（农产品加工及贮藏工程专业论文）荧光分光光度法测定牛奶中三种抗生素残留.pdf

摘要 抗生素广泛用于兽医临床治疗及饲料药物添加剂，然而不规范用药会引起畜禽产 品尤其是泌乳动物乳汁中的药物残留，对人类的健康构成潜在危害。因此，建立一类 准确、简便、高灵敏度的抗生素药物生物残留的检测方法非常必要。荧光分析法是一 种灵敏度高、选择性好、简便快速的分子发射光谱分析法，近年来发展迅速。本文研 究了牛奶三种抗生素残留的荧光分析法。 本文建立了荧光分光光度法测定牛奶中四环素残留的新方法。四环素在 0 1 0 m o l l 的n a o h 溶液中反应，生成强荧光降解产物异四环素，在碱性条件下加入 十六烷基三甲基溴化铵后，荧光强度增大两倍左右。线性动态范围为 5 0 i r t g l 2 5 0 0 p l ；检出限2 0 6 i ，t g l ；样品的加标回收率为8 4 5 6 0 0 , - 9 0 0 6 。本法成 功的用于牛奶中四环素的残留测定。 青霉素是一种高效广谱抗生素类药物，广泛用于预防及治疗奶牛疾病。苄青霉素 在酸性条件下的水解产物之一是青霉胺，与邻苯二甲醛衍生后可生成具有强荧光的1 硫代2 烷基异吲哚衍生物，据此建立了荧光分光光度法测定苄青霉素的新方法。在水 解时间6 0 m i n 、p i l l 0 0 、衍生试剂用量4 0 1 t l 和1 5 m i n 反应时间下，线性动态范围为2 0 5 o 1 0 2 肛l ，检出限为1 3 3 9 9 l ，样品的平均加标回收率为8 9 1 0 ，方法可满足国标 对牛奶中苄青霉素残留的限量要求。 建立了荧光胺衍生荧光分光光度法测定牛奶中新霉素残留的新方法。实验采用三 氯乙酸沉淀牛奶蛋白，并对影响衍生反应的缓冲液p h 、有机溶剂的种类、衍生试剂 用量进行了优化。在以丙酮为有机溶剂、p h 7 2 、衍生试剂用量1 5 0 p l 条件下，线性 动态范围为o 1 2 5 m g l ，检出限为5 2 x 1 0 。2 m g l ，样品的平均加标回收率为9 0 8 8 ， 方法可满足国标对牛奶中新霉素残留的限量要求。 关键词：四环素；苄青霉素；新霉素；衍生；荧光分光光度法；牛奶 d e t e r m i n a t i o no ft h r e ea n t i b i o t i c sr e s i d u e si nm i l kb yf l u o r e s c e n ts p e c t r o p h o t o m e t r y c a n d i d a t el ij i a s u p e r v i s o r c h e ng u a n h u a m a j o ra g r i - p r o d u c tp r o c e s s i n ga n ds t o r a g ee n g i n e e r i n g a b s t r a c t a n t i b i o t i c sa r ew i d e l yu s e df o ra n i m a lc l i n i ct h e r a p y , a n da r ef r e q u e n t l ya d d e di n t o f e e d so ft h ep r e v e n t i o no rt r e a t m e n t so fa n i m a ld i s e a s e s h o w e v e r , i l l e g a la d m i n i s t r a t i o n w i l ll c a dt or e s i d u e si ne d i b l et i s s u e s ，e s p e c i a l l yi nt h em i l ko f g a l a c t o p h o r o u sa n i m a l s ，a n d f i n a l l yd ol a t e n th a r mt oh u m a nh e a l t h t h u s i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pas e r i e so fa c c u r a t e s e n s i t i v ea n dc o n v e n i e n ta s s a y s s p e c t r o f l u o r i m e t r y f l u o r e s c e n c es p e c t u r ai sam o l e c u l a r e m i s s i o ns p e c t r o m e t r yw i t hh i g ha c c u r a c y , g o o ds e l e c t i v i t y , a n dc o n v e n i e n c e ，w h i c hh a sa g r e a td e v e o l p m e n ti nr e c e n ty e a r s t h ef l u o r e s c e n ta s s a y sh a v eb e e ns t u d i e dt od e t e r m i n e t h r e ea n t i b i o t i c sr e s i d u e si nm i l k an e wd e t e r m i n a t i o nm e t h o df o rt e t r a c y c l i n er e s i d u ei nm i l ki s d e v e l o p e db y f l u o r e s c e n ts p e c t r o p h o t o m e t r yi nt h et h e s i s t e t r a c y c l i n ec a nb eh y d r o l y z e da ss t r o n g f l u o r e s c e n ti s o t e t r a c y c l i n ei n0 im o l ln a o hs o l u t i o n t h ef l u o r e s c e n c eo ft h e h y d r o l y z a t ec a nb ei n t e n s i f i e da b o u t2 f o l do fi t s e l fb yc e t y l t r i m e t h y la m m o n i a mb r o m i d e t h el i n e a rd y n a m i cr a n g ei sf r o m5 0 1 a g lt o2 5 0 0 p g l ，d e t e c t i o nl i m i ti s2 0 6 p g l ，a n dt h e r e c o v e r i e so fs p i k e d s a m p l ea r eb e t w e e n8 4 5 6 a n d9 0 0 6 n l em e t h o d w a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no ft e t r a c y c l i n er e s i d u ei nm i l k p e n i c i l l i nh a sab r o a ds p e c t r u mo fa n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n di sw i d e l yu s e df o r p r o p h y l a c t i c o rt h e r a p e u t i cp u r p o s ei nc o wb r e e d i n g p e n i c i l l a m i n ei so n eo ft h e h y d r o l y z a t e so fb e n z y l p e n i c i l l i n u n d e ra c i dc o n d i t i o na n dc a nb ed e r i v a t i z e da s h y p e r f l u o r e s c e n tl - t h i o2 a l d y li s o i n d o l ew i t ho - p h t h a l d e h y d e an e wf l u o r e s c e n t s p e c t r o p h o t o m e t r ya s s a yb a s e do nt h ed e r i v a t i v er e a c t i o nh a sb e e nd e v e l o p e d t od e t e r m i n e b e n z y l p e n i c i l l i nr e s i d u e s u n d e rt h ec o n d i t i o n so fh y d r o l y z a t i o nt i m e6 0m i n ，p h lo 0 ， d e r i v a t i v er e a g e n ta m o u n t4 0 p la n dr e a c t i o nt i m e15 m i n ，t h el i n e a rd y n a m i cr a n g ei sf r o m 3 0 0 g lt o5 0 10 z i _ t g l ，t h ed e t e c t i o nl i m i ti s1 3 3 p g l ，a n dt h ea v e r a g er e c o v e r i e so f s p i k e ds a m p l ei s8 9 10 t h er e q u i r e m e n tf o rr e s i d u eb e n z y l p e n i c i l l i ni nm i l ki nn a t i o n a l s t a n d a r d sc a nb em e tw i t ht h ea s s a y an e wa n a l y t i c a lm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e dw i t hf l u o r e s c a m i n ed e r i v a t i o nt o d e t e r m i n en e o m y c i nr e s i d u ei nm i l k ，m i l kc a r lb ed e p r o t e i n a t e dw i t ht r i c h l o r o a c e t i ca c i d t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so fd e r i v a t i o nr e a c t i o ns u c ha sp ho fb u f f e r , c a t e g o r yo fo r g a n i c s o l v e n t sa n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft r i c h l o r o a c e t i ca c i dw a so p t i m i z e d u n d e rt h eo p t i m u m c o n d i t i o n s ，o r g a n i cs o l v e n ti sa c e t o n e ，p hi s7 2 ，d e r i v a t i v er e a g e n ta m o u n t15 0 b l ，t h e l i n e a rd y n a m i cr a n g ei sf r o mo 1m lt o 2 5 m g l ，t h ed e t e c t i o nl i m i ti s5 2 x10 嘭m g l ， a n dt h ea v e r a g er e c o v e r i e so fs p i k e ds a m p l ei s9 0 8 8 t h er e q u i r e m e n tf o rr e s i d u e n e o m y c i ni nm i l ki nn a t i o n a ls t a n d a r d sc a nb em e tw i t ht h ea s s a y k e y w o r d s ：t e t r a c y c l i n e ；b e n z y l p e n i c i l l i n ；n e o m y c i n ；d e r i v a t i z e ；f l u o r e s c e n c e ；m i l k 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦盔些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：翻玺 签字日期：d 弓年石月秒日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑j 垦盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑兰垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：z 奎伍导师签名： 蹈掺哥 签字日期： 甥年6 月旧日 签字日期： o e6 月胗日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 荧光分光光度法测定牛奶中三种抗生素残留 1 引言 食品安全( f o o ds a f e t y ) 直接关系到人类的生命健康，影响人类的生活质量，食品 安全问题一直是受全世界广泛关注的重大问题。据世界卫生组织估计，全世界每年有 数以亿计的人因食物和水污染而患病，其中因此而丧生的儿章达3 0 0 万。在工业化和 全球化高度发展的今天，随着食品生产和人们生活的现代化，人们对食品的消费方式 逐渐向社会化转变，因此，食品安全事件的影响急剧扩大，对人类的危害更加严重。 近年来发生的同本“大肠杆菌0 1 5 7 事件”、口蹄疫事件，以及2 0 0 3 年的s a r s 事件和 2 0 0 4 年波及多个国家的禽流感事件等全球的食品安全事件都说明了这一点。为此，国 际组织以及各国政府都十分重视食品安全，采取了一系列的控制措施。世界贸易组织 ( w t o ) 将贸易技术壁垒协定( t b t 协定) 和实施卫生与植物卫生措施协定作为 国际贸易的强制性措施。由此可知，食品安全事件不仅对人体健康造成不同程度的影 响，而且在经济上造成重大的损失，对政治、社会发展也产生了重要影响。在我国， 食品安全问题也相当突出，食品中的农药和兽药残留问题是其中一个重要方面，2 0 0 6 年的多宝鱼事件，就是在水产养殖中非法添加氯霉素导致氯霉素残留，引起人们的恐 慌。 兽药残留( v e t e 6 n a r yd r u gr e s i d u e s ) 又称药物残留，是指给畜禽等动物使用药物 后蓄积或贮存在动物细胞、组织和器官内以及可食性产品中的药物或化学物的原形、 代谢产物和杂质。世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会1 9 8 7 年第3 2 次会议将兽 药残留分为七类：抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫药类、 镇静剂类和肾上腺素类u 】。广义上的兽药残留除了由于防治疾病用药引起外，也可由 于使用药物饲料添加剂、动物接触或食入环境中的污染物如重金属、霉菌毒素等引起， 其势必会对人的身体造成危害。近2 0 年来，兽药在畜牧业中的应用日益广泛，其在 降低发病率与死亡率、促生长、提高饲料利用率和改善产品品质方面的作用是十分显 著的，已成为现代畜牧业不可缺少的物质基础。我国是畜牧大国，肉类、禽蛋、蜂产 品产量居世界首位b 1 ，随着人民生活水平的提高，我国也成为了肉、禽、蛋、奶等动 物源性食品的消费大国，动物源性食品安全对我国人民的健康具有十分重要的意义。 1 1 牛奶中抗生素残留现状 抗生素( a n t i b i o t i c s ) ，从狭义上是指微生物在代谢过程中产生的、在低浓度下就能 抑制其他微生物的生长和活动、甚至杀死其他微生物的化学物质。它来源于微生物， 作用对象也是微生物，所以抗生素以前被称为抗菌素。但事实上抗生素不仅对细菌、 霉菌等有抑杀作用，而且对病毒、螺旋体、藻类等其他致病微生物，以及寄生虫和恶 性肿瘤也有良好的抑杀作用，而且抗生素除了来源于微生物外，还可以完全人工合成 或部分人工合成，所以自1 9 4 0 年青霉素应用于临床以来，抗生素的种类己达几千种， 在临床上亦有几百种。根据化学结构等性质，主要包括：p 内酰胺类抗生素、氨基糖 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 苷类抗生素、四环素类抗生素、氯霉素类抗生素、大环内酯类抗生素和磺胺类抗生素。 随着抗生素在畜牧饲养业的广泛应用，牛奶中抗生素残留问题日益得到社会的广 泛关注。在奶牛养殖中，抗生素的主要用途是治疗奶牛临床型、隐性型乳房炎和子宫 内膜炎，尤其是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，乳中的药物残留期可延缓到停药3 5 天，而且抗生素也可以通过肌肉或静脉注射、子宫给药进入乳内，如果在用药后停止 用奶时间不够，或用用药过量使患病奶牛分泌含抗生素的牛奶时间延长，均有可能使 原料奶中抗生素残留超标，并且随着畜牧业的发展，在牛饲料中添加饲料添加剂已十 分广泛，其中含有一定比例的抗生素，主要作用是预防疾病的发生，这也可能造成牛 乳抗生素残留。美国食品和药品管理局( f d a ) 调查结果显示，用药不当是牛奶中抗 生素残留的主要原凶1 3 j 。奶牛使用头孢菌素和青霉素治疗乳房炎后，药物残留如表l 所示【3 1 。 表1 奶牛使用抗菌紊后药物残留情况表 t a b l ei t h er e s i d u e so f m i l c hc o wt r e a t e dw i t ha n t i b i o t i c s 停药时间，d m e d i c i n es t o p p i n gt i m e 抗菌素残留阳性检测率 t h ep o s i t i v er a t eo f a n t i b i o t i cr e s i d u e st e s t e d 头斑菌素 c e p h a l o s p o r i n 青霉素 p e n i c i l l i n 牛奶作为多数家庭的必备营养食品，由于大多数抗生素与人用医药完全相同，所 以尽管牛奶中抗生素残留水平通常很低，但若长期饮用抗生素残留超标的牛奶，无异 于长期饮用小剂量的抗生素，这种长期和极其广泛的非治疗性用药方式导致的残留问 题及其对使用者的健康和环境的负面影响是肯定的。牛奶中抗生素残留引发的急性中 毒的可能性极小，但这种长期、低水平的接触方式主要产生各种慢性、积蓄毒性，主 要表现为：一、人体胃肠道菌群失调。正常人体的胃肠道中，微生物处于菌群抑制状 态。尽管动物性食品中兽药残留很低，但如果人体长期摄入少量的抗生素，可使一部 分胃肠道内的敏感菌群处于抑制或死亡状态，导致条件致病菌大量繁殖或体外病原菌 的侵入，引起人类胃肠道的感染，从而损害人体健康。二、造成人类病原菌耐药性的 增强。长期摄入少量的抗生素，可以导致病原菌对抗生素产生耐药性，同时由于抗生 素经体内代谢，随动物粪便和尿液排出，使环境( 包括土壤、水源) 中都存在抗生素 的残留。环境中的抗生素一方面可进一步通过食物链进入人体，另一方面，使土壤或 水中的微生物发生基因突变或发生耐药质粒的转移，而成为耐药菌，一旦人体感染这 些耐药菌，用抗菌素治疗是无济于事的，这对人类的健康带来极大威胁。三、过敏反 应。许多抗菌药如青霉素、四环素类、磺胺类等均具有抗原性，可引起人的过敏反应， 2 荧光分光光度法测定牛奶中三种抗生素残留 敏感的人喝了含青霉素的牛奶便可出现过敏反应，带来严重的后果。四、致癌、致畸、 致突变作用。某些兽药残留长期或大剂量被人体摄入后，可产生致畸、致癌、致突变 作用。慢性或长期接触食品中的药物残留引起的致癌作用尤其难以发觉，也无法充分 证明。兽药中的一些致畸物质在极低剂量就具有效应，在胚胎发育的关键阶段甚至短 暂接触致畸物质就有可能导致影响胎儿一生的畸形p 7 1 。另外从乳品加工业的角度来 看，原料乳中抗生素残留物还会严重干扰发酵乳制品的生产，对干酪、黄油、发酵乳 制品的起酵和后期风味的形成产生一定影响【8 】。 基于以上危害，联合国粮农组织( w a o ) 及世界卫生健康组织( w h o ) 在1 9 6 9 年提出对各种动物性食品中的抗生素残留提出允许标准，并建议在奶牛接受抗生素治 疗停药后至少3 d ( 最好5 7 d ) 内的奶汁不能作为食用奶的原料，美国食品和药品管理 局( f d a ) 规定每毫升牛奶中的抗生素含量不得超过0 0 6 国际单位，使用抗生素的牛奶 在9 6 h 内应废弃。n 2 0 0 0 年，国际食品法典委员会已经制定了5 4 个兽药的检测标准。 我国也制定了相应的检测方法和最高限量标准。1 9 9 0 年1 1 月颁布的乳与乳制品管理 办法第四条明确规定乳牛在抗生素治疗期及休药后5 天内的乳不得食用和出售。1 9 9 7 年以来，我国陆续出台了饲料添加剂允许使用品种目录、允许作饲料添加剂的兽 药品种及使用规定、动物性食品中兽药最高残留限量、饲料药物添加剂使用规 范、食品动物禁用的兽药及其它化合物清单等，并于2 0 0 2 年对动物性食品中 兽药最高残留限量作了修订。2 0 0 3 年4 月又推出了牛奶质量安全推进计划 2 0 0 3 2 0 0 7 ) ) ，其中抗生素等兽药残留问题得到了极高的重视。我国鲜乳抗生素最高残 留限量( 部分) 见表2 。 3 河北农业大学硕十学位( 毕业) 论文 表2 我国鲜乳抗生素最高残留限量 t a b l e2t h em a x i m u mr e s i d u el i n i t s ( m r l s ) o fa n t i b i o t i c si nm i l k 注释：m r l 单位：“g 几a d i 单位：蜡l 体重，天。a d ha c c e p t a b l e d a i l y i n t a k e 只允许摄入量。是指人一生中每日从食物或饮水中摄 取某种物质而对健康没有明显的危害的量，以人体重为基础计算。m r l 为0 者是违禁药品或化合物 1 2 牛奶中常见残留抗生素的种类及检测方法 1 2 1p - 内酰胺类抗生素及其检测方法 以青霉素类和头孢菌素类为代表的b 内酰胺抗生素是历史最悠久的抗微生物药 物，同时也是最大和最重要的一类抗生素。其作用特点是抑制细菌黏肽转肽酶的活性， 阻止细胞壁的形成，从而呈现很强的杀菌活性。尽管在长期的使用过程中已发现他们 存在抗菌谱窄、耐药性、引起过敏和稳定性差等问题，但由于人们的不懈努力，近三 十年来已经推出效能更强、毒副作用小的各种半合成药物，如广谱、耐酶、耐酸、长 效的半合成青霉素和第三代、第四代头孢菌素类抗生素。无论在过去、现在或将来， p 一内酰胺类药物在抗生素的发展中都具有战略意义。化学结构式： 4 荧光分光光度法测定牛奶中三种抗生素残留 r c o n 4 青霉素类 h r c o n c o o h 头孢菌素类 c h r 上 b 内酰胺抗生素因其廉价和广谱，尽管它仅对革兰氏阳性菌有效，仍被广泛的应 用于治疗养殖动物，并频繁的超标示剂量使用，以残留的形式出现在牛奶等食品中。 相对于其他抗生素而言，d 内酰胺药物本身对肌体没有很强的毒性，因此在临床医学 上对孕妇、儿童都可以对症应用，但是头孢类，尤其是第一代头孢类对肾脏有一定的 毒性，与氨基糖苷类药物或强效利尿类药物合用是会加剧其毒副作用。青霉素类也会 使一些敏感的个体产生十分剧烈的过敏反应。因此对于d 一内酰胺抗生素尤其是青霉素 g 的残留管理要求十分严格。在各类抗感染药物中，p 内酰胺抗生素在牛奶和组织中 的检出的报道最多【9 j ，这就使得发展快速、灵敏的检测方法更加迫切。 p 内酰胺抗生素的检测方法很多，大多数的快速检测方法是以检测此类药物为目 标和标准，其中最简便、快捷的定性和定量的检测方法就是e l i s a 方法【1 ，但化学 和仪器检测方法也是重要的定量检测和最终确认方法。近年来发表的检测方法有微生 物法【l l - 13 1 、电化学法【1 4 , 1 5 1 、高效液相色谱法【1 6 之0 1 、毛细管电泳法【2 、色质连用分析 法【2 2 2 5 1 。 1 2 2 四环素类抗生素及其检测方法 四环素类抗生素在化学结构上都属于氢化并四苯环衍生物，故称为四环素类 ( t e t r a c y c l i n e s ，r c s ) 。t c s 是由放线菌产生的一类广谱抗生素，对革兰氏阳性和阴性细、 立克次氏体等均有抑菌作用，其作用机制主要是和3 0 s 核糖体亚基的末端结合，从而 干扰细菌蛋白质的合成。常用的t c s 有四环素( t e t r a c y c l i n e ，t c ) 、金霉素 ( c h l o r t e t r a c y c i l l i n e ) 、土霉素( o x y t e t r a c y c l i n e ) 去甲基金霉素( d e m e c l o c y c i n e ) 和二甲胺四 环素( m i n o c y c l i n e ) 等。四环素化学结构式： 8 9 o hoo ho 自1 9 4 8 年从金色链丝菌的培养液中分离出金霉素用于治疗斑疹、原发性异型肺 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 炎、泌尿道感染等疾病以来，四环素类抗生素己发展了多个品种，并广泛用于治疗一 些临床上的常见疾病。由于细菌产生了耐药性，现多用于立克次体、衣原体、支原体 等非细菌性感染和布氏杆菌病，以及呼吸道、胆道、尿路及皮肤组织感染。在畜禽生 产中t c s 被广泛作为药物添加剂，用于防治肠道感染和促进生长，由于容易诱导耐 药菌株和导致食品残留，因此许多国家对t c s 残留实施例行监控。 目前常用的检测方法有微生物法【2 6 1 、高效液相色谱法【2 7 。3 2 1 、毛细管电泳法【3 3 , 3 4 l 、 紫外可见分光光度法【3 5 。7 1 、荧光分光光度法【3 8 , 3 9 1 、色质联用测定法【4 0 1 、免疫测定法 4 l 4 2 1 垄笺 口6 1 2 3 氨基糖苷类抗生素及其检测方法 氨基糖苷类抗生素( a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s ，a g s ) 是由氨基糖与氨基环醇形成 的苷。根据氨基环多醇的结构，可将划分为两大类：链霉胺类和2 脱氧链霉胺类。2 脱氧链霉胺类又可以根据脱氧链霉胺环上取代基的数量和位置进一步划分为新霉素 族、庆大霉素族和卡那霉素族。链霉胺类主要有链霉素和双氢链霉素。链霉素的化学 结构式： 链霉胍链霉糖 n - 甲基- l 一葡萄糖胺 a g s 主要作用细菌的核糖体，引起t r n a 在翻译m r n a 上的密码时出现错误， 使合成异常的蛋白质，阻碍易合成蛋白质的释放，从而抑制细菌的生长。a g s 属于静 止期杀菌剂，主要作用于革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌等。由 于已经发现氨基糖苷类抗生素有损伤颅神经、引起失聪和损害肾脏等副作用，所以它 们在食品中的残留量已经引起法高度重视，其中链霉素族由于其较强的毒副作用和容 易产生耐药性己被停止使用。 a g s 结构中不含有共轭双键，故仅具有弱的末端吸收( 低于2 3 0 n m ) ，但结构中 含有较多的活性或极性基团可供设计衍生化检测方法，如氨基( 伯氨或仲氨) ，胍基、 羟基、醛基等。目前常见的检测方法有微生物法【4 3 书】、高效液相色谱法【4 6 。5 0 】、色质 联用测定法f 5 1 - 5 4 1 、免疫测定法【5 6 5 9 1 等。 以上我们可以看到，近年高效液相色谱法、紫外分光光度法、荧光分光光度法、 高效毛细管电泳法以及气相色谱质谱联用法、高效液相色谱质谱联用法等分析方法 抗生素残留分析领域得到了广泛的应用，其中应用最多的是高效液相色谱法，而荧光 6 讲耀伽 荧光分光光度法测定牛奶中三种抗生素残留 分光光度法由于其具有的灵敏度高、专属性强的特点，在兽药残留分析中也有着广泛 的应用。 1 3 荧光分析法在药物分析中的应用 荧光现象的发现己有四百多年的历史，自m o n a r d e s 于1 5 7 5 年从被称“l i g n u m n e p h r i t i c u m ”的切片水溶液发现荧光现象【6 0 1 以来，荧光现象的解释一直无多大进展， 直至1 8 5 2 年s t o k e s 在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光波长比入 射光的波长稍微长些，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的 光，从而引入荧光是光发射的概念1 6 0 。1 8 6 4 年s t o k e s 提出应用荧光作为分析手段， 1 9 2 8 年j e a e 和w e s t 推出第一台光电荧光计【6 0 l ，之后经过一百多年的发展，特别是 现代激光、微处理机和电子学等一些新兴科学技术的引入，大大地推动了荧光法在理 论方面的进展，并相应加速了各种新型荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着 高效、痕量、微观和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高， 方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、环境保护和科学研究的各 个领域中，使荧光检测成为一种重要且有效的痕量组分分析的方法。 荧光分析法应用于药物分析始于十九世纪六十年代，常规荧光分析法最早被应用 于分析抗疟疾药物奎宁【6 。近几十年来，随着荧光分析法的发展，其应用范围日益增 大。荧光分析法广泛应用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等药物的分析1 6 2 。， 范围已涉及合成药物、生物药物及天然药物的分析。由于自身具有发射荧光特性的物 质相对较少，而且由于受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物分 析中的应用受到限制。为了使荧光分析法应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法。 对于不发荧光的物质可以通过某类化学反应使其转变为适合于测定的荧光物质1 6 3 ，川， 对于荧光较弱的物质可以采取荧光增敏分析法 6 5 , 6 6 1 。近年来还发展了各种新型荧光技 术，如激光诱导荧光法【6 7 】、同步荧光法【6 8 1 、荧光探针法【6 9 1 、光化学荧光法【7 0 1 、时间 分辨荧光法f 7 l 】、三维荧光法【7 2 】、偏振荧光法【7 31 、荧光免疫测定法1 7 4 1 等。下面介绍几 种常用于药物分析的荧光光谱分析法。 1 3 1 直接荧光分析法 直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的药物，这些药物分子往往具有大的共轭 7 c 键结构及刚性平面结构。因荧光性质与溶液的p h 值有关，故荧光强度的测定须在 适宜的p h 介质中进行。对于成分复杂的生物供试品，为了防止干扰，有时还要利用 萃取、沉淀、色谱分离等方法除去蛋白质或其他干扰物，以降低荧光空白本底，提高 分析灵敏度。由于大多数抗生素药物分子自身不能产生荧光，因此只有少数的喹诺酮 类、四环素类抗生素直接用于荧光测定1 7 5 - 7 7 j 。 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 3 2 胶束增敏荧光分析法 胶柬增敏荧光分析法是在胶束溶液中进行的荧光分析法。溶液中的表面活性剂分 子在临界胶束浓度时，能够排列成具有一定大小内腔的胶束，可使某种浓度以上难溶 于水的物质( 客体) 在水中的溶解度显著增加，体系的稳定性明显增强。胶束的另一特 性是荧光增敏作用，在这种介质体系中，被增溶的荧光物质的极性、粘度和含氧量等 微环境与其在本体溶液中大不相同，与这些微环境有关的激发光谱、发射光谱、量子 产率和荧光寿命等也不相同。因此，许多客体及客体配合物的荧光强度明显增大。胶 束的存在，大大降低了荧光分子的非辐射过程速率，量子效率增加，激发光寿命增长； 客体分子穿入、吸附和包络于胶束内外，使其行动受到限制，摩尔吸光系数增大，其 激发态也因不被溶液中的荧光熄灭体碰撞而获得保护；而且，当表面活性剂与携带相 反电荷的荧光配离子形成多元离子缔合物，或者表面活性剂的位置与分子中的带电基 团和共扼大7 c 键不相毗邻时，增敏作用非常明显。因此对于某些不发荧光或荧光很弱 的药物无法进行直接荧光分析法测定时，可以通过加入某些增溶增敏试剂来增强药物 的荧光，提高药物分析的灵敏度，如c t a b 、s d s 、t r i t o n x 1 0 0 、b r i j 3 5 等表面活性 剂及坏糊精( c d 、i b - c d ) 的加入能显著增强荧光。在药物测定种常用的几种增敏剂 总结于下表。 表3 增敏剂在药物测定中的应用 t a b l e3s u 血c m t a p p l i c a t i o ni nt h ea n a l y s i so f m e d i c i n e 1 3 3 化学衍生荧光分析法 在兽药残留分析中，大多数的药物如b 内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类抗生素不 产生荧光，不能直接用于荧光检测，需要用荧光衍生试剂进行衍生化，从而结合荧光 基团用于荧光检测器的检测。由于荧光分析方法具有灵敏度高、选择性好的特点，荧 光衍生化试剂的开发和应用已成为十分活跃的研究领域。从化学结构看，荧光衍生化 试剂可分为二类，一类本身具有荧光基团及反应性基团，通过后者与分析对象反应， 得到相应的荧光衍生物：另一类本身并不具备发荧光基团，只有通过衍生反应后才得 到荧光衍生物。下面简单介绍一些常用衍生试剂在药物测定中的应用。 8 荧光分光光度法测定牛奶中三种抗生素残留 1 3 3 1 荧光胺 1 9 6 2 年m e c a m a n 和r o b i n s 利用水合茚三酮测定苯丙氨酸的含量时，发现产生一 强荧光物质，即荧光胺。十年后u d e n f r i e n d l 9 6 1 和他的助手们发现苯丙氨和茚三酮的 产物通过氧化脱梭后形成苯乙醛，在过量茚三酮的存在下能迅速与氨基酸形成强荧光 产物。随后鉴定了这一中问体的结构并命名为荧光胺，荧光胺与氨基酸的反应式如下： o 通常情况下，伯胺、仲胺、醇、水等都能与荧光胺起反应，但只有伯胺形成荧光 衍生物。因此，该试剂是一个选择性试剂，能同伯胺及大多数氨基酸在碱性环境和室 温条件下瞬时反应，衍生物具有高荧光强度，而试剂本身则迅速水解成不发荧光产物， 特别适用柱后衍生也可用于柱前衍生，荧光激发波长3 9 0 n m ，发射波长4 7 5 n m ，其荧 光强度和反应速率与p h 值有关。目前，荧光胺作为荧光衍生化试剂的主要应用于生 物样品中氨基酸和谷胱甘肽含量的测赳9 卜2 1 ，在动物源食品中主要应用于测定含有 伯胺基的磺胺类抗生素i l 盼1 0 9 j ，潘莹宇等将氯霉素的硝基还原，得到可用于荧光胺衍 生的伯胺基，测定了牛奶中的氯霉素残留 1 1 0 , 1 1 1 j 。 1 3 ，3 2 邻苯二甲醛 邻苯二甲醛( o p h t h a l d i a l d e l h y d e ) ，简称o p a 。o p a 能在还原剂巯基乙醇存在下 和伯胺反应生成具有很强荧光的异吲哚衍生产物，反应迅速，在室温下段时问即可完 成，反应产物的激发波长3 2 0 3 6 0 n m ，发射波长4 5 5 n m 。o p a 与伯胺化合物的反应 式由下图所示： r n h 2 + c h o h o h o c h 2 c h 2 s h 汀 s c h z c h 2 0 h i - r 上h 2 0 早在1 9 7 1 年，r o t h 2 1 提出o p a 与氨基酸反应可作为传统的茚三酮法衍生氨基酸 的一种替代。1 9 7 9 年，l i n d r o t h t l l 3 1 等对o p a 衍生氨基酸反应时间、缓冲盐浓度、流动 9 洞北农业大学硕十学位( 毕业) 论文 相p h 值等因素进行了较为系统地考察。进入2 0 世纪9 0 年代，o p a 衍生氨基酸以其操 作简便、反应迅速的特点得到广泛应用。如测定血浆、酒类中的谷胱甘肽和游离氨基 酸【1 1 4 。1 8 j 。近年来，随着食品安全要求的不断提高，o p a 法也广泛应用于动物源食品 中氨基酸和氨基糖苷类抗生素残留的测定【1 19 。1 2 。 1 3 3 3 其他荧光衍生化试剂 近三十年来，荧光衍生分析作为荧光分析最为活跃的领域之一，荧光衍生化试剂 的开发得到了长足的发展，除了上面介绍的荧光胺和邻苯二甲醛，一些常见的荧光衍 生试剂列于表4 。 1 0 表4 常用的荧光衍生化试剂 t a b l e4t h ef l u o r e s c e n c ed e r i v a t i v er e a g e n tu s e dc o m m o n l y 荧光分光光度法测定牛奶中三种抗生素残留 2 碱解增敏荧光法测定牛奶中四环素残留 四环素类抗生素是由链霉菌产生的或经半合成的一类碱性广谱抗生素，可分为天 然和半合成品两类。天然品有四环素、土霉素和去甲金霉素等，半合成品有多西环素、 米诺环素。四环素在我国最为常用，在禽畜生产中t c 被广泛作为药物添加剂，其对 革兰氏阳性和阴性细菌、立克次氏体等均有较好地抑菌作用，在过去的三十年中一度 是动物养殖方面支柱性药物。由于其大量使用而因此导致的诱导耐药菌株和食品残留 问题，已引起了社会的高度关注，许多国家对t c 残留实施了例行监控，我国要求其 在牛奶中的最高残留限量为1 0 0 p g l 。 荧光分光光度法具有灵敏度高，选择性好，试样用量少，快速、简便等优点，在 对痕量物质检测方面具有显著优势。四环素自身发射的荧光强度较弱，发射波长范围 较宽，且呈平台峰，不宣直接采用荧光光度计测定，但其在碱性条件下生成具有强荧 光强度的异四环素( 见图3 ) ，再利用表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 对 其增敏，可有效降低其检出限，完全满足国家标准对该兽药残留的限制要求。 0 h 0 0 h 0 四环素 t e t r a c y c l i n e 2 1 试验部分 2 1 1 主要仪器与试剂 ohoo ho 异四环素 i s o t e t r a c y c l i n e 图3 四环素的水解 f i g 3h y d r o l y s i so ft e t r a c y c l i n e f p 7 5 0 型荧光分光光度计( 日本j a s c o 公司) ； p h s 4 型酸度计( 江苏电分析仪器厂) ； t g 1 6 型离心机( 长沙英泰仪器有限公司) ； 盐酸四环素对照品，购自中国药品生物制品检定所； 十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 为分析纯( 保定内海泰克生物技术有限公司) ； 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 十二烷基硫酸钠( s d s ) 为分析纯( 保定市海泰克生物技术有限公司) ； 1 3 - c d 为分析纯( s i g m a 公司) ； 聚乙烯醇2 0 0 0 和2 0 0 0 0 ( 保定内海泰克生物技术有限公司) ； 聚氧乙烯- 2 3 一月桂醚( b r i j 3 5 ) 为分析纯( s i g m a 公司) 、 硼酸为分析纯( 天津市标准科技有限公司) ； 磷酸分析纯( 天津市标准科技有限公司) ； 氢氧化钠为分析纯( 天津市化学试剂六厂) ； 盐酸为分析纯( 天津市化学试剂一厂) ； 乙酸钠为分析纯( 天津石英钟厂霸州市化工分厂) ； 乙腈均分析纯( 天津市科密欧化学试剂有限公司) ； 水为去离子水，电阻率为1 5 0k q m ； 市售超高温灭菌袋装乳。 2 1 2 试验方法 标准制备：准确称量盐酸四环素2 5 0 0 m g 于5 0 m l 容量瓶定容，此为盐酸四环素标 准储备液。取适量标准储备液于比色管中在0 1 0 m o l l 的n a o h 的条件下，沸水浴加热 4 0 分钟，用乙酸中和至中性，加入3 m m o l l 的c t a b 溶液、硼酸盐缓冲液( p h 9 2 0 ) 定容，此为测定用标准溶液系列。 样品制备：准确量取1 0 0 m l 牛奶，加入l ：4 ( v v ) 的乙酸盐缓冲液一乙腈混合 溶液1 0 0 0 m l ，充分振荡，使蛋白质沉淀，离心除去蛋白质。向上清液中少量多次加 入2 0 0 0 m l 正己烷，振荡，使脂溶性物质溶于正己烷，弃去上层烷层除脂。将下层 清液减压挥干溶剂，之后用和标准制备相同的方法制得样品溶液。 2 1 3 仪器测定条件 荧光液池厚度l c m ，激发波长3 3 6 n m ，发射波长4 1 2 n m ，入射狭缝光谱通带出射 狭缝光谱通带均为5 n m 。 2 2 结果与讨论 2 2 1 四环素水解时间的选择 四环素在强碱性条件下加热可定量转化为异四环素，在沸水浴中当反应时间大于 4 0 分钟时，异四环素的荧光强度趋于稳定，可认为此时的四环素已定量转化为异四 环素，图4 考察了当t c 浓度为2 0 0 0 9 l 时，荧光强度随水解时间的变化趋势。 1 2 荧光分光光度法测定牛奶中三种抗生素残留 8 0 7 0 6 0 k5 0 4 0 3 0 2 0 0510152 02 5 3 0 3 54 04 5