以下几种方法：s e v a g e 法：粗多糖溶液加入少 量的s e v a g e 试剂( 氯仿：正丁醇= 4 ：1 ) ，剧烈振荡2 0 3 0 m i n ，蛋白质与s e v a g 试剂生成凝 胶物而被分离；三氯乙酸( t c a ) 法或鞣酸法：两者均为蛋白质沉淀剂，可除去游离蛋 白：乙酸锌和亚铁氰化钾法：利用两者生成的氰亚铁酸锌沉淀来吸附除去蛋白质： 三氟三氯乙烷法：按多糖溶液：三氟三氯乙烷为l ：1 加入，低温搅拌1 0 m i n ，离心，得上 层水相，水相重复上述操作几次即可，此法除蛋白效率较高：中性醋酸铅法：利用铅 离子能与很多离子结合，生成絮凝沉淀物，同时吸附除去蛋白质：蛋白酶法等。 b 、除色素i 4 1 1 除色素的方法：活性炭吸附法：此法脱色较彻底，但会造成多糖 的损失，原因可能是部分多糖和活性炭吸附结合之故；离子交换法：利用弱碱性树脂 来吸附色素，此法对游离的负性离子色素有效，对与糖结合的色素则效果不佳；氧化 脱色法：以浓氨水调p h 至8 o 左右，滴加少量3 h 2 0 ：溶液，可将色素氧化脱除；金属 络合物法等。 江南大学硕士学位论文 c 、除低聚糖、氨基酸等小分子物质1 4 叼利用半透膜逆向流水透析可除去低聚糖、 单糖、氨基酸、盐类离子等小分子杂质；柱离子交换法；纤维滤器透析法等。 l 。s 3 真菌多糖的纯化及纯度鉴定 真菌多糖的纯化有以下方法1 4 4 】：分级沉淀法：用不同浓度的沉淀剂如甲醇、乙醇、 丙酮等来分级沉淀纯化多糖：季铵盐沉淀法：常用的季铵盐是十六烷基三甲基胺溴化 物( c t a b ) 及其碱( c t a o h ) 和十六烷基吡啶：盐析法：常用的盐析剂有硫酸铵、氯化钠、 氯化钾、醋酸钾等：金属络合物法：常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和 醋酸铅等；层析法：有纤维素柱层析、纤维素阴离子交换树脂柱层析、凝胶柱层析、 高压液相柱层析：超滤法：制备性区域电泳法等。 对纯化后的多糖进行纯度鉴定可以采用：凝胶柱层析法：根据多糖分子量范围， 选择适当的凝胶型，通过检测洗脱液是否存在单一对称峰来判断；高压电泳法：多糖 纯度鉴定较为直观，多糖为单一带则为纯多糖：高压液相色谱法；超离心法；旋 光测定法。 1 5 4 真菌多糖的结构分析方法 真菌多糖结构分析的内容和方法h7 l ：单糖组成和分子比例：采用酸水解，水解产 物用纸色谱、薄层色谱、气相色谱或高压液相色谱分析：吡喃环或呋喃环形式：采用 红外光谱法；糖苷键位置：甲基化、气相色谱和质谱法联用；单糖残基顺序：采用 甲基化、高碘酸氧化、s m it h 降解、核磁共振和质谱联用：q 一，p 一异构体：糖苷酶 水解、核磁共振、红外光谱、喇曼激光光谱法分析：构象分析：x 射线。 1 5 5 真菌多糖的展望 真菌多糖作为一类重要的生物活性物质，在对一些人类疑难病症的治疗方面己显示 出很好的疗效。国内研究工作者在真菌多糖的分离纯化、生物活性和化学组成方面做了 大量的工作，而在结构方面的研究则与日本等国家的研究还有一定差距，对多糖的活性 机制和构效关系的解释还不够完善。真菌多糖的结构研究将是今后研究的重点，也是难 点，可以利用现有化学、物理学和生物学等分析技术和现代化的分析检测仪器对真菌多 糖的分子结构进行深入研究，在此基础上探讨真菌多糖的构效关系、量效关系及作用机 理，从而修饰和改造多糖，更大地发挥真菌多糖的功效，为人类的健康做出更多的贡献。 1 6 猴头菌多糖的研究进展 1 6 1 猴头菌多糖药理活性研究 经总结，猴头菌多糖主要有以下几个方面的药理作用： 1 6 1 1 免疫调节作用 免疫应答包括机体的非特异性免疫应答( 即巨噬细胞的吞噬功能) 和抗原诱导的特异性 第一章绪论 免疫应答( 即主要由琳巴细胞介导的细胞免疫和体液免疫) 。有实验结果表明，猴头菌 多糖能明显提高自然杀伤细胞的活性，促进细胞代谢和细胞增殖，促进t 细胞中介的迟 发型超敏反应的发生，增强巨噬细胞的吞噬功能，因此，猴头菌多糖既有非特异性免疫 功能又有特异性细胞免疫功能，因而初步认为猴头菌多糖是一种作用较为广泛的免疫增 强剂和免疫调节剂，在一般疾病治疗中可作为增强机体抵抗力的辅助药物【4 8 ，4 9 1 。 1 6 1 。2 抗肿瘤作用 多糖类成分抑制肿瘤生长己越来越被人们所重视，多糖作为药物，其细胞毒性小，在肿 瘤治疗时，它不像一般化学药物直接杀伤肿瘤细胞，而是作为种生物反应调节剂，促 进细胞和体液免疫反应，来达到抑制和消灭肿瘤细胞的效果。实验以移植的s 1 8 0 肉瘤 观察了猴头菌多糖的抗肿瘤效果，结果显示其可显著抑制s 1 8 0 肉瘤的生长，表明猴头 菌多糖具有抗肿瘤作用m 5 “。 1 6 1 3 抗衰老作用 自由基学说是衰老重要学说之，自由基在细胞代谢过程中不断产生，有很强的活 性，可与细胞膜脂质作用产生过氧化脂质，从而破坏细胞膜的结构，并使蛋白质形成交 联聚体而失活，而s o d 可消除自由基的产生【”j 。随着年龄增长，机体衰老，s o d 含量 明显下降，实验表明，猴头菌多糖可增加小鼠脑和肝脏中s o d 的活力，从而起到抗衰 老作用。脂褐质是人和动物老化代谢的废产物，随着年龄增长，它不断在细胞中积累， 可使细胞萎缩衰亡，猴头菌多糖能明显降低果蝇和小鼠心肌脂褐质含量。此外，猴头菌 多糖能增强果蝇飞翔能力，有一定抗疲劳作用。 1 6 1 4 降血糖作用 猴头菌多糖对正常小鼠和四氧嘧啶所致糖尿病小鼠均有降低血糖作用，研究表明猴 头菌多糖能明显对抗四氧嘧啶对b 胰岛细胞的损伤，对小鼠糖尿病有预防作用和明显的 疗效【5 3 】。 1 6 1 5 抗凝血和降血脂作用 根据损伤学说，动脉粥样硬化首先是由高血脂使动脉内膜受损伤而引起的，实验表明， 猴头菌多糖在体内和体外均有明显的抗凝血和降血脂作用，对防治心血管疾病具有重要 意义。 1 6 1 6 抗突变作用 实验表明猴头菌子实体多糖和菌丝体多糖对致突变剂环磷酰胺所引起的染色体损 伤均有对抗作用，表明猴头菌多糖有抗突变作用【5 u 孔。 1 6 1 7 抗辐射功能 猴头菌多糖对受y 射线照射的小鼠有明显的辐射防护作用，猴头菌多糖照前给药防 护效价优于照后给药1 5 ”。照后给药仍有效，效价虽低于照前，但在照后给药很少有效的 抗辐射药物中具有重要意义。猴头菌多糖对受照小鼠的造血组织有明显的防护作用，猴 头菌多糖对小鼠的辐射损伤有明显的防护作用可能是与其提高机体免疫功能，增强免疫 调节和保护造血组织有关。 江南大学硕士学位论文 1 6 2 猴头菌多糖理化性质的研究 徐锦堂在中国药用真菌学一书中指出，经气相色谱分析，猴头菌多糖是由葡萄 糖、半乳糖和甘露糖组成的，以葡萄糖为主，它是由p ( 1 3 ) 键连接的主链和b ( 1 6 ) 键连接的支链构成的葡聚糖，相对分子量为4 万口”。石永民等的研究认为猴头菌 子实体多糖是由等量的葡萄糖和半乳糖组成的，他还认为猴头菌多糖组分之所以不同是 由猴头菌品种不同和分析方法不同所致p ”。杨炎等对猴头菌子实体多糖的气相色谱分析 表明，其单糖组成为葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖，菌丝体多糖的单糖组成略有 不同，主要是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。李坤艳对猴头菌菌丝体多糖 的化学研究表明，不同多糖均一体，其单糖组成不同。黄莉萍分析小刺猴头菌深层培养 发酵的菌丝体多糖的单糖构成比例为葡萄糖：甘露糖：半乳糖= 2 02 ：52 ：1 ，并与同一株复 原的子实体多糖比较，除多糖含量不同外，单糖组成比例相同。 史军花等对猴头菌发酵菌丝水溶性多糖h p a 的结构进行了研究，推断旧a 可能具有以 下结构：它的主链由葡萄糖残基以( j 一4 ) 糖苷键连接，平均每8 个残基上有1 个分枝，分 枝点在o - 3 上，分枝末端残基为g l c ，多糖h p a 分枝率为1 2 5 ，而且含有l 一3 糖苷键1 5 9 j 。 王昭晶等对小刺猴头菌子实体水溶性多糖h p i 的结构研究表明h p i 的主体结构由g a l 组 成，主链无二甲基g l c 连接方式，而只有g a l 二甲基，即l 一2 ，6g a l 连接方式，其中以 ( 1 6 ) g a i 为主，在。一2 处有分枝，平均每3 个己糖残基有1 个分枝残基，主链分支点率为 3 3 f 6 。 1 7 立题背景和意义 真菌多糖作为一类重要的生物活性物质，是目前公认的有较高疗效的免疫增强剂， 国内外学者对真菌多糖的制备、结构、合成、药理学、临床学等方面做了很多工作，其 多方面的生物活性已经得到开发和应用，云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、茯苓多糖等 多种真菌制剂已取得了较好的临床效果。但是，由于目前分离到的真菌多糖大多数都是 一些杂多糖，加之生长环境、提取分离技术的不同造成多糖结构及活性的差异，这都给 其进一步的研究带来了困难，使在分子水平上阐明它们的药理作用和作用机制受到了限 制。另外，虽然不少真菌多糖已应用于临床，但由于其结构不明确，质量难以控制，造 成药效重复性较差，不符合国际规范，因而难以在医药领域占主要地位。所以，真菌多 糖的分离纯化和结构分析，是对真菌多糖进行研究和开发的基础。 猴头菌性平、味甘，能利五脏、助消化、滋补、抗癌，国内已经广泛用于医治消化 不良，胃溃疡，十二指肠癌等消化道疾病与肿瘤。在对猴头菌的开发应用方面，日本己 从猴头菌子实体中提取了有效成分，开发研制了c v a t h a n e 制剂用于医药，目前国内临床 常用猴头菌复方制剂或与其它药合用。在国内市场上还有用猴头菌或其发酵原料生产的 保健品、食品和饮品等，这些猴头菌制品不仅口味鲜美，而且对人体具有免疫调理的功 能，具有较大的开发应用前景。 由于猴头菌及其多糖广泛应用与食品、医药、饲料、保健品、化妆品等领域，市场 第一章绪论 需求量越来越大，因此本课题对其进行了多方面的研究。 1 8 本课题的研究内容 1 8 1 猴头菌多糖提取方法的研究 猴头菌多糖的热水浸提 猴头菌多糖的盐( n a c l ) 法浸提 猴头菌多糖的碱( n a 0 h ) 法浸提一 猴头菌多糖的微波浸提 1 8 2 猴头菌粗多糖脱蛋白与脱色的研究 s e v a g e 法脱蛋白 三氯乙酸( t c a ) 法脱蛋白 活性炭脱色的研究 h 2 0 2 脱色的研究 1 8 3 猴头菌多糖的分离纯化及结构的初步分析 柱层析法分离纯化猴头菌多糖 猴头菌多糖的红外光谱分析 气相色谱法分析猴头菌多糖的单糖组成 1 s 4 猴头菌多糖溶解性、粘度特性及其它性质的分析 猴头菌多糖溶解性的研究 猴头菌多糖水溶液粘度特性的研究 猴头菌多糖与其它几种物质相互作用的初步研究 江南大学硕士学位论文 第二章猴头菌多糖提取方法的研究 2 1 引言 猴头菌多糖是猴头菌的一种重要功能性成分，已被证实具有增强巨噬细胞吞噬功 能，促进溶血素形成，增加体液免疫功能，抗白细胞下降，抗衰老，抗凝血，降血糖， 降血脂和抗突变等功能，己应用于医药、功能性食品、饲料、化工等行业1 6 ”。 目前多糖的提取主要采用热水浸提、碱溶液浸提、盐溶液浸提以及酶法浸提等，微 波浸提技术是近年发展起来的，已被应用于多种植物和真菌有效成分的提取，利用微波 技术提取猴头菌多糖尚未见报道。本文对猴头菌多糖的几种浸提方法进行了比较研究。 2 2 实验材料与仪器 2 2 1 材料与试剂 主要材料： 猴头菌子实体 主要试剂： 试剂名称规格 苯酚a r 浓硫酸 a r 3 ，5 一二硝基水杨酸 a r 9 5 乙醇 a r n a c la r n a o ha r 丙三醇 a r 葡萄糖a r 产于福建古田 生产厂家 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 蚌埠市化学试剂厂 上海试剂一厂 2 2 2 主要实验仪器 仪器名称型号生产厂家 粉碎机 x a l 江苏金坛市环字科学仪器厂 分样筛4 0 目杜浦正鹤纱网厂 电子天平 f a l 0 0 4 上海津科天平厂 格兰仕微波炉 d 8 0 1 7 c t l 一2 h 广东格兰仕集团有限公司 真空干燥箱 z k 一8 2 a 上海实验仪器厂 离心机l x j i i江苏江阴矿山机械厂 紫外一可见分光光度计 u v 7 5 5 b 上海精密科学仪器有限公司 数显恒温水浴锅 旧一4 江苏省金坛市荣化仪器有限公司 第二章猴头菌多糖提取方法的研究 旋转蒸发仪 r e 一5 2 循环水式多用真空泵 s 既一i i i 上海亚荣生化仪器厂 郑州长城科工贸有限公司 2 3 实验方法 2 3 1 猴头菌予实体主要成分的测定【6 2 1 2 3 1 1 水分含量测定：直接干燥法一 2 3 1 2 脂肪含量测定：索氏抽提法 2 3 1 3 蛋白质含量测定：凯氏定氮法 2 3 2 猴头菌多糖提取工艺条件的确定 2 3 2 1 常规热水提取工艺 准确称取一定质量的猴头菌子实体干粉( 过4 0 目筛) 一放入圆底烧瓶，加入适量去 离子水并混匀一按各种设定条件( 提取温度、提取时间、提取次数) 进行提取一离心， 得上清液( 3 5 0 0 r p m m i n ，1 5 f i l i n ) 一测定提取液中多糖的浓度一上清液按设定条件( 浓 缩比、乙醇沉淀多糖时的终浓度) 进行醇沉多糖一测定粗多糖得率。 各种条件的选择与比较采用单因素实验与正交优化实验。 2 3 2 2 盐溶液提取多糖 准确称取一定质量的猴头菌子实体干粉，按设定浓度用盐溶液( n a c l 溶液) 浸提，其 它条件同热水浸提，测定不同浓度盐溶液浸提所得粗多糖得率及粗多糖中多糖含量。 2 3 2 3 碱溶液提取多糖 准确称取一定质量的猴头菌子实体干粉，按设定浓度用碱溶液( n a o h 溶液) 浸提，浸 提温度为6 0 ，其它条件同热水浸提，测定不同浓度碱溶液浸提所得粗多糖得率及粗多 糖中多糖含量。 2 3 2 4 微波提取工艺条件 准确称取一定量猴头菌子实体干粉一放入圆底烧瓶，加入适量去离子水并混匀一按 各种设定条件( 浸泡时间、微波功率、微波处理时间) 进行微波处理一离心，得上清液 ( 3 5 0 0 r p m m i n ，1 5 m i n ) 一测定上清液中多糖的浓度一上清液同热水浸提同样条件进行 醇沉多糖一测定粗多糖得率。 各种条件的选择与比较采用单因素实验与正交优化实验。 2 4 分析方法 2 4 1 总糖测定 总糖测定：苯酚一硫酸法吲 ( d 原理 苯酚一硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸( 或甲苯衍生物) 起显 色反应，己糖在4 9 0 n m 处( 戊醇及糖醛酸在4 8 0 n m ) 有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关 江南大学硕士学位论文 系。 ( 2 ) 溶液的配制 浓硫酸：分析纯 8 0 9 6 苯酚：称取8 0 o o 克苯酚，加2 0 o o m l 水在烧杯中使之溶解，移入棕色瓶中密封， 可置冰箱中避光长期保存。 6 苯酚：使用前以8 0 苯酚配制。 标准葡萄糖：将无水葡萄糖于l 0 5 烘干至恒重。 ( 3 ) 标准曲线的绘制及样品的测定 a ：制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖2 0 m g 于5 0 0 m l 容量瓶中，加水至刻度，摇匀。 分别吸取o 4 、o 6 、0 8 、1 o 、1 2 、1 4 、1 6 、1 8 m l ，各补水至2 o i i l l ( 含标准糖分 别为1 6 、2 4 、3 2 、4 0 、4 8 、5 6 、6 4 、7 2pg ) ，然后加入6 苯酚1 o m l 及浓硫酸5 0 1 1 l l ，静 置1 0 分钟，摇匀，室温放置2 0 分钟后于4 9 0 n m 处测吸光度，以2 0 f f i l 水按同样显色操作为 空白，以所含标准糖微克数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得标准曲线如图 2 一l 所示： 0 6 o 5 0 4 世 絮03 督 02 0l o o2 04 06 08 0 糖微克数 图2 一l 苯酚一硫酸标准曲线 f i g2 一lt h es t m l d a r dc l l r v eo fp 1 1 e n 0 卜s u l n j r i ca c i d b ：样品总糖含量测定：将样品准确稀释合适的倍数，吸取1 o i i l l 溶液( 相当于4 0u g 左右的糖) ，按a 步骤操作，测量其吸光度值，以标准曲线计算糖含量。 计算公式： 待测液总糖浓度= ( o d 。+ o 0 0 6 4 ) o 0 0 7 1 稀释倍数 其中，o d 。为样品在4 9 0 n m 处的吸光度值。 2 4 2 还原糖测定 还原糖测定：3 ，5 一二硝基水杨酸比色法【6 2 】 ( 1 ) 原理 在氢氧化钠和丙三醇存在下，还原糖能将3 ，5 一二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基， 生成氨基化合物，此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈桔红色，在5 4 0 n m 波长处有 第二章猴头菌多糖提取方法的研究 最大吸收，其吸光度与还原糖含量有线性关系。 ( 2 ) 溶液的配制 3 ，5 一二硝基水杨酸溶液的配制：称取6 5 9 3 ，5 一二硝基水杨酸溶于少量水中，加热溶 解后，移入1 0 0 0 m l 容量瓶中，加入2 m 0 1 l 氢氧化钠溶液3 2 5 m 1 ，再加入4 5 9 丙三醇，摇匀， 冷却后定容到1 0 0 0 m 1 。 ( 3 ) 标准曲线的绘制及样品的测定 a ：制作标准曲线：取o 、l 、2 、3 、4 、5 、6 i7 m g m 1 的葡萄糖标准溶液各l m l ，分 别置于2 5m l 容量瓶中，各加入3 ，5 一二硝基水杨酸溶液2 m l ，将容量瓶置于沸水浴中煮2 分钟进行显色，然后以流水迅速冷却，用水定容到2 5 m 1 ，摇匀。以空白调零，用分光光 度计在5 4 0 n m 处测定吸光度，以标准葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标 准曲线，得标准曲线如图2 2 所示： 0lz34 还原糖浓度( m g 田1 ) 圈2 2 还原糖测定标准曲线 f 酶2 - 2t h es t a r i d a r dc u r v eo f r c d u c i n gs u g a rd e t e 砌【i n 撕o n b ：样品还原糖含量测定：将样品准确稀释合适的倍数，吸取1 0 i i i l 溶液( 含糖3 4 l 丑g ) ， 按a 步骤操作，测量其吸光度值，以标准曲线计算糖含量。 计算公式： 待测液还原糖浓度= ( 0 d ；。一0 0 0 5 8 ) o 2 2l 3 稀释倍数 其中，0 d 。为样品在5 4 0 n m 处的吸光度值。 2 4 3 多糖测定 多糖含量= 总糖含量一还原糖含量 2 5 结果与讨论 2 5 1 猴头菌子实体主要成分的测定结果 对实验所用猴头菌子实体主要成分进行了分析，结果如表2 1 所示 世采昏 江南大学硕士学位论文 表2 1 猴头菌子实体主要成分 t a b2 - l1 1 1 em a i nc o m p o n e n t so f 胁一c f “研g ，m d “s 的i l b o d y 由表2 1 可知，猴头菌子实体蛋白含量较高，粗脂肪含量较低。 2 s 2 热水提取工艺条件单因素实验 2 5 2 1 浸提温度对多糖浸提效果的影响 猴头菌子实体干粉以l o 倍的水浸提2 h ，浸提温度分别设定为2 0 、4 0 、6 0 、 8 0 、l o o ，离心后测定不同浸提温度下浸提液中多糖浓度，结果如图2 3 所示： 2 04 06 08 01 0 0 浸提温度( ) 图2 3 浸提温度对多糖提取的影响 f i g2 3t h ee 仃to f e x t r a c t i o nt c m p e r a t u r e 衄p o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c t i o n 由图2 3 可以看出，温度对提取率有很大影响，在其它条件相同的情况下随着浸提 温度的升高浸提液中多糖浓度的增加较明显，尤其在温度低于8 0 的情况下，当温度超 过8 0 时多糖浓度随温度增加的幅度逐渐减小。由于温度过高有可能破坏多糖的化学结 构和其生物活性，不利于进一步研究和应用，综合考虑多方面因素，选择8 0 作为提取 温度进行接下的单因素实验。 2 5 2 2 浸提时间对多糖浸提效果的影响 猴头菌子实体干粉以l o 倍的水浸提，浸提温度为8 0 ，浸提时间分别设定为o5 h 、 1 h 、15 h 、20 h 、25 h ，浸提液离心后测定各浸提时间下其多糖浓度，结果如图2 4 所示： 8 7 6 5 4 3 2 1m誉一髓蛙姆娥导疑掣璐 第二章猴头菌多糖提取方法的研究 = 旨 世 蛙 据 窖 廿 崔 蜂： 粥 0 5l1522 5 时间( h ) 图2 - 4 浸提时间对多糖提取的影响 f 远2 4t h ee c to f e x t r a c t i o l ld i l r a t i o no np o l y s a o c h 缸d e sp r o d u c h o n 由图2 4 可看出浸提时间越长浸提液中多糖浓度越高，浸提时间超过2 h 时多糖浓 度增幅开始变小，可知此时猴头菌子实体细胞内外多糖浓度基本达到平衡。 2 5 2 3 浸提次数对多糖浸提效果的影响 猴头菌子实体干粉8 0 时浸提2 h ，浸提时水料比为1 0 ：1 ，浸提液离心后残渣再进行 提取，条件同第一次浸提，测定各次浸提所得浸提液中多糖浓度，结果如表2 2 所示 表2 2 浸提次数对多糖提取的影响 t a b 2 2t h ee 饪乩to f e x 吮c t i o nt i m e so np o l y s a c c h a r i d e sp r o d u c b o n 由表2 2 可以看出第一次浸提时多糖浸出不完全，第二次浸提还可得到第一次浸提 量的5 0 左右，第三次浸提时多糖亦有一定量的浸出，但此时浸出率明显降低。由于随 着提取次数的增加会增大浓缩等后序步骤的工作量和能耗，故选择提取2 次。 2 5 2 4 浓缩比对多糖析出的影响 2 5 9 猴头菌干粉于8 0 时浸提2 h ，浸提时料水比为l ：1 5 ，浸提液的浓缩比( 即提 取液与浓缩后溶液的体积比) 分别设定为2 ：l 、3 ：1 、4 ：l 、5 ：1 ，沉淀多糖时乙醇终浓度 为7 0 ，各浓缩比下所得粗多糖质量如图2 5 所示： 江南大学硕士学位论文 l23456 浓缩比 图2 5 浓缩比对多糖得率的影响 f 培2 51 1 l ee k to f c o n c e n t r a t er a t i o0 1 1p o l y