（动物遗传育种与繁殖专业论文）牛腔前卵泡体外培养研究.pdf

摘要 本实验以从屠宰场收集到的黄牛郛巢中分离得到的腔前卵泡卵母细胞为材料，采 用普通微滴法和多聚赖氨酸铺层法对黄牛腔前卵泡进行体外培养研究，结果如下： 比较了机械分离法和酶结合机械法分离腔前卵泡卵的效果，用机械分离法每个卵 巢回收的卵泡数平均为1 2 6 + 3 6 个( 共分离卵巢1 5 个) ，极显著低于酶结合机械法 的2 8 2 8 6 个( 共分离卵巢1 5 个) ( p o 0 5 ) 。综合比较表明分离腔前卵泡卵的效果酶结合机械法优于机械法。 实验筛选了适宜的基础培养液和牛腔前卵泡体外培养的方法，结果表明：适宜的 基础培养液最佳剂量组合为：d m e m + 5 0 0 m g l 胰岛素+ 5 0 0 m g l 转铁蛋白 + 5 o o u e d l 硒+ 2 0 0 m m o l l c a m p 十2 0 0 m m o v l 谷氨酰胺+ 2 5 0 m m o v l 次黄嘌呤+ 5 血 清：采用适宜的基础培养以普通微滴法和多聚赖氨酸铺层法对牛腔前卵泡进行体外培 养，经过6 天培养，多聚赖氨酸铺层法5 1 的存活率显著高于普通微滴法的3 7 ( p o 0 5 ) 。 在实验筛选出的适宜基础培养液中添加e g f s o n g l 、i g f l7 5 n g l 时腔前卵泡的 存活率最高达到6 6 4 ，极显著高于对照组的4 4 6 ( p o 0 1 ) ，而卵母细胞直径的 平均增幅也达到最大( 4 5 9 2 p m ) ，显著高于对照组的2 8 5 ( p o 0 5 ) 。结果表明，联 合添加e g f 、i g f 一1 能够促进腔前卵泡体外培养的存活率和卵母细胞的生长。 在实验筛选出的适宜基础培养液中添加了不同剂量的f s f l 、1 7i 3 一e ! 以探讨其对牛 腔前卵泡体外培养的影响。结果表明，当添加0 2 5 m g l f s h ，0 5 0 m g l 1 7b - e ! 时， 腔前卵泡体外培养6 天的存活率最高( 达到6 6 7 4 ) ，极显著高于对照组的4 4 6 ( p o 0 i ) 。当添加0 2 5 m g l f s h 、i o o r 喑l l l 7b 一邑时，培养6 天后卵母细胞直径增幅最大 ( 4 2 5 8 “m ) ，显著高于对照组的3 4 6 6 u m ( p o 0 5 ) 。说明联合添加f s h 、1 7b - e ! 对牛 腔前卵泡体外培养的存活和生长都有促进作用。 在实验筛选出的适宜基础培养液中添加5 0 m g le g f + 7 5 m g li g f l + o 。2 5 m g l f s h + l m g l 1 7b e 。体外培养腔前卵泡，结果表明，培养1 2 天卵母细胞直径平均增幅 达到6 2 8 4ui n ，而培养1 2 天后腔前卵泡成腔率为8 7 6 。说明d m e m + 5 0 0 m g 胰岛素 + 5 。0 0 m g l 转铁蛋白+ 5 。o o p g l 硒+ 2 o o m m o t l c a m p + 2 o o r m o l 儿谷氨酰胺 + 2 5 0 m m o l l 次黄嘌呤+ 5 血清+ 5 0 m g le g f + 7 5 n g li g f 一1 + 0 2 5 n g lf s h + l m g l 1 7 1 3 一& 是较好的腔前卵泡培养液。 关键词：牛腔前卵泡卵母细胞体外培养 s t u d yo nc a t t l ep r e a n t r a lf o l l i c l ec u l t u r ei nv i t r o p e n gl o n g d i r e c t e db yv i c ep r o l a is o n g - j i a a b s t r a c t i no r d e rt or e s o l v et h es o u r c e so fp r e a n t r a lf o l l i c u l a ro o c y t e s ，t w o m e t h o d so fi s o l a t i o nw e r ed e v e l o p e di no u re x p e r i m e n t 。t h em e c h a n i c a lm e t h o d r e s u l t e di ni 2 6 + 3 6p r e a n t r a lf o lli c l e sp e ro v a r y ，t h ea v e r a g en u m b e ro f p r e a n t r a lf o l l i c l e sd e r i v e df r o mm e c h a n i c a lm e t h o dw a ss i g n i f i c a n tl o w e rt h a n t h a tf r o me n z y m ea s s o c i a t e dm e c h a n i c a lm e t h o d 。( p o 0 5 ) ，b u tt h es u r v i v a l r a t ef r o m p o l y l y s o s i n el a y e r m e t h o dr i o s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n c e st h a nt h a tf r o m o r d i n a r yc u lt u r em e t h o d ( p o 0 5 ) 。 e x p e r i m e n t a d dt ot h ed i f f e r e n td o s ee g fa n di g f 一1t ot h eb a s i cc u l t u r e s y r e f o t e mf r o mt ot h et oc u l t u r e dt h ec a t t l ep r e a n t r a lf o l l i c l e si nv i t r o ，t h e u l ti n d i c a t e s ：e g fa n di g f = ic a np r o m o t eg r o w t ha n ds u r v i v eo ft h ep r e a n t r a l l i c l e s 。 e x p e r i m e n ta d dt ot h ed if f e r e n td o s ef s ha n d1 7b e ! t ot h eb a s i cc u l t u r e s y s t e mt oc u l t u r e t h ec a t t l e p r e a n t r a lf o i l i c l e s i nv i t r o ，t h er e s u l t i n d i c a t e s ：f s ha n d1 7b e ! c a np r o m o t et h ep r e a n t r a lf o l l i c l eg r o w t ha n d s u r v i v a l 。w h e na d dt o0 2 5 m g lf s ha n d1 o o m g l ，t h er e s u l ti st h eb e s t 。 e x p e r i m e n ts e a r c h t h ed e v e l o p m e n ta f t e rt h ep r e a n t r a lf o l l i c l e sw e r e c l i i t u r e df o r1 2d a y s ，t h er e s u l t si n d i c a t e ：a f t e r1 2d a y sc u l t u r e ，t h em e a n i n c r e m e n t so fo o c y t ei nd i a m e t e rw e r e6 2 8 4 p m ，t h e r ei n t o ，1 8 7 6 c a nf o r m t h ea n t r u m 。 k e yw a r d s ：c a t t l e ：p r e a n t r a lf o l l i c l e ；o o c y t e ；c u l t u r ei nv i t r o 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：刊彰 - h ) f年6 目p 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 一躲影彭 导师签名 舨舷如 r 年g 月彩日 加西年 月日 随着哺乳动物胚胎操作技术的深入研究和商业化胚胎移植技术的迅猛发展，对卵母 细胞和胚胎的需求量与r 俱增。单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法，不仅费用高， 对动物的正常生理功能影响大，而且获得的数量有限，远远不能满足科学研究和商业开 发的需求。从屠宰场废弃卵巢中获取卵母细胞，已成为体外受精，核移植等相关胚胎工 程技术的主要材料来源。但目自口这项技术依赖于具有完全发育能力的卵母细胞的获得， 利用的是卵巢上有腔卵泡卵母细胞。而卵巢上的卵母细胞绝大多数以无腔形式存在于卵 巢皮质内，有腔卵泡所占比例很少。因此，通过建立腔前卵泡的培养体系，获取大量的 具有成熟和受精能力的卵母细胞，将极大地促进胚胎工程技术的应用，并有利于研究卵 泡和卵母细胞的发育规律，对濒危野生动物的保护也有积极的作用。目前动物腔前卵泡 的研究取得了可喜的进展，小鼠腔前卵泡经体外培养、成熟和受精后已经获得后代，猪 腔前卵泡经体外培养和成熟后受精并发育致囊胚，绵羊、山羊和奶牛的腔f f 卵泡经体外 培养后也能形成卵泡腔，这标志着开发利用哺乳动物腔前卵泡资源的可能性。但总体动 物腔前卵泡分离培养技术还不完善，离实际运用还有较大的距离。 l 文献综述 1 1 哺乳动物腔前卵泡卵母细胞体外发育与成熟的研究现状 哺乳动物卵巢卵泡分离技术的丌发丌始于上世纪六十年代，1 9 6 4 年g r o b 等首次用 酶法分离小鼠卵泡并获得了完整卵泡。随之n i c o s i a 等( 1 9 7 5 ) 建立了一套家兔卵巢 各级卵泡的分离技术程序，并比较了不同发育时期兔卵泡的特征。此后r o y 和g r e e w a l d 分别用酶解法分离猪的腔莳卵泡获得成功。动物卵巢腔静卵泡的体外培养开始于上世纪 7 0 年代中期r o y ( 1 9 7 2 ) 比较了l h 和f s h 对原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡生长的影 响。到了上世纪8 0 年代未，有关腔前卵母细胞体外发育和成熟的研究_ 才真证有所突破。 g a a d o f f ( 1 9 9 8 ) 用胶原蛋白包埋法培养直径7 0 8 0 m 的大鼠卵泡，发现9 一1 4 天后有少 数的卵泡直径达4 0 0 8 0 0 p m ，并形成较大的腔体和明显的卵丘。r o y 等( 1 9 8 9 ) 体外培养 仓鼠腔前卵泡卜7 天，研究了l h 、p 、f s h 和1 7 b e ! 对腔前卵泡生长和分化的影响。 t o r r a n c e 等( 1 9 8 9 ) 认为，i o 同龄小鼠腔前卵泡在体外维持生长1 4 天并发现病态卵泡 丌始升高，培养6 天后则降低。c a n i p u r i ( 1 9 8 4 ) 用小鼠成纤维细胞单层与7 1 3 开龄小 鼠卵母细胞共同培养，在其发育过程中获得了生发泡破裂的能力。最令人鼓舞的尝试是 由e p p i n g 等( 1 9 8 9 ) 做出的。他们建立了一套完整的小鼠腔前卵泡体外分离、发育、 成熟和受精的技术。分离了1 2r 龄小鼠卵母细胞一颗粒细胞复合体体外培养1 0 天，最 后将所得到的1 3 7 枚2 - - 4 细胞胚胎移植到7 只假孕母鼠，结果三只母鼠妊娠，产下7 只正常的仔鼠。这也是迄今为止唯一将哺乳动物腔前卵泡卵母细胞体钋发育、成熟、受 精后获得后代的报道。 进入上世纪9 0 年代以后，有关哺乳动物腔前卵泡体外培养的研究逐渐增多，其研 究的内容，手段和方法进一步拓宽。n u t t i n c k 等( 1 9 9 3 ) 将牛的腔前卵泡与放射性成 纤维细胞单层共培养7 天，卵泡直径增加了5 - 3 0 “m ，证明牛腔前卵泡能在体外发育生 长。h i r a o 等( 1 9 9 4 ) 体外培养猪腔前卵泡卵母细胞达到成熟，生发泡破裂，并排出第 极体，进幸亍体外受精后，发现有3 枚卵母细胞被精子穿入，但未能形成原核。9 0 年 代中后期，研究者的研究范围主要集中在各种激素和生长因子对腔前卵泡体外发育的影 响上，这其中包括f s h ( s m i t ze ta l ，1 9 9 8 ：w a n g j i e ta l ，1 9 9 6 ) t g f b ( w a n g j ie t a l ，1 9 9 6 ) ，i g f l ( j e w g e n o we ta l ，1 9 9 6 ) 等。 进入2 1 世纪后研究者们对这一极具挑战性的课题继续进行着不懈的努力。c a r l o s 等( 2 0 0 0 ) 对牛腔前卵泡体外培养表明，i g f - 1 、e g f 联合使用可刺激卵泡细胞的生长， 但对卵母细胞的生长无影响，并发现其所培养的腔静卵泡最长可存活2 8 天，成腔一般 发生在l o 一2 8 天。j i w u 等( 2 0 0 0 ) 在猪上获得突破他们对猪腔静卵泡进行培养，在培 养4 天后发现6 8 的腔前卵泡生长良好，卵母细胞一卵丘复合体完整，5 1 获得了减数分 裂能力并停留在骈i i 。体外受精后5 1 中的4 3 开始卵裂，其中1 3 发育到了囊胚期。 l i u j ( 2 0 0 1 ) 体外培养冷冻保存的小鼠原始卵泡达到成熟，并经体外受精和胚胎移植 获得了活的后代。而d i g b o 等( 2 0 0 3 ) 对猪腔前卵泡体外培养后研究认为：间隙连接在 猪腔前卵泡的发育中起着重要作用。而上皮生长因子( e g f ) 能够牵i j 激猪腔前卵泡表达 c x 4 3 ，并且表达的量与e g f 存在剂量依赖性。2 0 0 4 年，s a n d y 等用两步培养法培养鼠腔 前卵泡，结果表明体外培养腔前卵泡是否能够成腔与丌始培养时腔前卵泡的直径大小相 关性极高。 1 2 腔前卵泡的分离方法 要对腔前卵泡进行体外培养，腔前卵泡的分离是第一个难题。在家畜。出于其卵巢 上的纤维组织十分丰富，使卵泡的分离非常困难( t e l f e r r ，2 0 0 0 ) ，而且与分离一般细 胞不同的是，在对腔前卵泡进行分离时，必需尽力保护腔前卵泡结构的完整性，这就进 一步增加了分离的难度。目前分离腔前卵泡的方法大体上可分为以下几种： 1 2 1 机械分离法 f i g u r e i r e d o 等( 1 9 9 3 ) 将牛卵巢分为二，去掉髓质，然后将皮质用组织切碎机 切碎，用吸管欧打碎块悬液后再过筛检卵。该法耗时较长，回收卵泡的数量有限，但可 以较好的保护卵泡的结构完整。 1 2 2 显微分离法 先将卵巢皮质切割成薄片，然后用细针在显微镜下把可见的腔前卵泡分离出来。 r a l p h 等( 1 9 9 5 ) 用2 3 h 回收5 0 - 6 0 枚牛腔前卵泡。a b i r 等( 1 9 9 7 ) 也用显微分离法回收直径 大于1 2 0 p m 的人腔前卵泡，体外成功培养2 8 d 。周虚等( 2 0 0 2 ) 培养了用该法分离的牛腔前 卵泡，有5 0 形成了卵泡腔。许多的研究都表明，该法主要用于分离大腔前卵泡( 直径 l o o g m 以上) ，但速度极慢，难以满足大量分离的要求，也不适合分离直径小于1 0 0 址r a 的 腔前卵泡，但能保证卵泡的质量。 1 2 3 酶消化分离法 g r o b 等( 1 9 6 4 ) 将卵巢切成两半，去掉髓质部，将皮质置于组织切碎机切碎，然后将碎 块与链蛋白酶和胰蛋白酶共孵一段时间，悬液用吸管吹打，通过网筛后检卵。随之 n i c o s i a 等( 1 9 7 5 ) 用胶原酶建立了一套家兔卵巢各级卵泡的分离技术程序。e p p i n g 等 ( 1 9 8 9 ) 用酶法分离的小鼠腔前卵泡，能在体外发育成熟。用此法分离得到的腔d u 卵泡数 量相对较多但随着研究的深入，发现链蛋白酶、胰蛋白酶、d n a 酶能破坏腔前卵泡的基 底膜，对腔前卵泡发育具有毒性作用( f i g u r e i r e d o1 9 9 3 ) 。 1 2 4 酶消化机械分离法 w a n d j i ( 1 9 9 8 ) 先将牛卵巢切碎，再用胶原酶消化，获得了形态币常，直径在6 0 1 7 0 p m 的腔前卵泡而d o n n e l l y k 等( 1 9 9 4 ) 则选用胶原酶短期孵育猪卵巢，然后进行显微 切割，获得了质量比较高的腔前卵泡。这种方法既不会损伤分离的卵泡又不会将卵泡外 膜细胞或外膜的日0 体细胞消化掉，保证了卵泡结构的完整性。 1 3 腔前卵泡卵母细胞质量判断标准 在倒置相差显微镜下观察，健康腔前卵泡呈圆形或卵圆形，有完整的颗粒细胞层和 完整的基底膜，色泽明亮层次分明。颗粒细胞层数较少的卵泡及卵母细胞清晰可见， 位于卵泡的中 b j 或略偏一侧，镜下表现为圆而明亮，胞质均匀。颗粒细胞层数较多的卵 泡在镜下看不清卵母细胞，其颗粒细胞密而紧凑，紧紧包围着卵母细胞，其外围与膜紧 密相连，外观呈光洁明亮均质：不健康卵泡表现为基底膜模糊或破损，颗粒细胞变暗， 质地不匀，卵母细胞轮廓不规则或卵母细胞从卵泡中逸出。该法是目前最为常用的鉴定 腔前卵泡的质量的手段。但f i g u r e i r e d o ( 1 9 9 4 ) 发现显微镜下形态f 常的卵泡，通 过台盼蓝染色仅有7 7 的卵泡有活力表明此法是不够准确的。 1 4 腔前卵泡的体外培养 1 4 1 基础培养基 腔前卵泡的基础培养液种类较多，主要有：d m e m 、m e m 、t c m l 9 9 、m 1 9 9 、h a m s 一1 0 、 改良的m c c o y s 等用的较多的是d m e m 、m e m 、t c m l 9 9 等。一般均添加一定份额的血清， 1 0 2 5 m m o l lh e p e s 盐等。也有人尝试用无血清体系进行培养，以排除血清中复杂成分 的干扰。如s a e k i ( 1 9 9 0 ) 、h i r a o ( 2 0 0 4 ) 都尝试用p v p ( 聚乙烯吡咯酮) 代替血清进 行培养。但e p p i n g ( 1 9 9 2 ) 认为在无血清中培养的卵泡透明带将比丁f 常硬的多，所以一 般在无血清培养中均添加胎球蛋白以防止这种情况的发生。 1 4 2 培养方法 1 4 2 1 普通培养法 采用常规的微滴法培养腔前卵泡。此法方法简单，较常用。但此法使卵泡平贴于培 养皿底部，卵泡易于丧失三维结构。此法一般需用液体石蜡密封，但液体石蜡对卵泡生 长、发育有一定毒害作用。 1 4 2 2 胶原蛋白铺层法 先用胶原蛋白铺层，然后腔前卵泡霞于胶原蛋白上培养，称为胶原蛋白铺层法，也 称为二维法。周欢敏和张涌( 1 9 9 9 ) 也用该法培养山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞9 d ，直径达 到成熟时的大小( 1 5 0 - m 以上) ，存活率为5 3 。除用胶原蛋白铺层外，l i s a ( 1 9 9 5 ) 用多聚 赖氨酸铺层培养大腔前卵泡，并观察到了卵泡内膜的形成过程和卵泡腔的形成。 【4 ，2 3 琼脂包埋培养 其特点是使用一定浓度的琼脂先行包埋腔前卵泡，再置培养液中培养。也有人先用 胶原蛋白铺层或d 一多聚赖氨酸铺层，再用琼脂包埋进行培养，以尽量模拟体内卵泡的三 维发育模式。即使用胶原蛋白或琼脂糖凝胶等作为基质，将腔前卵泡包埋在中间，待其 凝固后，再添加培养液继续进行讵式培养、由此来模拟体内卵巢的内坏境，以维持卵泡 的形态，防止颗粒细胞扩散。r o y 等( 1 9 8 9 ) 用此法培养仓鼠卵泡，部分卵泡形成卵泡腔。 h i r a o ( 1 9 9 4 ) 使用胶原凝胶作基质体外培养猪大腔前卵泡，卵母细胞达到成熟生发泡 破裂( g v b d ) ，受精后实现了精子穿入。周欢敏( 2 0 0 0 ) 用琼脂糖凝胶作基质培养山羊腔前 卵泡，也有部分形成卵泡腔。 1 4 2 ，4 颗粒细胞铺层法 吸取成年动物卵泡，去除卵母细胞，离心吸收颗粒细胞悬液，稀释后培养2 4 z 、时铺 层，其它程序同普通培养法。c a n i p a r i ( 1 9 8 4 ) 尝试用小鼠单层成纤维细胞与7 一1 3 同龄 小鼠卵母细胞共同培养，在其发育过程中获得了生发泡破裂的能力。 1 4 2 5 卵巢薄片培养法 h o v a h a ( 1 9 9 9 ) 通过组织切碎机将卵巢皮质层切成l o o p m 厚的薄片，然后置于培养 液中进行体外培养，组织培养到一定阶段后在从薄片中分离腔静卵泡。此法适于小腔前 卵泡的培养。 1 5 影响腔前卵泡分离和体外发育的因素 1 5 1 影响腔前卵泡分离的因素 l ，5 1 1 动物年龄 诌：多研究表明，随着卵泡的发育，腔酊卵泡不断退化、闭锁。c a r a m b u l a ( 1 9 9 9 ) 研究发现绵羊胎儿年龄对回收的腔前卵泡有重要影响。陈章言( 2 0 0 2 ) 对猪的研究也表 明，年龄越高腔前卵泡的回收率越低。f i g u r e i r e d o ( 1 9 9 3 ) 用机械法及机械法结合酶 法分离黄牛脍牛、犊牛和成年牛腔前卵泡并培养的结果表明：胎牛9 日巢分离得到的腔前 卵泡数量极显著多于青年牛，而青年牛卵巢分离得到的腔前卵泡又比成年牛多，但随着 牛年龄的增长，其腔前卵泡体外培养的存活率则上升。潘红平等( 2 0 0 3 ) 分离水牛胎牛， 青年牛和成年牛腔前卵泡与f i g u r e i r e d o 的结果相似。而a m e r i m ( 2 0 0 0 ) 用机械法分离 绵羊腔前卵泡，从成年绵羊分离到的腔前卵泡多于胎绵羊。这可能是因为分离方法、分 离工具以及物种不同而造成的。另外从胎儿期动物分离的卵泡绝大多数是原始卵泡，初 级、次级卵泡很少，而从成年动物分离的腔前卵泡初级、次级相对较多，初级卵泡又多 于次级卵泡。 1 5 1 2 卵巢大小及发育状况 高志花等( 2 0 0 4 ) 分离了不同大小卵巢的腔前卵泡。结果绝大多数属于次级卵泡， 其数量与卵巢大小成f 相关系，表明卵巢大小及发育状况在很大程度上决定着腔前卵泡 的采集数量。但r o d r i g u e s ( 2 0 0 0 ) 认为初级和次级卵泡总数与卵巢质量成负相关，与 其结果不一致。他认为卵巢上有无黄体并不影响分离的腔前卵泡的数量和分布，分离的 次级卵泡的数目与卵巢上可见卵泡的数量成负相关关系。而高建民( 2 0 0 1 ) 报道：牛离 体卵巢黄体的不同状况，影响机械分离腔f i i 卵泡的效果。他们的研究表明，大黄体的卵 巢腔前卵泡采集量多，扁平状和表面无黄体型卵巢腔的卵泡采集量少，具有黄体的卵巢 初级卵泡采集数量多于无黄体类型的卵巢，而次级卵泡以黄体为火山口型卵巢为多。 1 5 2 影响腔前卵泡体外发育的因素 1 5 2 1 分离方法 不同的分离方法，不但获得的腔前卵泡数量不同，而且对分离后的培养效果也有较 大的影响。一般用机械分离法获得的腔前卵泡最少，但用机械分离的腔前卵泡的基底膜 能被保留下来，故用此法分离腔前卵泡往往存活时f 、日较长，也有助于卵泡腔的形成；而 用酶法分离腔前卵泡一般得到的数量较多，但由于用酶解法分离的腔前卵泡外膜的膜细 胞和基底膜大部分被消化掉，故培养效果往往不佳。关于胶原酶影响到腔前卵泡存活性 问题已由n f c o s i a 等( 1 9 7 5 ) 证实，他们用电镜研究表明，用胶原酶消化处理时间长于 3 0 分钟，就会发现细胞受损，卵泡脆性增加。r o y 等( 1 9 8 5 ) 认为只要在胶原酶溶液中 添加血清，并设计好酶的浓度和消化时叫就可大大减少这种伤害。而用胶原酶短时阳j 消 化再用机械法分离腔前卵泡的方法结果一般较理想。 1 5 2 2 培养基的选择 大量研究表明，腔日口卯泡体外成熟所采用的培养基不仅对成熟率，而且对体外受精 率及随后的胚胎发育率都有明显的影响。哺乳动物腔前卵泡的培养多用m e m 或d m e m 和 t c m l 9 9 作为基础培养基，其次是w a y m o u t hm b 7 5 2 1 ，但其结果因动物不同而异。高建民 ( 2 0 0 2 ) 比较了几组培养液表明：用基础培养液a m e m 和d m e m 培养的腔的卵泡直径增加 最大，芮荣( 1 9 9 9 ) 研究表明，在体外对山羊腔前卵泡进行培养中，m e m 培养液的效果 要优于m 1 9 9 和w a r m o u t h 。但( ；u p t a 等( 2 0 0 2 ) 用m e m 培养水牛腔前卵泡达4 0 d 没有卵泡腔 的形成。m c c a f e r y 等( 2 0 0 0 ) 平u o u t ie r r e z ( 2 0 0 0 ) 用适合颗细胞培养的m c c o y s 5 a 作为基础 培养基，并添加转铁蛋白、胰岛素和睾酮等因子，结果牛腔前卵泡体外发育达2 8 天并形 成腔。 1 5 ，2 3 培养方法 用微滴法培养虽然比较简单，但卵泡大多不能实现贴壁，难以生长发育以致于退化。 许多研究者采用胶原蛋白、琼脂等基质末模拟体内卵泡的卵巢环境，为卵泡的结构提供 立体支撑，使卵泡不至于严重变形，在一定的时间内能保持卵泡的完整性。如l i s a ( 1 9 9 5 ) 等研究表明，用多聚赖氨酸铺培养大鼠腔前卵泡，不仅能使卵泡存活、生长和发育，而 且在体外还观察到了卵泡腔的形成。在猪和牛的腔前卵泡的培养中，一般均采用胶原蛋 白包埋法，馒卵泡的生长尽可能地接进体内，形成一种立体结构。 1 5 2 4 卵泡大小和每孔入培数 一般认为体外培养的存活率和成熟率与卵泡的大小及其发育阶段无相关性，但大量 的试验证明大腔前卵泡在目前多数条件下易于存活与成熟。h u t s h o f 等( 1 9 9 5 ) 体外培 养牛腔前卵泡，结果发现，牛小腔6 口卵泡( 3 0 7 0 m ) 在体外培养可存活7 天，直径增加 幅度最大为2 0 ，而其大腔前卯泡( 1 7 0 n ) 5 天内直径增加5 5 帅。k a t s k a ( 1 9 9 8 ) 对不 同直径( 7 5 3 2 4 啪) 的猪腔前进行体外培养发现：直径2 7 5 3 7 4 m 的腔前卵泡在体外生 长的时问最长，达2 3 天。而s a n d y ( 2 0 0 4 ) 用两步法培养鼠腔前卵泡结果表明：腔前卵 泡能否培养到成熟阶级与丌始培养时腔前卵泡的直径大小相关性极高，一般直径越大的 越容易培养到成熟阶段。 卵泡的在腔前卵泡的研究中，通常采用卵泡单独培养或群体培养g u p t a ( 2 0 0 2 ) 对水 牛腔前卵泡的单独培养和群体培养( 每组2 4 个腔前卵泡) 进行了研究，观察到当用基础 液培养时，群体培养中腔前卵泡直径平均每天增长了4 i 啪，显著大于单独培养的1 2 啪， 群体培养中腔前卵泡的生长率( 1 4 4 ) 亦显著高于单独培养中腔前卵泡的生长率( 3 9 ) 当用添加i t s 和f s h 的培养液进行培养时，群体培养中腔自h 卵泡直径平均每天增长了 l 7 p m ，显著大于单独培养的7 4 p m ，群体培养中腔前卵泡的生长率( 3 6 4 ) 办显著高于单 独培养中腔前卵泡的生长率( 2 3 6 ) 。说明群体培养的效果要优于单独培养。而周虚 ( 2 0 0 3 ) 用改良的m c c o y s 5 a 无血清培养液培养腔前卵泡研究了卵泡的共培养数对牛腔前 卵泡体外发育的影响。结果表明：每孔1 个和每孔2 个卵泡培养有利于卵泡的生长和发育 在体外培养l j d 时，每孔1 个和每孔2 个卵泡和卵母细胞直径平均增长值显著高于每孔3 个卵泡共培养组( p f 能活化。p o l y a k 等( 1 9 9 4 ) 报道，t g f 一1 31 不影响c y c l i n ； d c d k 2 的表达，但使一种酽 蛋莳u c y c l i n - c d k 2 结合抑制了c y c i i n c d k 2 的活性，从而抑制细胞的增殖。 ， 生长分化因子一9 ( g d f 一9 ) ：g d f 一9 属于t g f 超家族成员关于g d f 一9 对卵泡发育作用 的直接证据来源于对g d f 一9 基因缺失小鼠的研究。d o n d 等( 1 9 9 6 ) 研究表明，在g d f 一9 基因缺失小鼠中，颗粒细胞增殖受到抑制，卵泡膜无法形成，卵泡的发育终止于初级卵 泡阶段。s o l o v y t v a ( 2 0 0 0 ) 在体外添j j i g d f 一9 培养膜细胞发现，g d f 一9 可促进雄激素的 基础分泌，并可协同f o r s k o l i n 诱导膜一问质细胞分泌雄激素，但对f o r s k o l i n 诱导的孕 酮的分泌有抑制作用。而v i f f ( 2 0 0 0 ) 研究表明，当g d f 一9 和f s h 共同处理体外培养的颗 粒细胞时，f s h 诱导的孕酮和雄激素分泌以及l h 受体的表达减弱和抑制，可见g d f 一9 即可 促进颗粒细胞的增殖和分化，又可通过颉抗f s h x 颗粒细胞的促增殖作用。以调节颗粒 细胞的增疆和分化。 活化素( a c t i v i n ) 与抑制素( i n h i b i n ) ：a c t i v i n 也是t ( ；f 家族成员之一。h u l s h o f ( 1 9 9 5 ) 认为活化素是颗粒细胞的产物，对体外培养的初级和次绒卵泡细胞生长有促进 作用，其作用途径是增加腔前卵泡颗粒细胞对胸腺嘧啶脱氧核苷的摄取。f i az h a o ( 2 0 0 1 ) 研究认为激活素能刺激小鼠初级和次级卵泡的生长和腔的形成而且这科r 刺激 作用存在剂量依赖关系i n h i b in 由卵泡颗粒细胞产生，其特定亚单位及其m r n a 能够在各 种哺乳动物的有腔卵泡中首先检测到。抑制素能分别促进由颗粒细胞和泡膜细胞产生的 雌二醇和雄烯二酮的产生。 2 本实验研究的意义和目的 在牛的一生中，只有很少的卵泡被利用，繁殖的后代仅相当于潜在雌性生殖细胞的 万分之几或更少，绝大多数卵泡在腔自口阶段就退化闭锁，这无疑是动物遗传与繁殖资源 上的极大损失。对牛腔前卵泡的体外培养和成熟进行研究，可以有效的利用淘汰的高产 奶牛和屠宰的青年母牛卵巢，获得更多、更优质的未成熟卵，获得腔前卵泡进行卵母细 胞体外生长，成熟和受精，将会最大限度的挖掘存在于其卵巢上的遗传资源，具有巨大 的经济价值和广闶的市场前景。同时这也是研究卵母细胞发生、发育规律的有效手段： 在体外受精、发育后，获得大量廉价的胚胎，可进行转基因、胚胎干细胞等一系列科学试 验，以推动受精生物学发育生物学等学科的发展。本研究旨在研究牛腔前卵泡有效的分 离方法和培养方法，并探讨添加e g f 、i g f l 、f s h 、1 7b 一对牛腔前卵泡体外培养的效 果，以期建立起一个良好的体外培养牛腔前卵泡的体系。 0 3 试验材料和方法 3 1 试验材料 3 1 1 试验动物 本试验所采用的牛卵巢来自雅安飞枫坝屠宰场。 3 1 2 试验的主要仪器设备 l ，一次性微孔过滤器 2 0 2 5 p m 的微孔滤膜 3 c c r ： 4 c 0 ：培养箱 5 相幕显微镜 6 实体显微镜 7 2 4 孔培养板 8 1 ，1 0 0 0 0 电子分析犬平 9 电热恒温干燥箱 1 0 离心机( c e n t r i f u g e ) l lh z s d 水浴振荡器 1 2 超净i ：作台( s w c j ) 1 3 可调式微鼙移液器 3 1 3 主要试验药品 1 转铁蛋白 2 胰岛素 3 胶原蛋向酶 4 d m e n 5 青霉素链霉素合液 6 台盼监 7 c a m p 8 4 i 蜡油 9 h e p e s 1 0 e g f 1 1 i g f l 1 2 t c m l 9 9 干粉 1 3 ，标准胎牛血清 1 4 杜氏磷酸缓冲液 1 5 1 7b e 二 1 6 谷氛酰胺 1 7 促卵泡激素 1 8 促黄体激素 s i g m a s i g m a g l b c o g 【b c o s i g m a s i g m a s i g m a s i g m am 5 9 0 4 a m r e s c o s i g m a s i g m a g l b c o h y c l o n e h y c i o r l e a m r e s c o m i l l i p o r eb e d f o r d t s l g p r 2 5 k s 北京化i 学校附属i 。厂 雅安市沙湾气体供麻站 c e d c o 公司 o l y m p u s o l y m p u s f a l c o n 公司 上簿大平仪器厂 f a 2 0 0 4 犬泮真空仪器厂 上海手术器械厂( m o d e l0 4 0 6 。1 ) 哈尔滨市尔联电子技术开发有限公司 中日合资苏州安泰空气技术有限公司 上海雷勃分析仪式器有限公司 上海华舜生物i 。料有限公司批号：t - 4 3 8 2 上海华舜生物l ：科有限公司批号：5 3 7 75 2 上海华舜生物i ：科有限公司批号：1 7 1 0 0 0 1 7 c a t n o3 t 3 0 0 0 3 il o t n o 1 1 2 9 8 6 9 7 上海华舜生物【：矬有限公司批号：h 9 3 7 7 上海华舜生物1 群有限公司 上海华舜生物r 群有限公司 上海华舜生物i 释有限公司 上海华舜生物。i ：挫有限公司 上海华舜生物1 ：样有限公司批号：e 1 3 0 0 2 0 2 上海华舜生物i ：科有限公司批号：1 5 0 0 3 ，0 6 c a t n o 3 1 1 0 0 - 0 3 5l o t n o 1 1 2 9 8 8 0 c a tn o s h 3 0 0 8 8 0 7l o tn o a j l l1 2 2 7 c a tn o s h 3 0 2 5 6 0 ll 0 tn o a m d l 5 7 4 9 j7 波激素制品厂生产批号：2 0 0 4 0 6 0 4 上海华舜生物| 群有限公司批号：1 4 5 43 8 4 j5 波激素制晶厂生产批号2 0 0 4 0 1 0 2 j 。波激素制晶厂生产批号2 0 0 4 1 0 1 5 3 2 试验设计 试验1随机将3 0 个牛卵巢分成两组，分别用机械法分离和酶结合机械法分离 腔前卵泡，探讨两种分离方法的分离效果。 试验2本实验旨在对基础培养液进行选择按照基础培养液添加成分的不同剂量 设为四个处理组( 1 ) d m e m + 5 o o m g l 胰岛素+ 5 o o m g l 转铁蛋白+ j o o p g l 硒 + o 2 3 m m o l + 1 5 0 咖o l 几c a m p + 1 5 0 m m o l l 谷氨酰胺+ 2 o o m m o l l 次黄嘌呤+ 5 血清：( 2 ) d m e m + 5 o o m g 胰岛素+ 5 o o m g l 转铁蛋白+ 5 o o t l g l 硒+ 2 o o m m o l l c a m p + 2 o o m m o l l 谷氨酰胺+ 2 5 0 m m o l l 次黄嘌呤+ 5 血清：( 3 ) d m e m + 6 5 0 m g l 胰岛素+ 6 5 0 m g l 转铁蛋 白+ 6 j o l 硒+ 1 5 0 m m o l l c a m p + 2 o o m m o i l 谷氨酰胺+ 2 o o m m o l l 次黄嘌呤+ 1 0 血 清：( 4 ) d m e m + 6 5 0 m g l 胰岛素十6 5 0 m g l 转铁蛋白+ 6 5 0 p g l 硒+ 2 o o m m o l c a m p + 1 5 0 m m o l 谷氨酰胺+ 2 5 0 m m o l l 次黄嘌呤+ 1 0 血清。 实验3 本试验旨在比较不同培养方法对水牛腔自u 卵泡的体外发育能力的影响。将 机械分离得到的水牛腔前卵泡随机分为两组，然后分别采用普通微滴法和多聚赖氨酸铺 层法对腔前卵泡进行培养，在第三天换液t 3 ，并在第6 天用显微测微尺测量卵泡的直 径，记录卵泡的存活数。 试验4本试验旨在探讨联合添加e g f 、i g f l 对牛腔前卵泡体外培养的影响以 实验2 筛选出的最佳组别作为基础培养液，根据e g f 、i ( ：f 一1 的不同添加剂量，实验设为 9 个处理组：( 1 ) 基础培养液+ 2 5 n g li g f l + 5 0 n g le ( ；r ：( 2 ) 基础培养液+ 2 5 n g l i g f 一1 + 7 5 n g le g f ：( 3 ) 基础培养液+ 2 5 n g li g f 一1 + l o o n g le g f ：( 4 ) 基础培养液 + 5 0 n g li g f l + 5 0 n g le g f ：( 5 ) 基础培养液+ 5 0 n g li g f l + 7 5 n g le g f ：( 6 ) 基础培养 液+ 5 0 n g li g f l + l o o n g le g f ：( 7 ) 基础培养液+ 7 5 n g li g f l + 5 0 n g le g f ：( 8 ) 基础 培养液* 7 5 n g li g f l + 7 5 n g le g f ：( 9 ) 基础培养液+ 7 5 n g li g f 一1 + t o o n g le g f 。实验 用多聚赖氨酸铺层法对腔前卵泡进行体外培养，每三天换液t 3 ，并在第6 天用显微测 微尺测量卵泡的直径，记录卵泡的存活数。 试验5 本试验旨在探讨联合添加f s h 、1 7b - e ：对牛腔前卵泡体外培养的影响实 验采用用多聚赖氨酸铺层法对腔前卵泡进行体外培养，每三天换液1 3 ，并在第6 天、 用显微测微尺测量卵泡的直径，记录卵泡的存活数以实验2 筛选出的最佳组别作为基 础培养液，根据f s h 、1 7b e ：的不同添加剂量，实验设为4 个处理组：( l ) 基础培养液 + o 2 5 m g l f s h + o 5 0 m g l 1 7b e ：( 2 ) 基础培养液+ o 2 5 m g l f s h + 1 o o m g l 1 7b e ! ：( 3 ) 基础培养液+ o 5 0 m g l f s h + o 5 0 m g l 1 78 一e ：( 4 ) 基础培养液+ 0 5 0 m g l f s h + 1 o o m g l 1 7b e ：。 实验6本试验旨在探讨体外培养1 2 天腔前卵泡发育的情况。以实验2 筛选出的 最佳组别为基础培养液，以实验4 、5 筛选出的最佳添加量添加f s h 、1 71 3 一e ! 、e g f 和 i g f - i ，用多聚赖氨酸铺层法对腔前卵泡进行体外培养，每三天换液1 3 ，并在第6 、1 2 天用显微测微尺测量卵泡的直径，记录卵泡的存活数和成腔情况。 3 3 试验方法 3 3 1 卵巢的收集 从雅安当地屠宰场收集牛卵巢，屠宰后立即摘下卵巢，放入事先准备好的广口保温 瓶，内装3 7 一3 9 。c 左右的灭菌生理盐水，并添加2 0 0 i u m l 青霉素和2 0 0 p g m l 链霉素在 1 小时内尽快运回实验室。 3 3 2 卵巢的处理 把卵巢运回实验室后立即对卵巢进行处理，在2 5 。c 以上的无菌操作室，先对双手进 行消毒处理，在超净工作台上将卵巢从保温瓶中取出，放到盛有l o o m l 生理赫水的玻盘 内，用灭菌不锈钢剪刀剪去韧带及残余的输卵管伞，用纱布浸以温生理盐水，擦去卵巢表 面的血迹，并用7 0 酒精消毒卵巢表面，再用3 8 。c 灭菌p b s 液沈涤卵巢两次，再用无菌滤 纸吸干。 3 3 3 腔前卵泡卵母细胞的分离 3 3 3 1 分离液 t c m l 9 9 h e p e s ( 添加i o f b s + o 2 3 m m o l l 丙酮酸钠+ 2 0 0 i u m l 青霉素+ 2 0 0 u g m l 链霉 素) 3 3 3 2 分离方法 机械分离法：将处理好的卵巢用手术刀将其一分为二，将皮质部与髓质部分离， 再将皮质部置于分离液中，用