（食品科学专业论文）大豆蛋白酶法水解产物抗氧化特性及产品的研究与开发.pdf

摘要 论文研究了a l c a l a s e 碱性蛋白酶、n e u ”a s e 中性蛋白酶、f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶及 a s 1 3 9 8 中性酶对人豆分离蛋白的水解效果，确定了最佳水解工艺条件。结果表明：各种酶在其 晟适反应条件卜，水解能力大小依次为a 】c a l a s e f 】“o u r z y m e n e u t r a s e as 】3 9 8 中性酶，其中 a l c a l a s e 碱十牛蛋自酶水解大豆蛋白的晟佳l 。岂条竹是：温度5 8 ，底物质量分数50 ，酶用嚣 1 0o ，水解时间3 0 0m i n 。 论文对大豆多肽在食物体系与非食物体系中的抗氧化性能做了研究，结果表明：大豆多肽在 食物体系中能够延长油脂氧化酸败的诱导期，而且与酚类抗氧化剂协同作用，效果更为明显；在 非食物体系中。大豆多肽能够抑制油酸的白氧化及邻苯三酚的自氧化速率，其中对后者的抑制 作用较前者显著。 论文采用葡聚糖凝胶s e p h a d e xo 一2 5 对人豆多肽进行了分离，采用s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 对具有抗氧化多肽的分子量进行了测定，得出一同归方程：y = 一1 2 6 1 8 x 十51 3 3 8 。结果表明与低 分子量标准蛋白的迁移率相比，大豆多肽明显高于前者，相对应的分子量则火大低于最小分子量 的标准蛋白( 1 4 ，4 0 0 d ) ，经理论测算大豆抗氧化多肽的分子量在1 0 0 0 d 以下。 论文研究了大豆多肽在酸性饮料中等电点可溶的特性，研究开发了大豆多肽苹果汁、山楂汁、 橙汁等饮料，考察了大豆多肽果汁饮料的色泽、风味、稳定性等指标，并确定出最佳配比方案。 关键词：大豆多肽 酶法水解a i c a i a s e 碱性蛋白酶抗氧化 多肽果汁饮料 a b s t r a c t i nt h i s p a p e r ， s e v e r a lp r o t e o l y t i ce n z y m e s( s u c h a sa l c a l a s e ， n e u t r a s e ， f l a v o u r z y m e ，a s 13 9 8 ) w e r es t u d i e ds y s t e m a t i c a l l ya n di n d i v i d u a l l y ，t i l e b e s t m a k i n 2c o n d i t i o no ft h ef o u r n z n e 5w e r ec o n f i h n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tu n d e r t h eo p t i m u mc o n d i t i o n st h es e q u e n c eo fe a c he n z y m e sh y d m l y s i sc a p a c i t yw a s ： a l c a l a s e f l a v o u r z y m e n e u 打a s e a s 13 9 8 ，a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o no fa l c a l a s e w a sc o n f i r m e dt h a tt h et e m p e r a t u r e = 5 8 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n = 5 ，e n z y m e c o n c e n t r a t i o n = 1 0 ，h v d r o l y s i st i m e = 3 0 0 m i r m t e s t h ep a p e ra j s os t u d i e dt h ea n t i o x i d a 廿o nc a p a c i t yo fs o y b e a np e p t i d e si nt h ef o o d s v s t e ma n dn o n f o o ds y s t e m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es o v b e a n 口e p t i d e sc a n p r o l o n gt h ei n d u c i n gp e r i o d o ft h e a x u n g eo x y g e n a t i o na n dc o o p e r a 把 w i t h h y d r o x v b e n z e n ea n t i o x i d a n tw h i c hw a sm o r eo b v i o u si nt h ef o o ds v s t e m i nm e n o n f o o ds y s t e m ，t h es o y b e a np e p t i d e sc a nc o n t r o lt h ea u t o o x i d a t i o ns p e e d so f o c t a d e c a d i e n o i ca c i da n dd i p h e n o l i cc o m p o u n da n dt h ee 丘b c to nt h el a n e rw a sm o r e o b v i o u s d e x t r a ng e lg - 2 5i nt h i sp a p e rw a su s e dt os e p a r 砒es o y b e a np e p t i d e s ，a n d s d s p 0 1 y a c r y l a m i d eg e 】e l e c t r o p h o r e s i sw a su s e dt om e n s u m t et h em 0 1 e c u l 盯w e i 对1 t o fa 1 1 t i o x i d a t i o np e p t i d e s ，t h e na 1 1e q u a t i o nw a s2 0 t ：y = 1 2 6 1 8 x + 5 1 3 3 8 t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h er a t eo fs o y b e a np e p t i d e s m o v i n gw a sh i g h e rc o m p a r e dw i t h t h el o w - m ws t a n d a r dp r o t e i n ，w h i l et h em ww a s1 0 w e rm u c h a c c o r d i n gt ot h e t h e o r yc a l c u i a t i o n ，t h em wo fs o y b e a np e p t i d e sw a sb e l o w1o o o d t h ep a p e rs t i l ls t u d j e dt h es o l u b l ec h a r a c t e r i s t i co fs o y b e a np e p t i d e si nt h ea c i d b e v e m g e ，a 1 1 dr e v i e w e dt h ec 0 1 0 r ，n a v o ra n ds t a b i l i t yo ft h eb e v e r a g es u c ha sa p p l e ， h a wa n do r a n g e j u i c ea f t e ra d d i n gs o y b e a ni n t ot h e ma 1 1 dt h eo p f i m u f np r o p o r t i o n 】 一c h r 一c o o h + n h 2 c h r ( 2 ) 质子交换 c h r 0 0 h + n h 2 c h r ” 一c h r 、c o o + n h 3 + 一c h r ” ( 3 ) 氨基滴定 n h ，+ 一c h r ”+ o h 。 n h 2 一c h r 、+ h2 0 6 硕：仁学位论文 第二常大豆分离蛋白酶法水解丁艺的研究 在不同氮基酸组成的蛋白质中，可供酶作用的“靶子”有许多个，但是。一定的酶只自裂解 特定类型的肽链同时使肽键裂解的反应条件还必须适台酶的需要范围。 为了提高人豆分离蛋白的水解度增加水解产物得率，需要确定摄住的水解工艺。由于能够 水解缬向质的酶濒7 r 多种，而目再种酶的水解能力筹异较大闭此筛选山水解人豆分离蛋白的适 宜酶类对于提高大豆分离蛋白的水解度有若重要意义。 本章选州儿种蛋白酶对大豆分离蛋白进行水帑罕，研究各种酶的水解特性及最适工艺条件，比 较不同酶的水解能力。 2 3 实验材料与方法 2 3 1 实验材料 1 ) 大豆分离蛋白吉林不二蛋白制品有限公司。 经测定其蛋白质质量分数为9 10 5 ，水分质量分数5 7 8 ，其它质量分数3 1 7 。 2 ) a 【c a l a s e 碱性内切蛋白酶( 液态)丹麦n o v o 公司提供。 经测定其酶活力为29 8 1 0 4 u g 。，最适工作条件为：温度5 5 7 0 ( 取决于底物类型) d 65 85 。 3 ) n e u t r a s e 中性蛋白酶( 液态)丹麦n o v o 公司提供。 其标注活力单位是05 1 0 4 u g ，最适工作条件为：温度4 0 。5 5 。p h5 5 7 5 。 4 ) f | a v o u r z y m e 复台风味蛋白酶( 液态)丹麦n o v o 公司提供。 其活力为15 a ug ，最适工作条件：p h5 5 - 7 5 ，温度3 5 6 0 ( 根据不同底物类型) ； 5 ) a s 】3 9 8 中性蛋白酶( 固态) 无锡星达酶制剂公司提供。 它的最适工作条件：温度大约为5 0 左右，p h6 8 _ 8o ，酶活力为5 2 0 1 0 4 u 一。 2 3 。2 实验仪器 1 ) p h s ，2 5 型酸度计上晦雷磁仪器厂 2 ) l d 4 2 型低速离心机北京医用离心机厂 3 ) 微量凯氏定氮装置 4 ) 恒温水浴锅 5 ) 分析天平 x m t b 数显调节仪 t g 3 2 8 8 型 北京长风仪器仪表公司 湘议天平仪器厂 2 3 3 大豆蛋白酶法水解实验步骤 大豆蛋白水解实验装置简图见图2 】。 按一定的底物浓度准确称取大豆分离蛋白于水解反应器中，加入适量蒸馏水，轻微搅拌至底 物均匀溶解于水中。然后在9 0 下加热1 0 m i n ，进行预处理，之所以这样做是因为大豆球蛋白分 子具有相当紧密的结构，这种极其致密的结构对酶水解具有很强的抵抗力，所以在酶解大豆蛋白 时必须适当进行预处理，使其中的蛋白质复杂结构被打开而形成一条直链，那些原来包藏在分子 内部而不易与酶发生作用的部位，由于分子结构的松散而暴露出来，从而使蛋白水解酶的作用点 硕士学位论文第二章 大豆分离虽白酶法水解工艺的州究 大大增加加快了蛋白质的酶解”。在9 0 下加热l o m n ，既可防止大豆蛋白溶液粘度升高又 可大大提高其水解度。预处理完后冷却到酶解反应温度，用o 5 n 的n a o h 调节酸碱度至所需的p h 值( 8 o ) ，依据所用酶的活力单位，准确量取蛋白酶后加入水解反应器，并慢慢搅拌。反应过程 中及时滴加o 5 n 的n a o h 使p h 值稳定在最适州值。反应到预定时间，即停止加热搅拌。用10 n 的h c l 调：讧p h 至4 5 ，迅速升温到8 5 ，加热l o m i n 钝化蛋白酶。记录水解过程消耗的碱液量， 凭以此计算水解度d 。 l 留靴计 图2 1 大豆多肽水解装置简图 2 3 4 测定方法 1 ) 粗蛋白质含量测定：微嚣凯氏定氮法“” 参照g b 5 0 0 95 - 8 5 2 ) 水分测定：常压烘干法参照g b 5 4 9 5 8 5 3 ) 酶活力测定：福林一酚法参照g b 5 4 7 ，8 0 4 ) 水解度( d h ) 控制及测定：p h s t a t 法 水解度( d e g r e eo f l l y r o i y s j s ) 的定义由f 式给出： d h = 打断肽键的数目，总的肽键数目x 1 0 0 一般地，当蛋白质酶水解过程在p h6 5 以上时，质子化的氨基酸将解离。因此，要保持反 应体系p h 不变，就必须加入碱液，碱液的消耗与水解的肽键数目成正比，。 d h 可通过下式计算 d h = v n 。o h 1 a ( n n a o h m p ) ( 1 hc o i ) 式中： v n 。o h 一一水解过程中用去的n a o h 量( m l ) ， m p 一一萤白总量( g ) n n 国 l n a o h 的当量浓度， h t o t 一一每克蛋白质中肽键的克当量( 取8 3 8 ) ， o 氮基的解离度2 ( 1 0 p h - p k ) ( 1 + l o p h - p k ) ，p h 在本实验中为8 o ，p k 氨基 的p k 可取7 o 进行计算 8 墅主兰竺笙奎 鳖生羔坠墼塑型塑塑 5 ) 平均肽链长度的测定 设定p c l 为酶解物可得到多肽的平均链长，即肽链的平均氨基酸残数，p c l “为大豆蛋白质的 肽链长。断裂( n 一1 ) 个肽键形成n 个小肽链，蛋白质总的肽键数目为p c l r l ，因此，可得 d 二兰二一n 一1 p c l r l 1 0 0 ，由于p c l 6 = n p c l ，左式即为 尸c 厶一l 兰堕一1 d = 曼 一1 0 0 = 尸c 厶一l 一般地。对于大豆蛋白质p c k 为2 0 0 0 一3 0 0 0 ，氨基酸的平均分子量为1 2 5 。则相应蛋白质分 子量w = 2 5 0 0 0 0 叫o 。吼此时t 歹吉i o o 即是a 产歹乞l o 。此式尤适用于较高永解度的 酶解物。 本课题欲制备3 6 个氨基酸残基的低肽混合物所以d h 的控制是水解过程的关键，由于 凸f ! 一l o o ，囚此在本实验中，i = 午控制d h 在2 0 一2 5 之间，此时的p c l 理论上为4 5 ，水解液 p ( 二l 分子蓬大部分虑分布在5 0 。一1 0 之间。 2 3 ，5 实验方法 2 35la i c a i a s e 碱性蛋白酶水解人豆分离蛋向的单因素实验 1 ) 酶用量与水解度单因素实验：分别取2 ，4 ，6 ，8 ，】o 的a 1 c a j a s e 碱性蛋白酶，对大 豆分离蛋白进行水解。 2 ) 反应时间与水解度单因素实验：取5 0 的大豆分离蛋白溶液及1 0 0 的a 】c a l a s e 碱性蛋白酶， 连续水解4 h ，研究水解度d h 与反应时间的关系。 3 ) 温度与水解度单因素实验：取5 0 、5 8 、6 5 三个不同温度，分别水解5 o 的大豆分离蛋 白溶液，研究温度与水解度d h 的关系。 4 ) 底物质量分数与水解度荜圆素实验：分别取3 o 及5 o 的大豆分离蛋白溶液，在相同酶用 景及澡度条件1 f 研究底物质姑分数与水解皮d h 的关系。 2 352a l c a l “e 碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的多因素实验 根据n o v o 公司提供的a i c a l a s e 碱性蛋白酶的最适p h 值，选择底物质量分数、酶用鼍、反 应温度、反席时间等四个因素，每个因素各取三个水平进行k ( 3 4 ) 的正交拉丁方实验，表头设 计如表2 一l 所示。 2 3 5 3n e u t r a s e 中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的实验研究 根据所选用中性蛋白酶的性质，在p h 70 条件下反应，水解完成后在9 5 热水中水浴】o m i n 9 霉面 硕士学位论文第二章 大豆分离虽白酶法水解工艺的研究 以灭酶，选取适当的因索水平进行正交实验正交实验表头设计如表2 2 所示。 表2 一la l c a l a s e 碱性蛋白酶水解大豆蛋白表头设计 试验号 a ( 底物质量分数)b ( 酶用量) c ( 温度)d ( 反应时间) m i n 120 2 o5 0 】8 0 25 0 5 05 8 2 4 0 380 1 006 5 3 0 0 表2 2 n e u t r a s e 中性蛋白酶水解大豆蛋白表头设计 试验号 a ( 温度)b ( 底物质量分数) c ( 酶用量) d ( 反应时间) m i n 1 4 52 0 6 0 2 4 0 25 0 3 ，5 4 0 3 0 0 3 5 55 o 2 03 6 0 2 3 5 4f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶水解大豆分离蛋白的实验研究 f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶活力为1 5 a u 一，最适p h5 5 7 5 ，温度3 5 6 0 ( 根据不同底 物类型) 。由于其与前两种酶均为n o v 。公司产品，所以周样对其水解大豆蛋白做了实验研究，表 头设计如表2 3 所示。 表2 3 f 】a v 。u r z 姗e 复合风味蛋自酶水解大豆蛋白表头设计 ；青酶县 a ( 温度) b ( 底物质量分数) c ( 酶用量)d ( 反应时间) m i n j4 5 3o 2 o1 2 0 2 3 5 5 8 0 6 ，o2 4 0 2 4 实验结果与分析 24j a i c a i a s e 碱性蟹向酶水解大豆分离蛋白的单因素实验 241 l 酶_ | = f j 量与水解度的单因素实验 由图2 2 可知，随着酶用量的增加td h 也随之增加，酶用量为1 0 的水解度比2 的要高 5 5 4 。当酶浓度达1 0 0 以后，d h 上升缓慢，曲线变化较为平缓。考虑价格、成本等因素，确 定】o 0 作为反应的最佳酶用嚣。 坝士学位论文第二章大豆分离至 f 臼酶法水解工艺的研究 图2 2蛋白酶用量对水解度的影响 反应条件：底物质量分数5 0 ，t = 5 0 ，p h = 8 o ，水解时间2 4 0m j n 24 】2 反应时间与水解度的单因素实验 2 5 2 0 】5 1 0 5 o 0 6 01 2 01 8 02 4 0 时问( m in ) 图2 3 反应时间对水解度的影响 反应条件：底物质量分数5 0 ，酶用量1 0 0 ，t = 5 0 ，p h - 8 o 由图2 - 3 可知，在整个水解反应过程中，第1h 内反应剧烈，大豆蛋白的水解占整个水解过程 的8 3 5 6 。第2 b 内水解度变化减缓，占整个水解过程的8 8 7 。而在3 、4 h 之内其水解度变化 很小。 241 3 温度与水解度的单因素实验 由图2 4 可知在其它条件相同的情况下温度商，d h 值相应也高。在前1 8 0 m i n ，三个温 度下的水解度差别较为显著t6 5 的d h 明显高于5 0 的d 。但反应2 4 0m i n 时，6 5 和5 8 的 d “只相差l3 8 。 24l 4 底物质量分数与水解度的单因素实验 由图2 _ 5 可知，在反应6 0 m i n 内，底物质量分数为3 的水解度高于5 的水解度，随着水解 时间的延长t 这种差别逐步减弱，反应到2 4 0 m i n 时前者只比后者高0 5 5 。为提高生产效率， 在实际生产中宜选取较高的底物质量分数。 硕士学位论文 第二章大豆分离蛋白酶法水解工艺的研究 2 5 2 0 l5 1 0 5 0 图2 4温度对水解度的影响 反应磊件：底物质量分数5 ，o ，酶用量1 0 o ，p h = 8 o 2 5 2 0 盆l5 舌1 0 5 o j 。一e * 日t n m l 1 f h g ，i * 5 1 图2 5 底物质量分数对水解度的影响 反应条件：酶用量1 0 0 ，温度5 0 ，p h = 8 0 242a i c a i a s e 碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的多因素实验 由表2 4 及表2 5 可知，影响水解反应的主次关系为：酶用量 反应温度 反应时间 底物质 蕈分数。而且可以看出酶用莓越夫，蛋白质水嘏越充分，但一味地提高酶f 勺用量显然是不经济的： 反应温度以5 8 的水解度最高：反应时间以3 0 0m i n 为宜；底物质量分数虽然以30 时的水解 度高，但从极差分析及图4 中可以看到底物质量分数为50 时水解度与3 0 9 6 时相差无几。而且 5o 的底物质量分数的多肽产率必然要高于3 o 。实验发现，大豆分离蛋白的质量分数超过5 ，o 蹦溶解性变羞，但如果所选的底物质量分数太低，产品的产率及生产效率都不高，所以选取5 o 的底物质量分数较为适宜。通过以上分析可确定正交实验的最佳组合为a 2 8 3 c 2 d 3 ，即底物质量 分数5 0 、酶用量1 0 0 、温度5 8 、反应时间3 0 0 m i n 。 硕士学位论文第二章大豆分离蛋白酶法水解工艺的研究 表2 4 正交试验结果及极差分析表 i n r 2 2 2 3 3 3 6 0 6 7 2 3 5 3 5 5 1 2 3 3 1 2 2 3 1 5 9 5 8 6 0 1 65 9 2 06 2 】9 5 8 1 8 5 7 ，9 o 9 2 6 5 9 9 41 5 6 00 4 f 8 9 6 0 9 8 0 9 4 1 71 9 2 05 0 2 2 9 8 1 9 3 8 2 0 0 8 2 0 7 0 】69 8 1 8 6 2 2 2 3 1 t = l + i i + 儿i = 1 7 8 7 d h = t ，9 = 19 8 o 因素主次b c d a 表2 5 方差分析表 方差来源偏差平方和自由度均方f 值fa 临界值 显著性 a 】16 82 5 8 49 03 】 + b 5 7 322 8 64 4 2 8 c 2 28 92j l4 4 1 7 69 0 + d27 4 21 3 72 1 2 4 误差o 0 6 41o 0 6 4 总和4 3 】29 2 4 3 其它蛋臼酶对大豆蛋白水解作用的研究 2 ，4 3 】n e u 【r a s e 中性登白酶水解大豆分离蛋白的实验研究 实验结果及极差分析见表2 6 。 从表2 6 可见，四个实验因素当中影响最大的是酶用量，其次是反应的温度，反应比较温 平i ，实验过程中为保持其反应环境的p 】值为7 0 不变而加入碱的量也是比较少的。底物质量分 数与反应时间的影响都差不多比较轻微，正交试验的最佳反应条件组合是a 1b 2 c ：d 2 ，即反应温 度4 5 - 底物质量分数3 ，5 ，酶用量4 0 ，反应时间5 h 。而从九个试验来看，数据相差并不算 1 3 ，2 3 2 3 ， 3 。2 “5 f 2 ， 。；6，8 9 颁士学位论文第二章 大豆分离篮白酶法水肼工岂的j i j j _ 究 很大，彼此之间的区分度不是很显著。 表2 6n e u t r a s e 中性蛋白酶正交结果及极差分析表 试验号 a ( 温度)b ( 底物质量分数) c ( 酶用最)d ( 反应时间) m i n 】1 ( 4 5 ) i ( 2 0 ) 】( 6 0 )l ( 2 4 0 ) 2l2 2 2 3j 33 3 4 2 ( 5 0 )l 2 ( 4 o )3 52 2 ( 3 5 )3l 62 31 2 ( 3 0 0 ) 7 3 ( 5 5 )i 3 ( 2 ，o )2 832 l 3 ( 3 6 0 ) 93 3 ( 5 o )21 乩， 15 2 1 5 8 1 5 91 5 5 k u 15 8 1 5 3 1 5 1 1 5 4 k u l5 7 1 5 61 5 7 15 9 r o 0 6 o ，0 5 0 0 80 0 4 冈索主次 c a b d 243 2 f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶水解大豆分离蛋白的实验研究 表2 7 f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶水解正交实验结果与极差分析 试验号 a ( 温度) b ( 底物质量分数)c ( 酶用量) d ( 反应时问) m i n l 】( 4 5 ) 1 ( 3 o ) l ( 2 o )1 ( 1 2 0 ) 2 1 2 22 3 1 3 33 4 2 ( 5 0 )1 2 ( 4 o )3 5 2 2 ( 5o )3 1 6 2 3l 2 ( 1 8 0 ) 7 ：3 ( 5 5 )l 3 ( 6 。o )2 8 3 21 3 ( 2 4 0 ) 9 3 3 ( 8 o )2l 托，0 0 6 9 o0 7 3 0 0 6 9 0 0 6 8 k ，to0 6 9 00 6 8 0 ，0 6 8 o 0 6 8 k o 0 6 6 o 0 6 3 0 0 6 7 o 0 6 7 r0 0 0 4 0 0 0 9 o 0 0 3 o 0 0 l 因素主次 b a c d 1 4 硕士学位论文 第二帝大豆分离蛋白酶法水解工艺的研究 由表2 7 可知，影响f l a v o u r z y m e 复台风味蛋白酶水解蛋白质因素的主次关系依次为底物用 量 反应温度) 酶用量) 反应时间，特别是底物用量的影响显著，其余因素的影响不是很明显。 正交试验的最佳反应条件组合为a 3 8 3 c 3 d 3 ，即反应温度5 5 ，底物质量分数8 o ，酶用量( e s ) 60 ，反应时间4 h 。 243 3a s 1 3 9 8 中性蛋白酶水解火显分离蚩自的实验研究 由表2 8 可知，as 】3 9 8 中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的时间毫达6 h ，水解度最高却仅为 1 94 ，说明此种酶作用较为缓慢，是试验所选择的几种酶中反应摄慢的，不适于作大豆分离蛋 白的水解用酶。 袁2 8 as 13 9 8 中性蛋白酶水解正交试验结果 反应条件p h7 o ，t = 4 0 2 5 ，j 、结 1 ) 本试验用四种蛋白酶对火豆蛋白的水解作用进行了研究，结果发现a l c a l a s e 碱性蛋白酶 的水解速度最快( 在反应的最初3 0 m i n 可完成整个水解过程的6 0 左右) ，即水解大豆分离蛋白 的能力比其它三种蛋白酶要强，最适于做大豆分离蛋自的水解用酶。这一结果与国外采用的商业 碱性酶作为水解蛋白酶的研究结果一致。实验用酶在其摄适反应条件下，水解能力大小依次为 a j c a a s e f i a v o u 田m e n e u t r a s e asf 3 9 8 中性酶。 2 ) a j c a 】a s e 碱性蛋白酶的来源j 1 。泛，酶原充足。对大豆分离蛋白有很好的水解效果，完全 能达到制备多肽的水解度要求。因此，采用a i c a 】a s e 碱性蛋白酶来水解大豆蛋白是可行的。 3 ) a 】c a 】a s e 碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最佳： 艺条件是：温度5 8 ，底物质量分数5o ， 酶用鼍1 00 水解时桶3 0 0m j n 。 硕士学位论文第三章大豆多肽在非油脂体系中抗氧化性能的研究 第三章大豆多肽在非油脂体系中抗氧化性能的研究 3 1 溉述 大_ f 脯对大豆进行j 。泛而深入的研究过稃中，很早就注意到大豆中含有许多具有天然抗氧化 活性的物质。根早以前，我们的祖先就知道豆粉或芝麻粉可以抑制恶臭，将一袋脱脂豆粉悬择在 熔化的猪油中，可长时问保持猪油不变质。近儿十年来，越米越多的科学家对大豆的抗氧化性能 作，“泛而深入的研究。1 9 3 5 年，m u s h e r 就发现，在熟油中添加5 1 0 的人豆粉会大大延氏其贮 藏期“”。此后，许多学者以不同的方式对人豆粉的抗氧化性能进行了研究1 9 7 7 年，r e a y e s 对 大豆粉中存在的天然抗氧化活性物质作了较为全面的综述”。1 9 7 9 年，k is o o nr h e e 等曾对大豆、 棉籽、花生粉以及它们的蛋向质浓缩物干h 分离物的水浸取物进行研究，发现大豆粉水浸墩物显示 的抗氧化活性最强。1 9 8 1 年，k l s o o nr h e e 等义期乙醇对上述材料进行浸取，发现这些油脂蚩白 物质的醇浸取物的抗氧化活性比水浸取物强的多，并且醇溶性物质中抗氧化活性的大小还与浸提 物中酚类物质的量有关。这些研究说明大豆粉、大豆蛋白浓缩物及分离物中含有许多水溶性和醇 溶性的抗氧化活性物质。 根据已有的研究成果，可知大豆中如异黄酮、磷脂类、多肽和各种氨基酸都具有一定的抗氧 化能力“0 1 。所以豆粉常常用作抗氧化剂加入到油脂、焙烤食品或肉制品中去。对丁大豆蛋白抗氧 化性研究领域，大体有以下三方面内容，一是大豆中具有很强的抗氧化活性物质，而这些物质并 不是大豆蛋白本身，而是其共存物，如黄酮类：二是大豆蛋白内部发生非酶褐变反应产生的抗氧 化能力强的产物，主要是大豆蛋白中含量相对比较高的赖氨酸的侧链基团e n h 2 与还原糖作用结 果：三是大豆蛋白降解产物，主要是多肽及游离氨基酸，游离氨基酸有胱氨酸、组氨酸、色氨酸、 精氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸等。对于氨基酸的抗氧化作用，已有很多实验证明，组氨酸和 色氨酸在亚油酸、亚油酸甲酯中有很强的活性经测定，o 0 2 的色氨酸和0 1 5 的赖氨酸对奶油 晟有效。在沙丁鱼油中o 0 2 的脯氨酸的作川等于b h a ( 丁基羟基茴香醚) ，浓度为0 1 时是b h a 的5 倍。脯氨酸经硝化后的产物抗氧化活性增强，这是由于硝化产物可产生硝基游离基n o z 的结 果“”。b i s h o v 和h e n i c k 在1 9 7 2 年指出“”：火豆蛋白水解物中的多肽一氨基酸混合物以及各种 氨基酸都可以作为含油脂食品体系中的初级抗氧化剂，这些物质与酚类抗氧化剂( 如生育酚。b h a 、 b h t 等) 协同作用都显示定的增效作用。因此，他提出可以在食品中添加一定量的大豆多肽， 通过其与酚类抗氧化剂的协同增效作t l j ，使得可以在具有同样抗氧化效果的前提下，降低食品中 酚类抗氧化剂的添加量。此后，口本学者在b ls h o v 等人的研究基础之上，对大豆蛋白水解物的 抗氧化活性进行了更为全面而实j = j 的训f 究。其- p 有学者提出利用人豆蛋白经微生物蛋白酶水解后 的产物作为油脂食品中抗氧化剂的一种具体方法。虽然这一提议现在看来显得还很简单而且粗 糙，但对于实际应用大旦蛋向酶水解产物作为食品抗氧化剂却具有重要意义。1 9 7 5 年，山口直彦 等利_ 【：| j 酶对大豆蚩自进行部分水解，然后比较水解物的抗氧化能力，同时用交联葡聚糖柱色谱进 行分离，并测定了备分离组分的抗氧化能力。具有明显抗氧化性的多肽目前发现的已有十几种， h u a m i n gc h e n 等。分离出6 种具有抗氧化活性的多肽，并测得它们的氨基酸排列顺序如表3 一l 所示。 研究大豆多肽抗氧化性具有十分重要的意义，首先大豆抗氧化多肽可作为食品添加剂( 抗氧 1 6 坝一 学位论文 第三章大豆多肽在非食物体系中抗氧化性能的研究 化剂) 来使用，作为大豆蛋白的降解产物，是属于一类食品，因此没有毒性方面的担忧，可放心 食用。而且它的抗氧化能力较强，8 的大豆蛋白降解物的抗氧化能力比0 0 2 ( 一般用量) t b h q ( 特丁基对苯二酚) 强得多。”1 。另一方面，大豆抗氧化多肽具有一定的生物活性它对人体生理 谰节，延缓衰老方碗也有明显的作用。”。1 9 5 6 年h a r m a n 提出自由基学说，认为人体衰老速度与 体内白由基数量多少有强接关系这些自由基与其他一些活性氧等引发剂枢作用生成脂质自由基 中间产物，后与氧分子反应生成脂质过氧自由基及脂氢过氧化物，自发分解形成更多自由基攻击 其它双键产生的脂质过氧化自由基并传递下去形成连锁反应，脂质过氧化可以引起各种机体的损 伤，研究发现抗氧化肽可以抑制脂质过氧化导致的膜质流动性下降，并且通过将抗氧化肽掺杂到 膜质上，过氧化导致的膜质流动性的下降会被进步抑制。因此，本课题对大豆多肽抗氧化特性 的研究还将有助j ：人们将大豆多肽的加工利用拓展到保健功能性食品的范畴当中。 表3 1 、抗氧化活性大豆多肽氨基酸排列顺序 序号 蝣髓，；雀醛些序 p l v i i i 竽p # 器 】罨由焉! 滞 p 2亡吾b v a l 一a s n p r 。h js g i n a s n p 3l e u l e u p r o h 1 s h is p 4 l e u l e u p r o h i s a l a a s p a l a t y r p 5 v a 卜i l e p r o a ! a g ! y t y r 一堙 一 。一 p 6l e u g 1 n s e r 碲玩一l e u 一德一v a l 一陵一s e r 一西y 一龠一t h r t 嚣t y r 本章主要研究大豆多肽在非食品体系( 亚油酸自氧化体系、邻苯三酚自氧化体系) 中的抗氧 化性能，通过不同水解条件下的大豆肽液在各自体系中抑制其自氧化的速率来确定抗氧化性多肽 的最住水解条件。 3 2 实验材料与方法 3 2 j 主要实验材料 1 ) 大豆分离蛋白 2 ) a l c a l a s e 碱性蛋白酶 3 22 主要化学试剂 弧油酸生化试剂 o0 3 f n o l 几邻苯三酚( 焦性没食子酸) 4 0 k s c n 溶液 吉林不二蛋白有限公司 丹麦n o v o 公司 河北省高碑店市春光试荆厂 用l o m m o l lh c l 新鲜配制，4 保存 7 5 乙醇一03 m 0 1 lh c l 溶液 05 m 0 1 儿的h c j 溶液 00 5 m o 】| 的f e c l r e d t a 溶液 p h 82 t r is h c l 缓冲溶液5 0 m l0l mt r i s + 2 2 9 m lo 1 mh c l ，稀释至1 0 0 m l 0 1 胡f e c i ! 一i 0 nh c l 硕士学位论文 第三章大豆多肽在非食物体系中抗氧化性能的研究 3 2 3 实验仪器与装置 酸度计( p h 计) 分光光度计 分析天平 低速离心机 定时恒温磁力搅拌器 上海雷磁仪器厂 上海光学仪器厂 湘仪天平仪器厂 北京医川离心机厂 上海雷磁仪器厂 3 2 4 测定方法 3 。24 1 大豆多肽抗氧化性洲定：油酸白氧化( 铁一硫氰酸钾法”1 ) 观油酸是不饱利酸，具有在空气中极易被氧化而生成过氧化物的- | 生质，铁一硫氰酸钾法的基 本原理正是基于此。配制一定浓度干一定p h 值的亚油酸溶液体系( o 1 7 5 m l 亚油酸加刘 5 0 0 m l p h 9 3 5 的磷酸缓冲液，混匀) ，放置在较高温度( 5 0 ) 且避光的环境下，亚油酸被氧化成 过氧化物，再通过过氧化物把二价的亚铁离子( f e 2 + ) 氧化成三价的铁离子( f e “) ，三价的铁离 子和硫氰酸撤离子形成了有色络台物 f e ( s c n ) 6 p ，该络台物在4 8 l n m 处有强烈的光吸收，通过 测定其o d 一8 l 值的相对大小而计算出被氧化了的铁离子的量，进而推算出亚油酸自氧化的程度， 该反应涉及到的儿个化学反应式为： r i c = c 如+ 0 2 一r 0 0 h ( i ) f e 2 + + r 0 0 h f e ”+ r o h( 2 ) f e 卜+ 6 s c n 一 f e ( s c n ) 6 3 。( 3 ) 利用亚油酸自氧化来测定大豆多肽的抗氧化能力的原理就是在亚油酸体系中加入一定量的 多肽液，具有抗氧化能力的多肽液能抑制或减缓化学反应式( 1 ) 的进行，亚油酸自氧化速率就 减缓了，最终影“自显色物质 f e ( s c n ) 6 r 的生成，通过测定溶液的0 d ；8 l 值的变化，就能表示出所 加多肽液的抗氧化能力强弱。 亚油酸贮备液的制各：取o ，1 7 5 m l 亚油酸加到5 0 0 m l o 1 m o l 几的磷酸缓冲液中( p h g 3 5 ) 中， 在胶体磨中均质，1 3 酬p a 的压力下作用5 m i n ，溶液呈现均匀乳白色，放入冰箱4 下保存。 多肽液抗氧化力的测定：在小烧杯内，放入1 0 m l 亚油酸贮备液3 0 0ul0 0 5 m 0 1 几的 f e c l2 一e d t a 溶液5 0 0ul 多肽溶液，混匀在暗处5 0 保温l h r 、4 h r 、8 h r ，然后取出1 0 0 0 l ， 加入2 0 0ul o 1 m o l 几的f e c l 2 溶液，再加入1 0 0 0ul 的4 0 k s c n 溶液，混匀后取出1 2 5 pl ，加 入3 m l 乙醇( 7 5 ，含03 m o l 几h c l ) 混匀后，反应5 m i n 再测定该混合液的o 巩以不加肽 的反应液的o d 。8 ，为10 0 ，计算含肽反应液的相对过氧化值，以相对过氧化值的倒数作为相对 抗氧化力。( 不加肽的相对抗氧化力自然为1 ) 。 相对抗氧化值= 含大豆多肽反应液的0 d w 空白反应液的0 d 。 相对抗氧化力= l 相对抗氧化值 ：j ，2 4 2 大豆多肽抗氧化性测定：邻苯三酚白氧化法1 ( 邻苯三酚一t r i s 测0 风2 0 ) 邻苯三酚在碱性条件下迅速发生自氧化反应，释放出o i ，并生成有色的中间产物。该反应 u = _ n n 卿型则胁裂 r f s 2 r 3 、r 2 3 o 一 怔2 g 0 p 计7 t 0 j i 4 硕士学位论义 第三章大豆多肚在非食物体系中抗氧化性能的研究 开始后，溶液先变成黄棕色，几分钟后就转绿，几小时后又转变为黄色，中间产物在4 2 0 n m 处有 强烈的光吸收。在反应体系中加入多肽液，其原理与亚油酸体系类似，由于多肽液存在着抗氧化 性而抑制邻苯三酚的自氧化并阻止中间产物的积累，其变化情况可通过分光光度计测量出来。 根据邻苯三酚自氧化速率的变化，从而推算出大豆多肽液的抗氧化性的强弱”1 。 穆收p h 82 的，i r i s 一缓冲溶液25 m l 纠比色皿中，加入0 5 m l 待测的多肽液再迅速加入n 】m l 的7 m m o l 儿邻苯三酚( 焦性没食子酸) 溶液，随即用小玻璃棒稍搅拌混匀，置于调好的( 波长选 在4 2 0 n m ) 的分光光度计中，待读数变化有规律后，开始读数，以后每隔3 0 s 读数一次，连续记 录到5 m i n 。计算山它的自氧化速率o 仇2 0 t ，而用其自氧化速率米表征其抗氧化力强弱。 3 2 5 实验方法 3251 油酸自氧化法测定大豆多肽抗氧化性 根据2 4 2 所述，选用四因素三水平正交拉r 方表l 9 ( 3 4 ) ，共得到九中不同水解度的大豆多 肽溶液，以下实验即以这九个大豆多肽溶液为研究对象，来分别测定其抗氧化效果。 实验前对未加弧油酸的多肽液进行了吸光度的测定，并于实验1 h r 、4 h r 、8 h r 处分别测其 o d ，以后者相对于前者的比值作为过氧化值。 3 25 2 邻苯三酚白氧化法测定大豆多肽抗氧化性 仍然以前一种方法所选定的水解度不同的九种大豆多肽液为研究对象，通过测定其对邻苯三 酚自氧化速率的影响来表征其相对抗氧化能力。 反应开始前，先做一空白实验。即配置好空白液( 2 5 m lt r i s h c l 缓冲液+ o 3 m l 焦性没食 子酸) ，不加火豆多肽液，然后置于4 2 0 n m 处的分光光度计中，每隔3 0 s 读数，连续记录到5 m i n 。 计算出它的自氧化速率0 d | 2 0 c ，而用其自氧化速率来表征其抗氧化力强弱。 3 2 53 比较二种蛋白酶水解的多肽液抗氧化效果 选取a l c a i a s e 碱性蛋白酶、n e u ”a s e 中性蛋白酶及f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶水解大豆分 离蛋白，分别测定了这三种蛋白酶的水解液在邻苯三酚自氧化体系中反应曲线，比较三者的抗氧 化效果。 3 3 试验结果与分析 3 3 1 皿油酸自氧化法测定大豆多肽抗氧化性 实验结果如表3 - 2 所示根据3 2 4 】所述相对抗氧化力的计算方法分别求得l 、4 、8 h r 后 备肽液的相对抗氧化力，并作出图3 1 。 从隆l3 - 1 中可以看出，就某一样晶来分析，如4 号肽液在1h r 、4 h r 、8 h r 时的相对抗氧化力 分别为l0 2 5 、1 0 1 9 、1 0 1 3 。平均递减o0 0 6 ，颇具有代表性。若以大豆多肽液在皿油酸自氧化 体系中的反应时间考虑，反应1 h r 后，水解度为1 9 3 8 的4 号肽液其相对抗氧化力高于其它各样 品：反应4 h r 后，水解度为2 2 9 8 的3 号肽液，反应8 h r 后，水解度为2 0 5 0 的2 号肽液表现出 9 硕士学位论文第三章大豆多胜在