（分析化学专业论文）基于纳米金半网状及复合结构的新型生物传感器研究.pdf

硕l ：学位论文 摘要 随着科学技术的进步以及生物传感器在环境、食品、医药和军事等方面应用 范围的扩大，人们对生物传感器提出了更高的要求。为了获得更简单、灵敏、稳 定、检测下限和成本更低的生物传感器，人们做了大量的研究。而纳米材料以其 优良的物理、化学、电催化性能以及其良好的生物相容性吸引广大传感工作者， 它的介入为生物传感技术的发展带来新的契机。基于此，本文制备了几种不同材 质形貌的纳米材料，并将这些材料用于生物传感基底的构建，将免疫分子、酶分 子等采用多种不同方法固定到界面上，实现了对目标物的高灵敏、快速的传感检 测。具体内容如下： ( 1 ) 以纳米金为载体、己二硫醇( h d t ) 为交联剂，构建了一种半网状酶标 纳米金( s e m i n e t n a n o g o l d h r p ) ，有效增大酶的固定量( 第2 章) 。以此半网状酶 标纳米金修饰电极构建敏感介面，用于计时电流法检测h 2 0 2 。并与无交联剂酶标 纳米金构建的传感器进行比较，表明半网状酶标纳米金构建的界面稳定性好，电 流响应灵敏度高，能对低浓度h 2 0 2 进行准确检测，检测下限低达o 0 8g m 。分别 用紫外吸收( u v v i s ) 光谱和透射电镜对半网状酶标纳米金进行表征。同时用电化 学阻抗、石英晶体微天平、循环伏安法对此半网状修饰膜构建的界面进行研究。 ( 2 ) 报道了一种纳米金碳酸钙界面吸附的生物分子固定化技术( 第3 章) 。 在溶液中通过静电力，将纳米金组装在多孔的无机矿物碳酸钙颗粒表面形成纳米 金碳酸钙杂合材料( g n p c a c 0 3 ) 。将该杂合物用于压电免疫传感器的构建，以 c a l 5 3 抗体为固定对象，检测人c a l5 3 的血清浓度。结果表明，该传感器响应 性能良好，线性范围为8 0 2 6 6 0um l 。 ( 3 ) 提出一种基于细胞的抗体固定化方法( 第4 章) 。首先在压电晶振表面 自组装一层半胱胺以固定酵母细胞，利用微生物表面作为前列腺抗原( p s a ) 抗体 分子的载体，并同时与戊二醛固定化方法进行比较。结果表明，酵母细胞以其优 良的生物相容性以及其“手臂 延长效应为抗体分子提供了合适的生理环境，使 p s a 抗体分子的免疫活性得以很好的保持。实验最后还将本免疫检测方法的检测 结果和临床化学发光免疫分析方法的结果比较，两种方法的检测结果基本一致， 表明本方法可靠。 关键词：生物传感器；压电免疫传感器；纳米材料；纳米金颗粒；细胞 i i a b s t r a c t b i o s e n s o r so fh i g h e rq u a l i t i t ya r en e e d e dw i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fs c i e n c ea n d t e c h n o l o g y a n dt h ee x p a n d i n ga p p l i c a t i o no fb i o s e n s o ri ne n v i r o n m e n t ，f o o d ， m e d i c i n e ，m i l i t a r y m u c hs t u d yh a v eb e e nd o n eo nd e s i g n i n gb i o s e n s o r sw h i c ha r e s i m p e r ，s e n s i t i v e ，s t a b i l e ，w i t hl o w e rd e t e c t i o nl i m i ta n dc o s t t h ei n t r o d u c t i o no f n a n o m a t e r i a l sa r eb r i n g i n gb i o s e n s o r sat u r n i n gp o i n t ，t a k i n ga d v a n t a g eo ft h eg o o d p h y s i c a l ，c h e m i c a l ，e l e c t r o c a t a l y t i cp r o p e r t y ，a n db i o c o m p a t i b i l i t y a c c o r d i n g l y ，t h i s r e s e a r c hp r e p a r e ds o m es o r to fn a n o m a t e r i a l sw i t hd i f f e r e n tm o r p h o l o g y ，u s i n gt h e m f o rt h ef a b r i c a t i o no fb i o s e n s o r s i m m o b i l i z i n gp r e t e i ns u c ha sa n t i b o d ya n de n z y m e w i t hd i f f e r e n tm e t h o l d ，t h er e s u l t i n gb i o s e n s o r sr e s p o n s ew e l l ，s h o w i n gh i g h s e n s i t i v i t y 1 0 wd e t e c t i o nl i m i ta n df a s tr e p o n s et i m e t h ed e t a i l sa r ea sf i ) l l o w s ： ( 1 ) w eh a v ei n v e s t i g a t e d am e t h o do f p r o d u c i n gs e m i n e t w o r k - t y p e a u n a n o p a r t i c l e s l a b l e d b y h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( s e m i n e t n a n o g o l d h r p ) w i t h c r o s s 1 i n k e r s1 6 h e x a n a n e d i t h i o l ( h d t ) ，f o r m i n gs e m i n e ts t r u c t u r et oi n c r e a s et h e i m m o b i l i t yo fh r p c o m p a r e dw i t hh r pl a b l e da un a n o p a r t i c l e sw i t h o u th d t ，t h e s e n s i t i v ea m p e r o m e t r i cs e n s o ro fh 2 0 2m e d i a t e db ys e m i n e t n a n o g o l d h r p ，w h i c h w a ss u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e do ng o l de l e c t r o d es u p p o r t e db yt h i o l t a i l e dg r o u p so f h d t w a sm o r es t e a d yw i t hab e t t e rc u r r e n tr e s p o n s ei nt h el o wh 2 0 2c o n c e n t r a t i o n ， a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tr e a c h e d0 0 8u m c h a r a c t e r i z a t i o no ft h es e m i n e t - n a n o g o l d h r pw a sc a r r i e do u tu s i n gu v v i s i b l es p e c t r o s c o p ya n dt e m t h es t u d yo ft h ef i l m w a s p e r f o r m e db y e l e c t r o c h e m i c a li m p e d e n c es p e c t r o s c o p y ，q u a r t zc r y s t a l m i c r o b a l a n c ea n dc y c l i cv o l t a m m o g r a m s ( 2 ) a b i o m o l e c u l a ri m m o b i l i z a t i o n s t r a t e g y b a s e do nt h ea d s o r p t i o no f g n t c a c 0 1h y b r i dm a t e r i a lh a sb e e nr e p o r t e d g o l dn a n o p a r t i c l e sw e r ea s s e m b l e d o nt h es u r f a c eo f p o r o u s c a l c i u mc a r b o n a t em i c r o p a r t i c l e s ( c a c 0 3 ) t h r o u g h e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o ni nt h en e u t r a la q u e o u s ，f o r m i n gg n t c a c 0 3c o m p o s i t e t h e r e s u l t i n gg n t c a c 0 3 w a su s e dt oo f f e rat e m p l a t ef o rc a15 - 3a n t i b o d y i m m o b i l i z a t i o nt oc o n s t r u c ti m m u n s e n s o r sf o rd e t e c t i n gc a 15 - 3i nh u m a ns e r u m s t u d yr e s u l ti n d i c a t e s t h a tt h ea s p r e p a r e di m m u n s e n s o r sr e s p o n s ew e l lw i t ha d e t e c t i o nr a n g eo f8 0 2 6 6 0um l 叫f o rc a l5 - 3 ( 3 ) aa n t i b o d yi m m o b i l i z a t i o ns t r a g e d yb a s e do nc e l l sh a sb e e np r o p o s e d t h e p i e z o e l e c t r i cc r y s t a lw a sm o d i f i e dw i t hc y s t e a m i n et od e p o s i t ey e a s tc e l l s ，o nw h i c h i i i p s aa n t i b o d yw a s i m m o b i l i z e d c o m p a r e dw i t h t h et r a d i t i o n a l g l u t a r a l d h y d e i m m o b i l i z a t i o n a p p r o a c h ，s t u d yr e s u l t si n d i c a t et h e y e a s t c e l l sc o u l dp r o v i d e a p p r e c i a t eb i o 。s o r r o u n d i n g sf o ra n t i b o d yd u et oi t s g o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n d “a r m ”。e x t e n d e de f f e c t ，t h u st h ei m m u n ea c t i v i t yo fp s ac a nb e p r o t e c t e dw e l l t h e r e s u l t so ft h e p r o p o s e di m m u n o a s s a ya n dt h ec h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y m e t h o l d ，ac o n v e n t i o n a lm e t h o df o rs e r u ma n a l y s i si nt h i sc o u n t y ，w e r ei nr e a s o n a b l e a g r e e m e n t ，w h i c hi n d i c a t et h ed e v e l o p e di m m u n o a s s a yi sr e l i a b l e k e y w o r d s ：b i o s e n s o r s ；p i e z o e l e c t r i cs e n s o r ；n a n o m a t e r i a l ；g o l dn a n o p a r t i c l e ；c e l l i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名： 幸；奄紊二日期：1 c 1 年。6 月 学位论文版权使用授权书 0 7 日 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 日期：、1 年蝴。勺日 日期：伊| 1 年- 月i 。日 一9 一r 垆岛9 一 p 净 名名签签者师作导 硕l j 学位论文 第1 章绪论 生物传感器是一种集现代生物技术与先进的电子技术于一体的高科技产品。 它是将酶、微生物、抗原、抗体、配位体、受体、脱氧核糖核酸( d n a ) 等生物分 子识别材料同物理、化学器件相结合而制成的一种新颖的信号转换器。能利用生 物传感技术实现简单、快速、准确、灵敏的环境检测，材料、食品、药物和生物 活性化合物的分析一直是分析科学研究者服务社会的目标之一。尽管目前科研工 作者已研究开发了一系列的检测方法，但这些方法大多仍存在操作繁琐、费时、 仪器昂贵、对操作人员要求高等诸多问题，不能很好的满足人类飞速发展的需要。 而纳米技术与纳米材料的介入为生物传感器的发展提供了无穷的想象，为生物传 感器的发展带来突破，它们的有机结合使得更为简单、快速、准确、灵敏、低成 本的检测分析成为可能。 1 1 纳米金探针及其应用 由于纳米材料具有明显不同于体材料和单个分子的独特性质。纳米微粒表面 积大、敏感度高，对周围环境十分敏感，如光、温、气氛、湿度、催化等，使其 成为应用于传感器最有前途的材料，如温度、气体、光、湿度、电催化等传感器。 金纳米粒子( g n p ) 是指直径在1 1 0 0n m 之间的金微粒。它具有比表面积大、 表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高、吸附能力强、生物相容性好等 优点。如何将其更好的应用于分析化学领域，一直是分析化学研究的兴趣之一。 1 9 7 1 年f a u l k 和t a y l o r 首次采用免疫金染色将纳米胶体金应用于直接免疫组织化学 检测沙门氏菌表面抗原，这成为纳米金颗粒应用于生物检测的里程碑。此后， 纳米金在生物学、医学和传感器等领域的应用得到迅速发展。一方面，近年来基 于纳米金改性复合材料的应用方兴未艾。如d i n g 等【2j 将纳米金组装在纳米羟基磷 灰石上形成多功能化的纳米杂合材料纳米金。羟基磷灰石复合物( g n p h a ) ，并将 其应用于压电免疫传感界面的构建，实现了对人血清中甲胎蛋白( a f p ) 含量的定 量检测。证明了基于g n p h a 纳米杂合材料构建的压电免疫传感器用于分析检测 a f p 时具有更好的特异性、重现性和检测线性范围。另一方面，各种形式纳米金 探针相继诞生，在全世界掀起一股基于纳米金探针研究的热潮。 1 1 1 纳米金探针 识别分子可通过静电吸附，特异性识别，共价耦合等作用修饰到纳米金离子 表面( 如图1 1 ) 1 3 - 1 2 l ，制得纳米金探针在生化分析中发挥重要作用。广泛应用于 重金属离子、d n a 检测，蛋白质、酶的活性和细胞的分析等。 兰三垫娄塞兰翌兰些丝窒彗塑兰堑型兰塑! ：量兰 专方 j g o n a n o p a 巾d e 们t h i o l a t e d o r d i s u l f i d e m o d i f i e d i 和n 出 f ) ：e l e c t r o s t a t i cm i 群a c t i o n i i i ) a n t d x x ：l , f - a n t l g e n a r 媾o c i a l l o n $ i v ) ：s t r e p t a v i c l i n i 晡o t i nb m d i n o 圈i i 纳米金探针设计方案囤 1 1 11 电化学探针 由于金纳米颗粒具有良好的导电性和宏观隧道效应，能大大减小电子给体与 受体间的距离，提高电子与电极之间的传递速率。固定化酶时引入的纳米金l u 以 作为崮定化酶之间、固定化酶与电极之间有效的电子媒介体，从而使得酶的氧化 还原中心与电极删通过金属颗粒进行电子转移成为可能，纳米余颗粒可以近似看 作是酶与电极间一种导线，这样就有效地提高了传感器的电流响应灵敏度。一般 由免疫亲和反应引起的导电性的改变比较微弱，难以进行电化学检测，但通过纳 米金的修饰进行免疫反应后，形成抗原一抗体一纳米金的复合体，该复合体有序 聚集成量子点阵列，改变了电荷输送途径并提高了导电性，从而实现了免疫反应 的电化学检测。m a o 等”“提出一种基于纳米会标记及铜增强放大的电化学免疫技 术，检测下线达00 7 5n g m l 。左国防等将h r p 定于金纳米粒子表面，制得 的h r p a u 胶粒修饰电极，不需媒介体便能直接催化还原h 2 0 2 。陈洪渊等”“茸先 在金表面组装一层半胱氨酸，然后使用双功能基团试剂戊二醛连续共价结合半胱 氪试剂，通过层层自组装将金纳米粒子通过s a u 键共价组合在s a m s 上，制得了 高效的h 2 0 2 生物传感器。y a n g 等人将金纳米线阵列用于血红蛋白( h b ) 的固定。 因乖直排列的纳米线阵列用于蛋白质的固定有很多优点，如增大蛋白的固定量， 同时蛋白能更灵活的分巾，制各了高灵敏的生物忙感器。 1 1 12 光学探针 胶体会在可见区有特征等离子体共振吸收，且其吸收峰的等离子共振常随着 尺寸的变化而发生频移，其溶液的颜色从橘红色到紫红色发生相应变化，有利于 肉眼观察。此外，纳米金溶液的颜色与纳米金颗粒间距离有关，当纳米颗粒间距 硕l j 学位论文 大于粒子的平均直径时显红色，大致相等或略低于平均直径时，显蓝色。据此， m i r k i n 等采用直接的颜色检测法来分析寡聚核苷酸的杂交特性。利用金纳米粒子 与d n a 分子结合前后颜色会发生明显变化而制成了d n a 光学传感器，其检测限比 传统的荧光检测提高了两个数量级。l u 等【1 7 “9 j 用d n a 标记纳米金，利用加入p b 2 + 前后颜色的变化实现对p b ”的快速实时在线检测，检测下限达3n m 。w u 等1 2o j 把一 端连有疏基的特定序列的寡聚核苷酸耦合到金纳米晶体上，以另一标有荧光基团 的核苷酸为检测探针，利用金纳米粒子对荧光的猝灭作用实现单碱基错配检测。 1 2 压电免疫传感器 压电免疫传感器是结合石英晶体高灵敏的压电效应和免疫反应的高特异识别 功能而构成的一种生物传感器件，可响应晶体表面质量负载以及体系( 溶液) 的 密度、粘度、电导、介电常数等多种参数的变化【2 卜26 1 。该器件具备简便、灵敏、 快速、响应范围广、仪器廉价、体积小、易于实现集成化和联机自动化监测等居 多优点。 1 2 1 压电免疫传感理论 1 2 1 1 压电传感器理论基础 石英类各向异性的晶体受到机械应力后，在相应的方面上产生电场，此现象 称为压电效应；相反，在压电材料上施加一电场，则产生机械形变，称为逆压电 效应。压电传感器的传感元件为压电石英晶体，当电流通过石英晶体时，该材料 会出现小的机械变形，在一定频率下就会导致机械共振或声共振，其共振频率随 振荡器表面质量的变化而改变。这种关系可由s a u e r b r e y 2 2 1 方程表示： 舒= 一2 2 6 x 1 0 7 露肼彳 ( 1 1 ) 其中心是由附着质量埘引起的频率变化，f o 为石英晶体的基频，a 为石英 晶体电极区面积。 传统的石英晶体谐振器只能在气相中振荡，放入液体后，或者发生短路，或 者因阻尼过大而不起振。因此大多数压电生物传感器采用在液体中反应，经清洗、 晾干后，在空气中测量的方法。此方法最大的缺陷是不能反映生化反应的动态过 程，另外操作繁琐且操作过程对测量结果影响较大。 8 0 年代初，k o n a s h 和b a s t i a a n s l 2 3 】首先实现了单面触液的石英晶体在液相中 的成功起振。他们发现，石英晶体在液相中的频率偏移，不仅与电极表面所吸附 的质量有关，而且与液体的密度有关。随后，许多人开始研究液体介质中的压电 晶体振荡器，发现晶体的频率偏移还与液体的粘度，导电性等因素有关。19 9 1 年， m a r t i n 等【2 5 1 推导出同时具有附着质量和液体阻尼情况的a t 切型石英晶体谐振器 基于纳米会半嘲状及复合结构的新型生物传感器 频率偏移公式。 肌时晔一怒一等 ( 1 2 ) 压电液相免疫传感技术能直接用于液相中进行免疫测定，并能实时、连续检 测抗原一抗体免疫反应的动态过程，在临床疾病标志物的免疫定量分析以及免疫 动力学理论研究方面获得了非常广泛的应用 2 5 - 2 9 1 。 1 2 1 2 免疫学基础 抗原是一种异己物质，是免疫应答发生的始动因素，也是决定免疫反应特异 性的关键，具有免疫原性和免疫反应性。所谓免疫应答是机体免疫活性细胞对抗 原分子的识别、自身活化、增殖、分化及产生效应的全过程。特异性免疫是个体 在生长和生活过程中，通过不断与抗原物质接触而获得，又称适应性免疫。特异 性免疫的针对性强，只对引起其产生的同种抗原有作用，对无关抗原不起作用。 这种决定抗原特异性的特殊化学基团称为抗原决定簇，又称表位。 能与抗原发生特异性结合反应的球蛋白称为抗体。抗体主要存在于血清中， 习惯上将抗体叫做抗血清或免疫血清。抗体的化学本质是球蛋白，具有抗体活性 或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。所有的抗体都属于免疫球蛋 白，但有少部分异常的免疫球蛋白没有抗体活性。 抗原与抗体的特异结合，主要是基于抗原和抗体分子结构及立体构型的互补， 以及由多种因素造成二者分子间引力参与下发生的免疫化学反应。抗原抗体反应 是指由抗原物质刺激机体产生相应的抗体后，二者在体内或体外发生的特异性结 合反应。抗原与抗体在体外结合时，可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分 不同而出现各种反应如凝集、沉淀、补体结合及中和反应等，此四种类型的反应 即经典的抗原抗体反应。 抗原抗体之间不形成牢固的共价键， 德华引力，氢键结合力，疏水作用力) ， 抗体间的特异性结合。 而是通过非共价键结合( 库伦引力，范 其中有四种分子间引力参与并促进抗原 抗原抗体反应具备高特异性，按比例进行，可逆等特点。除受抗原和抗体本 身的性质、活性及浓度等影响之外，抗原抗体的反应还受到环境条件的影响。 1 2 2 压电免疫传感器的种类 根据检测环境不同，压电免疫传感器分为压电气相免疫传感器和压电液相免 疫传感器。 压电气相免疫传感技术通常指压电免疫传感器在溶液中进行免疫反应，经洗 涤与干燥后，在气相中测量免疫反应前后压电晶体响应频率的变化，以获得有关 硕f ：学位论文 待测抗体( 抗原) 的浓度、活性等信息。l9 7 2 年，s h o n s 等【2 1 】首次将压电气相传 感技术应用于免疫分析。 1 9 8 0 年，人们成功地实现了压电晶体在液相中稳定振荡，从而开辟了压电传 感器全新的应用领域，使之成为压电传感分析领域的主流技术。根据引起频率变 化的原因不同，压电液相免疫传感器分为质量响应型和非质量响应型两种1 2 9 , 3 0 。 质量型压电免疫传感器又称为石英晶体微天平( q c m ) ，基本原理是在晶体表 面包被一种抗体或抗原，得到一个基础频率f l ，样品中若有相应的抗原或抗体， 则发生特异性结合产生凝集或沉淀，导致晶体表面质量负载增加，振荡频率也会 发生相应改变从而得到新的频率f 2 ，振动频率的变化a f = f l f 2 。实验中通过 测定a f 来间接得到吸附的抗原或抗体的质量a m 。 非质量型压电免疫传感器的检测原理是先将石英晶体用适当的方法进行封闭 使其表面不吸附任何物质，将晶体放入已经注入了抗体或抗原的反应池中，待频 率稳定后加入待测的样品，如存在相应的抗原或抗体，由于发生特异性免疫导致 溶液的密度、粘度，电导率等非质量参数变化，从而使晶体的响应频率发生变化， 通过测定的a f 间接测定抗原或抗体的浓度。 1 2 3 免疫材料的固定化方法 性能优良的免疫材料固定化方法是研制压电免疫传感技术的关键，也一直 是传感工作者探索的主要目标之一f 1 , 31 - 3 3 1 。要求固定化方法既具有较高的固定量， 又能使其免疫活性得以完好保持，还应能减少背景非特异性吸附以及传感器件易 于反复再生等。目前，主要有以下一些固定化方法( 这些方法通常联合使用或互 相改进) 。 1 2 3 1 物理吸附法 物理吸附是电极表面对蛋白质直接吸附固定，常通过涂覆或浸泡的方式实 现。由于抗原或抗体自身带有巯基，而巯基与金之间存在疏水作用并能形成硫一 金键，因此抗原或抗体易于吸附在金表面。所以，在压电免疫分析中，可以用物 理吸附固定的方法将生物分子固定到金电极表面。如e b e r s o l e 等【3 4 l 在电极表面吸 附人绒毛膜促性腺激素抗体用以检测对应抗原；h a r t e v e l d 等【35 1 通过吸附作用检测 s e b ，检测限达0 1 “mm l ；c h a n c e 等【3 6 】直接在金表面涂覆消胆胺对胆酸进行 检测：s u 等 3 7 1 通过物理吸附研究d n a 的杂交反应。物理吸附是最简单的固定化 过程，但稳定性差、特异选择性不够好，在固定化后要使用牛血清白蛋白封闭非 特异性位点减少干扰。 1 2 3 2 交联固定法 交联固定法是通过先在压电晶体表面修饰带特定功能团( 如n h 2 、o h 、 基于纳米金半网状及复合结构的新型生物传感器 c 0 0 h 等) 的基质膜，再利用双功能试剂或多功能试剂( 如戊二醛、甲苯二异氰 酸酯等) 交联固定免疫物质的一种方法。该方法始于s h o n s 等【2 l 】制备的第一个压 电免疫传感器，随后，交联固定法被当作一种经典的方法广泛用于免疫传感器中 多种免疫活性物质的固定【3 8 。4 4 】。 1 2 3 3 生物素一亲和素法 生物素一亲和素法是在金电极上直接吸附亲和素，利用亲和素、生物素之间 的结合作用将生物素化抗体固定在传感器表面的一种方法【4 5 , 4 6 】。固定化过程有多 种形式：链霉亲和素可以形成单分子层【47 】；亲和素也可以通过带功能团的硫醇自 组装分子层来固定【4 8 】；生物素标记的类脂膜4 9 1 可以用l b 膜技术来固定，生物素 标记的惰性蛋白 5 0 - 5 2j 也可以吸附在电极表面形成生物素分子固定层。如b i r k e r t 等【53 】通过生物素一抗生蛋白链霉素复合物的形成来固定抗生蛋白链霉素。c l e r c 等【5 4 】利用生物素一抗生蛋白链霉素进行探针分子在表面的固定化。 1 2 3 4 定向固定法 常用的定向固定法主要有两种，一种是蛋白a 固定法：蛋白a 是金黄色葡萄 球菌的一种胞壁成份。分子中有四个与免疫球蛋白分子f c 片段高亲和力结合的位 点。同时，蛋白a 分子与电极表面的金原子之间依靠分子间的作用力可以紧密地 结合又能和人及多种哺乳动物的i g g 有着天然的亲合力，能和i g g 的f c 片段特 异性结合，这种结合能使抗体上的抗原结合位点所在的f a b 段裸露在修饰膜的外 层而伸向溶液相，从而有利于抗体与抗原的反应。另一种利用自身带巯基的抗体 i g g 片段( 或f a b s h ) 与金基体之间的吸附作用或与基体上修饰的特定基团键合 作用进行的定向固定化【5 5 铘】。例如，b r o g a n 等【5 7 1 将小牛碱性磷酸酶抗体f a b s h 片段直接定向固定于压电晶体的金电极表面，发现固定的抗体片段的固定化密度 及其抗原结合效率均明显高于相同条件下随机固定的完整抗体分子。研究表明， 免疫物质的定向固定化有利于其反应活性的充分发挥。因此，定向固定方法在压 电免疫传感器研究中极富应用潜力。 1 2 3 5l b 膜技术 1 9 3 7 年，l a n g m u i r 和b l o d g e t t 首次采用l b 膜即l a n g m u i r - b l o d g e t t 5 8 1 技术， 它是一种精确控制薄膜厚度和分子排列的单分子膜沉积技术。其原理是将具有脂 肪链疏水基团的双亲分子溶于挥发性溶剂中形成有序的单分子膜，再将气一液界 面上的单分子膜转移到固体表面，组建成的单分子膜即l b 膜。 l b 膜均匀、超薄、分子层次排列有序、结构灵活，可以直接固定作为受体 膜，也可以作为蛋白质、d n a 的固定层。o k a h a t a 5 9 l 利用l b 膜检测水溶液中具 有生物活性的化合物与类脂膜的选择性吸附作用。n i c o l i n i 等【6 0 1 应用十八烷基胺 硕f ：学位论文 l b 膜中的氨基固定d n a ，从而检测d n a 的杂交。 1 2 3 6 自组装单分子层法 自组装技术是在没有干预的情况下，将石英晶体金电极浸入含有特定表面活 性剂的有机溶剂当中，分子通过化学键相互作用自动在晶体表面形成有序的单分 子层自组装膜( s a m s ) ，它是一种应用广泛的制备超分子膜技术【6 1 】。硫醇( r - s h ) 、 硫醚( r s r ) 或二硫醚( r s s r ) 是比较常用的溶剂，自组装膜分子的尾端带有活 性基团，可直接或在偶联剂的作用下与生物分子反应形成共价键，从而将生物分 子固定于晶体表面【6 2 - 75 1 。 自组装膜易于制备和控制，膜高度有序而稳定，且能够提供各种活泼基团， 结合了化学吸附和l b 膜的特点，克服了戊二醛交联法的不足，使检测的灵敏度 和重复性有很大提高。但膜中存在的针孔会使化学键键断裂，成膜分子倒伏或脱 落，从而影响生物分子固定的效果，并且对电导、电容等电化学检测所造成的误 差也十：分明显。近期，长链带活性基团的硫醇分子与短链硫醇分子的混合自组膜 的应用j 苞服了活性基团与生物分子结合的空间障碍，使自组装技术得到更为广泛 的应用。 1 2 3 7 包埋固定法 包埋固定法是通过采用凝胶或聚合物直接包埋固定免疫活性物质的一种方法 2 1 , 7 6 1 。该方法虽然简单易行，但固定物的稳定性一般不高，同时由于大量聚合物 的修饰增加了电极表面负载和界面粘弹性，从而一般难以获得较高响应灵敏度与 重现性。 1 2 3 8 聚合膜法 电化学聚合简称为电聚合，是指应用电化学方法在阴极上或阳极上进行的聚 合反应，一般分为电缩聚反应和电加聚反应。利用电缩聚方法在阴极或阳极表面 制备的聚合物膜，称为电聚合膜。采用电聚合方法可以合成一些常用方法所不能 合成的聚合物外，还能改变某些聚合物的性能。如邓婷等【7 7 1 利用电聚合邻苯二胺 膜并结合纳米金自组装开发了生物分子新固定方法。 利用辉光放电把有机类气态单体等离子化使其产生各类活性种，由这些活性 种之间或活性种与单体之间进行反应所形成的聚合物膜【7 8 j 称为等离子体聚合膜。 聚合膜为无针孔的薄膜( 厚度通常为1 0 0 - l0 0 0n m ) ，具有高度交联的网状结构， 卓越的机械强度、化学稳定性和基底附着力。等离子体聚合将单体的种类拓宽至 各种有机物，“干法”技术运作方便灵活，交联度及物理、化学特性可以控制。 聚电解质静电吸附是一种有机功能膜的制备技术【7 9 。8 0 1 ，可交替吸附固定单层 或多层蛋白质8 卜8 4 】，特别是其溶解度与吸附性受到环境p h 值影响较大，通过改变 基于纳米金半网状及复合结构的新型生物传感器 p h 可以实现蛋白分子的可逆固定【8 3 斟】，为免疫材料的可逆化及传感器的再生提供 了一种新途径。王桦【7 4 】等通过聚电解质吸附和等离子体聚合结合的方法实现对血 吸虫的定量检测，并且传感器灵敏度高，易于再生。d e n g 等t 8 5 】通过调节p h 实现 c 4 抗体在负电性n a f i o n 表面的吸附以定量检测人血清中的补体c 4 。这种构建传感 器的新方法，显著提高了免疫传感器的性能，特别是改进了传感界面的再生和重 复使用性能。 1 2 3 9 纳米颗粒倍增的生物修饰技术 近年来，纳米材料科学和技术的研究和发展极为迅猛，已被逐渐应用于生物 化学分析领域【6 0 6 1 】。由于其在原子、分子为代表的微观世界和宏观世界的过渡区 域，其具有常规颗粒所不具有的新效应。这些新效应使得纳米颗粒与生物材料有 着特殊的相互作用。功能化纳米或亚微米颗粒具有比表面积大、吸附力强、生物 相容性高等物理化学特性，为改善生物识别分子的固定化特性提供了潜在的可能 性【8 9 1 。如k i m 等( 9 0 1 以s a l m o n e l l a 抗体包覆微米级磁性微球，建立了一种磁增强 的压电交流阻抗技术，实现了对s a l m o n e l l a 细胞的高灵敏检测。w a n g 等1 8 8 t 9 通过 在压电晶体的金电极表面沉积氨基等离子体聚合膜，进而组装纳米金颗粒，开发 了一种纳米金颗粒倍增的生物分子吸附固定化技术。总之，通过采用功能化纳米 材料提高生物活性材料的固定方法，已成为改善生物传感器性能的有效途径之一。 1 2 电化学酶传感器 1 2 1 电化学酶传感器的种类 电化学酶传感器是将酶固定到电极上获得与底物反应的电信号的检测换能装 置【9 2 。9 6 】。根据测量信号的不同，大致可分为：电流型、电位型和电导型。电流型 酶传感器是研究以及应用最广泛的一种传感器，它是利用固定在电极表面上的酶 对酶底物的催化氧化或还原，产生可在电极上还原或氧化的组分，获得电流信号 9 7 - 1 0 0 。电流型酶传感器具有响应速度快、检测下限低、线性范围宽等优点，但它 容易受到样品中电活性物质如抗坏血酸、尿酸、对乙酰氨基酚等的干扰。电位型 传感器是基于离子选择性电极原理而发展起来的，固定到电极表面的酶对底物催 化，产生离子型物质，能引起指示电极电位改变 1 0 l 】。电导型传感器是利用酶催 化底物反应，导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而引起溶液导电性的改 变，以溶液的电导率为检测信号的【1 0 2 1 0 3 1 。 1 2 2 电流型酶传感器的构建方法 电子转移的难易和速度决定着电流型酶传感器的性质。但似乎很难发生酶与 电极之间的直接电子转移，因为酶的电活中心是深埋在蛋白质内部的，氧化状态 硕j j 学位论文 的酶从电极上直接得到电子是非常困难的，而电极信号必须依靠一个中间体来实 现电子的传递，这就是一种辅助底物中间体，称为媒介体，它是将酶反应过程中 产生的电子从酶反应中心转移到电极表面，使电极响应增强的分子导电体。 电流型酶传感器的发展经历了三个发展阶段，即以酶的天然介体一氧作为媒 介体的第一代传感器，基于二茂铁等人工合成的媒介体的第二代酶生物传感器和 利用酶自身与电极间的直接电子转移的第三代酶生物传感器。 第一代传感器以氧为媒介体，通过检测酶反应产生的过氧化氢来间接检测底 物。但过氧化氢的检测电位比较高，电活性物质容易对传感器的测定产生干扰。 因此需要在电极表面修饰选择渗透薄膜来排除干扰物的影响 1 0 4 - 1 0 5 】，或者也可以 在电极表面修饰一层普鲁士蓝等物质，普鲁士蓝对h 2 0 2 的电还原催化能在较低 的电位下进行，减小干扰1 1 0 6 1 。 第二代生物传感器是利用人为加入电子媒介体来解决传递电子的问题。电子 媒介体是指能将酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表面，使电极 产生相应电流变化的分子导电体。目前用于生物传感器研究的电子媒介体主要包 括小分子媒介：二茂铁及其衍生物；染料类如亚甲基绿、麦尔多拉蓝、亚甲基蓝、 靛酚类等；醌及其衍生物：四硫富瓦烯及其衍生物和导电有机盐等。以及高分子 媒介体：变价过渡金属离子螫合物型高分子媒介体如锇的吡啶配合聚合物等【l 7 1 。 各种电子媒介体的使用，使得电流型酶传感器的响应速度和灵敏度都得到了很大 的提高。 第三代基于直接电子转移的酶传感器主要用于研究血红蛋白、肌红蛋白等金 属蛋白质。这些研究能帮助我们了解蛋白质的结构，蛋白质发生电子传递的机理， 以及在电极表面模拟生物体内的电子传递过程。然而同样很多金属蛋白质的活性 中心深埋在蛋白质壳内，在裸电极上实现直接电化学是很困难的。为了促进蛋白 质和电极的电子传递，需要运用各种支持膜，有机薄膜如表面活性剂、生物高聚 物、n a t i o n 以及聚电解质等。近年来，无机材料被大量用来固定蛋白质，这些无 机材料比较稳定而且具有利于保持酶活性的良好的微环境。所以这方面的研究集 中在蛋白质固定材料的选择、制备与应用。b a t t a g l i n i 等【1 0 8 】研究用锇的配合物与 葡萄糖氧化酶共价结合后固定于电极上，对葡萄糖的响应结果表明，锇配合物修 饰的酶是稳定的，与二茂铁修饰的酶相比有较快的电极反应。z h a o 等 1 0 9 】将血红 蛋白固定到二氧化钛纳米颗粒上，同样实现了血红蛋白的直接电子传递。有意思 的现象是当用紫外光照射这个二氧化钛复合膜时，蛋白质对过氧化氢的催化活性 得到了较大提高，同时检测下限也降低了。他们推测是紫外光照射二氧化钛纳米 颗粒后，会产生一些羟基、过氧化物自由基，而这些自由基能提高血红蛋白的活 性。 在酶传感器的构建中，其关键技术之就是如何将酶分子稳定、高活性地固 基于纳米金半网状及复合结构的新型生物传感器 定到换能器表面。常用的酶的固定方法有：包埋法、共价交联法、吸附法等。虽 然固定生物材料的方法很多，但每种技术都有自身的优势与不足。包埋法可以增 大酶的固定量，但包埋可能导致固定的酶分子不均匀，在空间上容易受到阻碍且 容易泄漏m 别。共价交联法固定的酶分子比较稳定，但容易导致酶的部分失活 3 。1 14 1 。理想的生物传感界面的构建需要采用温和的化学条件将大量的酶分子固 定到界面表面，提供有利的微环境有效保持酶的活性，同时提供大的表面积利于 酶和底物的接触【l1 5 】。近年来，纳米材料大的表面积，良好的生物相容性使其在 固定酶方面有着良好的前景。总之，具有简便、稳定、高效换能性的传感界面构 建方法仍然是发展电化学酶传感器的主要研究目标。 1 3 生物传感器的发展趋势 随着生物传感器在医疗诊断、食品营养、环境监测、国防工业以及人类卫生 保健等诸多领域中广泛的应用，生物传感器技术的深入化和实用化，人们对生物 传感器提出了更高的要求。为了获得高灵敏度、高稳定性、低成本的生物传感器， 人们已着力于下面的研究与开发【1 1 6 1 。 1 3 1 新材料得到大力开发和应用 功能材料是发展传感器技术的重要基础。由于材料科学的进步，人们可以控 制材料的成分，从而可以设计制造出各种用于传感器的功能材料。利用纳米材料 的催化性能和大的表面积提高生物传感器的性能是当前生物传感器的发展方向之 一。研究发展新型纳米材料、纳米材料的有序组装以及生物分子的固定方法是当 前生物传感器发展的一大热点。近年来对功能材料的开发有较大进展，其主要发 展趋势有以下几个方面：( 1 ) 原子( 分子) 型材料的人工合成；( 2 ) 从单晶体到多晶 体、非晶体；( 3 ) 从单一性材料到复合性材料。而纳米杂合材料，保持来自于母体 材料的各种内在优点，近年来在传感器的构建方面得到大量研究。 1 3 2 新工艺得到广泛采用 在发展新型传感器的过程中，离不开新工艺的采用。基因重组技术、溶胶一 凝胶技术、酶的定向取向技术、光学成像技术、微电子技术与微制作技术、计算 机信息处理技术、纳米技术等技术的引入有助于制造出综合性能稳定、可靠性高、 体积小、重量轻的敏感元件。今后，随着高科技的深入发展，还可以利用不同的 生物元件的特异功能与先进的电子技术相结合，研制出各种用途的新型生物传感 器。例如，采取微电子技术与特殊的生物元件可以研制出超微型的生物传感器， 它可以进入人的体内，帮助医生和病人解决一些外科手术和药物无法解决的问题， 特别是纠正人类神经传递