（植物学专业论文）人参液泡膜水孔蛋白基因pgtip1的克隆和功能研究.pdf

摘要 人参液泡膜水孔蛋白基因堙删的克隆和功能研究 水孔蛋白属于主要膜内蛋白家族，是一种水分跨膜运输的功能性的通道 蛋白。植物细胞的生长、发育与细胞内的水分状况密切相关，在生长发育 过程中不同水孔蛋白在时空上的特异表达表明它们参与了植物生理活动的 方方面面。植物组织在体外培养过程中会出现失去对外源激素的依赖性形 成激素驯化细胞的现象，但目前为止激素驯化的生理机制尚未被揭示。我 们在研究激素驯化人参细胞的生长机理时首次发现并克隆了在驯化细胞中 特异表达的人参液泡膜水孔蛋白基因p g 皿p j ，并对它的生理功能进行了研 究。本论文的工作分两部分，第一部分是激素驯化人参细胞系的建立，第 二部分是人参液泡膜水孔蛋白基因段儿p 的克隆和功能研究。 激素驯化是指体外培养的植物细胞失去对外源生长因子需要的稳定的 可遗传的特征，这种现象在胡萝h 、烟草、马铃薯、甜菜、大豆等多种植 物中有过报道。我们从依赖外源生长素和细胞分裂素培养的人参细胞系出 发，通过驯化、筛选获得了不依赖任何外源激素培养的细胞系，并且细胞 的生长状态和生长速度与激素依赖细胞系相似。通过扫描电镜进行的细胞 形态观察结果也表明两类细胞的形态和大小均无明显差异。人参总皂甙含 量的测定结果显示激素驯化人参细胞系的皂甙含量高于激素依赖细胞系， 同时，反转录聚合酶链式反应( r 1 二p c r ) 的结果进一步证明了皂甙合成关 键酶鲨烯合成酶( s q s ) 和鲨烯环氧酶( s q e ) 基因在激素驯化人参细胞中 的表达高于激素依赖的人参细胞，暗示了激素驯化人参细胞系可能具有更 强的皂甙合成能力。由于外源施加的激素类物质会在一定程度上给培养物 带来毒副作用，因此培养激素驯化细胞对植物细胞工程的研究和发展具有 重要的意义。 通过抑制差减杂交和e d n a 文库的筛选，我们发现并克隆了激素驯化 人参细胞系中特异表达的液泡膜水孔蛋白基因晗z z p j 。以激素驯化人参悬 浮细胞为材料，对施加外源k t ( o 2 5 m g l 4 ) 和2 ，4 - d ( 1 5 m g l 。) 处理时 段z 妒，的表达变化作检测，实时( r e a l t i m e ) 荧光r t - p c r 的结果表明，k t 能够显著上调朋丁z 尸j 的表达，而2 ，4 - d 处理则抑制了p g z 妒j 的表达，二 者共同作用时殿勉p j 表达也明显受到了抑制，以上结果无论是在对植物细 胞激素驯化机理的探讨中还是在对水孔蛋白的研究中都是没有报导过的。 由于职z z p 是首次克隆到的人参水孔蛋白基因，我们还从生物信息学和体 外功能验证上对其进行了进一步确认。p g t i p l 的序列分析和结构预测结果 均表明它具有水孔蛋白的特征性序列和结构，爪蟾卵母细胞表达实验也证 明了p g t i p l 是一个功能性的水孔蛋白。将强7 z p j 与g f p 融合表达对其进 行的定位分析表明它主要定位于液泡膜上。由于p g 观p j 特异表达于不依赖 外源激素培养的细胞中，我们推测它极有可能参与了植物细胞的生长发育。 通过在拟南芥中过量表达人参液泡膜水孔蛋白基因段z z p j ，我们对它的生 理功能作了初步研究。结果表明，过表达飓丁z p j 拟南芥的早期生长发育速 度快于野生型拟南芥，主要表现在根的长度增加、叶细胞变大及开花时间 早于野生型对照。另外，过表达p g z z p j 拟南芥的种子大小和重量都高于野 生型拟南芥种子，同时，种子中的脂肪酸含量达到了野生型的1 8 s 倍。以 上结果表明赡z z p j 不仅能够促进细胞的生长，而且还可能在植物种子中的 物质储藏和脂类代谢中起作用。 关键词植物激素水孔蛋白人参拟南芥 a b s t r a c t c l o n i n ga n d f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no fp g t i pl ，at o n o p l a s ta q u a p o r i ni n p a n a x g i n s e n g w u - l i n gl i n l a n ts c i e n c e ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rw e i m i n gc a i a q u a p o r i n sa r ew a t e rc h a r m e lp r o t e i n sf o u n di nt h em e m b r a n e sa n db e l o n g t ot h em a j o ri n t r i n s i cp r o t e i n ( m i p ) f a m i l y 1 1 1 er e g u l a t i o no fc e l l u l a rw a t e r m o v e m e n ta n dh o m e o s t a s i sp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei np l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n t d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fg e n e st h a te n c o d ed i f f e r e n ta q u a p o r i n i s o f o r m sd u r i n gp l a n td e v e l o p m e n th a ss h o w nt ob e a s s o c i a t e dw i t hv a r i o u s p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s h a b i t u a t i o ni sg e n e r a l l yd e f m e da sas t a b l eh e r i t a b l e l o s si nt h er e q u i r e m e n to f c u l t u r e dp l a n tc e l l sf o ro n eo rm o r ee x t e r n a l l ys u p p l i e d g r o w t hr e g u l a t o r s t h ep h y s i o l o g i c a lb a s i so fh a b i t u a t i o ni s s t i l lu n k n o w n i n t h i ss t u d y , w ec l o n e dat o n o p l a s ta q u a p o r i ng e n ep 酊l p l ，w h e ne x p l o r i n gt h e m e c h a n i s mo fh a b i t u a t i o ni np a n a xg i n s e n g ，w h i c h s t r o n gd i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e di nh a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l s f u r t h e rf u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no f p 酊i p lw a sa l s oc o n d u c t e d h a b i t u a t i o ni sc o n s i d e r e da ni nv i t r oe p i g e n e t i es w i t c ht oa u t o t r o p h yf o r e x t e r n a l l ys u p p l i e dp l a n th o r m o n e s i th a sb e e nr e p o r t e di nc a r r o t ，t o b a c c o ， p o t a t o ，s u g a rb e e t ，a n ds o y b e a nc u l t u r e s w ee s t a b l i s h e dah a b i t u a t e dg i n s e n g e e l ll i n eb ys c r e e n i n gt h ea u x i na n dc y t o k i n i nd e p e n d e n tg i n s e n gc e l l s ，w h i c h c a ng r o wi nv i t r oo nh o r m o n e f r e em e d i u mw i t ht h es i m i l a rg r o w t hs p e e d c o m p a r e dw i t h t h a to ft h eh o r m o n ed e p e n d e n tc e l l s t h em o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e rs u c ha st h ec e l ls h a p ea n ds i z eo f t h e s eh a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l si sa l s o s i m i l a rt ot h a to fn o n h a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l s t h et o t a ls a p o n i nc o n t e n to ft h e h a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l sw a sh i g h e rt h a nt h en o n - h a b i t u a t e dc e l l s n 圮 e x p r e s s i o nl e v e l so fg e n e se n c o d i n gs q u a l e n es y n t h a s e 偶q s ) a n ds q u a l e n e e p o x i d a s e ( s q e ) ，k e ye n z y m e so fs a p o n i nb i o s y n t h e s i s ，w e r ea l s oh i g h e ri nt h e h a b i t u a t c dg i n s e n gc e l l sc o m p a r e dw i t ht h en o n - h a b i t u a t e dc e l l s o u rr e s u l t s i n d i c a t et h a tt h eh a b i t u a t e dg i n s e n gc e l ll i n eh a sag r e a t e rc a p a c i t yf o rs a p o n i n p r o d u c t i o nc o m p a r e dw i t ht h a to ft h en o n - h a b i t u a t e dg i n s e n gc e l l s s i n c et h e r e a r es i d ee f f e c t so fe x o g e n o u sg r o w t hr e g u l a t o r s ，h a b i t u a t i o ni np a n a xg i n s e n gi s o fs p e c i a ls i g n i f i c a n c e i no r d e rt oe x p l o r et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f a u t o n o m o u sg r o w t h ，w e s c r e e n e dt h ed i f f e r e n t i a le x p r e s sg e n e si nh o r m o n ea u t o t r o p h i cg i n s e n gc e l ll i n e u s i n gs s h ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) m e t h o da n dc l o n e da n a q u a p o r i ng e n e ( p g t i p l ) s p e c i a l l ye x p r e s s e di nh o r m o n ea u t o t r o p h i cc e l l s u s i n gr e a l - t i m er e v e r s et r a n s c r i p t ( r t ) - p c rm e t h o d ，t h ee x p r e s s i o no fp g t i pl u n d e rd i f i e r e n th o r m o n et r e a t m e n tw a ss t u d i e di ns u s p e n s i o nc u l t u r e dh o r m o n e a u t o t r o p h i cg i n s e n gc e l l s i tw a sf o u n dt h a tt h et r a n s c r i p t sl e v e lo fp z t i plw a s u p r e g u l a t e dm a r k e d l yb yk t ( o 2 5m gl - 1 ) t r e a t m e n t ，d o w n - r e g u l a t e db y1 5 m g1 2 , 4 一da n da l s oi n h i b i t e db yt r e a t e dw i t hb o t ho f t h e ma tt h es a m et i m e p r e v i o u ss t u d i e sp r o v i d el i t t l ei n f o r m a t i o na b o u tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np l a n t a q u a p o f i n sa n da u x i n c y t o k i n i n a n dn or e s e a r c hw a sr e p o s e do na q u a p o r i na n d t h ep h e n o m e n o no f a u t o n o m o u sg r o w t h f o rf u r t h e rc o n f i r m a t i o no f t h i sn e w a q u a p o r i ng e n ei np a n o xg i n s e n g , w ed i d t h eb i o i n f o r m a f i c sa n di nv i t r o f u n c t i o na n a l y s i s s e q u e n c ea l i g n m e n ta n dp r e d i c t e ds t r u c t u r eo f p g t i p l s h o w e di t sd i s t i n c tc h a r a c t e r i s t i co f p l a n ta q u a p o r i na n di t sw a t e rc h a n n e l a c t i v i t yw a sd e m o n s t r a t e db yh e t e r o e x p r e s s e di nx e n o p u so o c y t e ss y s t e m t h e g f p t a g g e dp g t i p ld e c o r a t e dt h et o n o p l a s tm e m b r a n e w h i c hs h o w e di t s s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n s i n c et h es p e c i f i ce x p r e s s i o no fp g t l pli nh o r m o n e a u t o t r o p h i cg i n s e n gc e l l si n d i c a t e di t sp o t e n t i a li n v o i v e m e n ti nc e l ld i v i s i o na n d g r o w t h ，o v e r e x p r e s s i o no fp 窖n pn na r a b i d o p s i sw a sc o n d u c t e dt oe x p l o r ei t s p o s s i b l ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee a r l yg r o w t ha n d d e v e l o p m e n ts p e e do f p g t i p lo v e r e x p r e s s e da r a b i d o p s i sw a sf a s t e rt h a nt h a t o f t h ew i l dt y p ep l a n t s ，w h i c hw a se x h i b i t e db yt h el o n g e rr o o t s ，b i g g e rl e a f c e l l s a n de a r l i e rf l o w e r i n gt i m e m o r e o v e r , b o t ht h es e e ds i z ea n dt h es e e dm a s so f a r a b i d o p s i sp l a n t so v e r - e x p r e s s i n gp 西l p lw e r eg r e a t l ye n h a n c e dc o m p a r e d w i t h 廿l o s eo f t h ew i l dt y p e t h es e e d sf r o mt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sp l a n t sh a d 1 8 5 - f o l d h i g h e r f a t t y a c i dc o n t e n t t h a n t h a t o f t h e w i l d t y p ec o n t r 0 1 t h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a tp g t i p lm i g h th a v ear o l ei ns u b s t a n c es t o r a g ea n d s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ，i na d d i t i o nt op r o m o t i n ge e l le x p a n s i o n e l o n g a t i o n k e yw o r d s ：p l a n th o r m o n e ；a q u a p o r i n ；p a n a xg i n s e n g ；a r a b i d o p s i s 人参液泡膜水孔蛋白基因以丁即1 的克隆和功能研究 文献综述 前言 植物水孔蛋白及其生理功能 在很长时间里，人们头脑中有一个根深蒂固的观念，那就是水分是以 自由扩散的方式穿越细胞膜而进出细胞的。但是，人们也注意到动植物的 一些器官、组织具有独特的水分运转能力( d a i n t y ，1 9 6 3 ) ，例如：动物的 红细胞和。肾上皮细胞，它们运输水分的速度远非只凭自由扩散所能解释的， 人的肾脏细胞平均每昼夜要过滤1 8 0 升的水，植物在种子萌发及花粉管伸 长时要伴随着由体积增大而发生的水分快速吸收，这些现象均使人们猜测 是否存在专门的水分运输孔道( d a i n t y ，1 9 6 3 ；d a i n t y 和g i n z b u r g ，1 9 6 4 ； s t e u d l e 和t y e r m a n ，1 9 8 3 ) 。2 0 世纪9 0 年代初，w a y n e 等推测在植物的质 膜上存在着水分运输通道( w a y n e 和t a z a w a ，1 9 9 0 ) 。1 9 9 2 年p r e s t o n 等第 一次分离出具有水分运输特性的蛋白c h i p 2 8 ( c h a n n e lf o r m i n g p r o t e i no f 2 8k d ) ，它是红细胞质膜内在蛋白，在质膜上形成水分选择性运输通道( h o e k 和y e r k m a n ，1 9 9 2 ；p r e s t o n 等，1 9 9 2 ) ，1 9 9 7 年被基因组命名委员会重命 名为a q p l 。a q p l 的发现，掀起了人们分离、鉴定水孔蛋白( 亦称水通道蛋 白) 的高潮。短短几年内，人们已在细菌、酵母、动物、植物中分离出许 多水孔蛋白同源基因。在植物中第一个水孔蛋白y t i p 是由m a u r e l 等于 1 9 9 3 年从拟南芥中分离出来的。y t i p 的c r n a 在爪蟾卵母细胞( x e n o p u s o o c y t e s ) 中的异源表达，证明它具有水分运输特性，属于植物水孔蛋白中 的液胞膜内在蛋白( t o n o p l a s tm e m b r a n ei n t r i n s i ep r o t e i n ，t i p ) 。植 物质膜内在蛋白( p 1 a s m am e m b r a n ei n t r i n s i cp r o t e i n ，p i p ) 也是在拟 南芥中首次发现的。k a m m e r l o h e r 等( 1 9 9 4 ) 用拟南芥根质膜内在总蛋白产 生的多克隆抗血清来免疫筛选拟南芥根的e d n a 文库，得到了几个阳性克隆， 经鉴定为植物质膜水孔蛋白。 水孔蛋白与g o r i n 等( 1 9 8 4 ) 从牛晶体纤维细胞膜中分离到的m i p ( m a j o r i n t r i n s i cp r o t e i n ) 基因具有很高的序列同源性和结构相似性，因此将它 们同归于m i p 家族，分子质量在2 6 3 4k d 之间，在生物膜中形成水通道并 协助水分跨膜运输的膜内在蛋白。绝大多数水孔蛋白形成水的选择性通道， 但也有一些水孔蛋白同时也可运输小分子中性亲水溶质。与动物相比，植 物具有庞大的水孔蛋白家族，在已经研究的拟南芥中有3 5 个成员，玉米中 有3 1 个成员，水稻中有3 3 个成员，其编码基因的核苷酸长度一般为7 0 0 9 0 0 b p ，大约2 5 0 3 0 0 个氨基酸，而且在核酸和蛋白质水平上，同源性都非常 高，如拟南芥的p i p 2 ：2 和p i p 2 ：3 的同源性达到惊人的9 6 8 ( j a v o t 等， 2 0 0 3 ) 。正如水分参与的生理活动是极其广泛的一样，水孔蛋白参与的生理 活动也是极其广泛的。许多研究表明，植物水孔蛋白的表达具有严格的时 人参液泡膜水孔蛋白基因如r ”j 的克隆和功能研究文献综述 空特异性，并在转录、翻译以及翻译后修饰等水平上受到精密的调控。本 文参考近年来有关水孔蛋白研究的文献，对水孔蛋白的基础研究及其在植 物生理活动中的作用做一概述。 1 水孔蛋白的基本特征 1 1 结构特征和透水机制 水孔蛋白( a q u a p o r i n ，a q p ) 属于主要膜内在蛋白( m a j o ri n t r i n s i c p r o t e i n ，m i p ) 家族，由2 5 0 3 0 0 个氨基酸残基组成，分子量在2 6 - 3 4k d a 之间( p a r k 和s a i e r ，1 9 9 6 ：s c h a f f n e r ，1 9 9 8 ；b a i g e s 等，2 0 0 2 ；t y e r m a n 等，2 0 0 2 ) ，一级结构高度保守。由一级序列可知a q p 蛋白多肽由两个对 称的部分组成( r e i z e r 等，1 9 9 3 ) ，以四聚体的形式存在于膜上，但每一 个单体就是一个独立的功能单位。如图1 所示，a q p 蛋白共有6 个跨膜a 螺旋( h 1 一h 6 ) ，在跨膜螺旋之间形成5 个环( a - e ) ，n 端和c 端都在膜 内侧。其中在b 环和e 环各有一个非常保守的n p a ( 天冬酰胺一脯氨酸一丙氨 酸，a s n p r o a l a ) 区域。在该区域产生突变后，a q p l 的水通道功能就丧失 了( p r e s t o n 等，1 9 9 4 ) 。n p a 结构域非常保守，与水通道的形成直接相关， 可视为a q p 的标志性序列。 图l 水孔蛋白 的二级结构。 ( b u c h a n a n 等， 2 0 0 0 ) 水通道的三维结构看起来像什么? 与动物水通道蛋白的生化和结构分 柝结合起来的建模研究给出了预测( 图2 ) 。a q p 以四聚体的形式存在，在 每一个亚基内都会形成一个微孔，两个n p a 区域折叠进入膜内形成了狭窄 的“漏斗形”水通道( j u n g 等，1 9 9 4 ) 。在植物中，最近人们也得到了精 度为5a 的菠菜水孔蛋白s o p i p 2 ：1 ( k u k u l s k i 等2 0 0 5 ) 的三维结构。 人参液泡膜水孔蛋白基因甩z 口，的克隆和功能研究 文献综述 图2 人红细胞中的 a q p l 的三维结构。 从胞外可以看见8 个 不对称亚基，这8 个 亚基形成2 个四聚 体。( b u e h a n a l 等， 2 0 0 0 ) 除了保守的n p a 区域外，在紧邻n p a 区域靠近膜外侧，a q p 还具有一个 相对保守的被称之为a r r ( a r o m a t i c a r g ) 的结构域。该结构域由第二个 螺旋( h 2 ) 、第五个螺旋( h 5 ) 和e 环上4 个( 个别为5 个) 在空间上相 邻的氨基酸残基构成( 图3 ) 。a r r 区域是在水通道中除n p a 区域之外另 一个孔径较窄的位点，其孔径的大小，对a o p 的选择性和水分的通透性具 有很重要的意义( w a l l a c e 和r o b e r t s ，2 0 0 4 ) 。例如，人类水孔蛋白a q p i 和大肠杆菌甘油通道蛋白g i p f 都属于m i p 家族，它们的结构相似，但前者 只能通过水分，后者只能通过甘油。a q p i 的a r r 区域由p h e 一5 8 ( 螺旋2 ) 、 h i s 一1 8 2 ( 螺旋5 ) 、c y s 一1 9 1 ( e 环) 、h r g 一1 9 7 ( e 环) 组成，形成孔径为 2 8a 的狭小的位点，仅比水分子直径( 2 4a ) 略大，排除了其他较大分 子进入通道的可能性；而g i p f 的a r r 区域由t r p 一4 8 ( 螺旋2 ) 、g l y 一1 9 1 ( 螺旋5 ) 、p h e 一2 0 0 ( e 环) 、a r g 一2 0 6 ( e 环) 组成，形成孔径为3 6a 的较宽的位点，便于较大分子的甘油的通过。 图3 水孔蛋白 a r r 结构域示 意图( a r r 结 构域紧邻n p a 靠近膜外一 侧) 。( w a l l a c e 和r o b e r t s 2 0 0 4 ) 将人的a q p l 蛋白提纯，测定嵌入a q p i 的脂质体的水分渗透系数p f ， 推算出每a q p l 分子每秒钟可通透1 1 4 1 0 1 4c m 3 的水分子( z e i d e l 等， 1 9 9 2 ) 。正如j u n g 等( 1 9 9 4 ) 的“漏斗”模型所推测的。b 环和e 环通过 n p a 区域的相互作用形成了水通道的部分表面结构，螺旋2 和螺旋5 以及螺 人参液泡膜水孔蛋白基因户窖t i p i 的克隆和功能研究 文献综述 旋1 和4 的c 端部分则形成了水通道另外的表面部分( m u r a t a 等，2 0 0 0 ) 。 水分通过a q p l 的活化能e a 值为1 3k jm o l ，与氢键断裂的最大能量1 2 6k j m o l l 相近，这预示着水分通过水通道的过程中可能存在着氢键的断裂与再 形成。根据m u r a t a 等( 2 0 0 0 ) 所报道的a q p l 晶体结构，p h e 2 4 、i l e 6 0 、 l e u l 4 9 和v a l l 7 6 分布在通道内表面，形成一个疏水环境，b 环和e 环的n p a 区域的a s n 7 6 和a s n l 9 2 存在于通道最狭窄的部位，且面向通道内侧而形成 一个正电区域。水分子中的氧原子由于电负性而面向带正电的n p a 区域， 断裂自身氢键，并先后与a s n l 9 2 和a s n 7 6 形成两个氢键，这时水分子的氧 原子与通道轴线垂直，又由于这是一个疏水环境，故这个氧原子不能和其 他基团形成氢键。当后一个水分子靠近这个区域时，同样先与a s n l 9 2 形成 氢键，a s n l 9 2 就将与前一个水分子的氧原子形成的氢键释放，这样水分子 就一个一个通过了水通道中部的狭窄区域( 图4 ) 。 图4 水分子通过水通道蛋 白a q p l 的机制。水分子 在一侧亲水一侧疏水的环 境里一个一个通过水通道 ( a ) ；水分子与a s n 7 6 和 a s n l 9 2 形成氢键及其释放 ( b 、c ) 。( m u r a r a 等， 2 0 0 0 ) 1 2 分类与分布 a q p 是一个大家族，根据其多肽序列( 特别是c 端和n 端的长度) 和分布 情况，植物a q p 可以分为四类：质膜内在蛋白( p l a s m a m e m b r a n ei n t r i n s i c p r o t e i n ，p i p ) 、液泡膜内在蛋白( t o n o p l a s ti n t r i n s i cp r o t e i n ，t i p ) 、 与大豆n o d 2 6 同源的内在蛋白( n o d 2 6 一l i k em i p ，n i p ) 和碱性小内在蛋白 ( s m a l la n db a s i ci n t r i n s i cp r o t e i n s ，s i p ) 。其中p i p 分布在质膜上， 根据c 端和n 端的特征，又可分为p i p l 和p i p 2 ，p i p 2 比p i p l 具有较长的c 末端 和较短的n 末端，p i p 2 的通透水分的能力一般高于p i p l 。t i p 多肽长度短于 p i p 和n i p ，具有很高的通透水分的能力( s c h a f f n e r 等，1 9 9 8 ) 。n i p 主要 分布在豆科的根瘤中，其序列特点与p i p 和t i p 有较大的不同( r e i z e r 等， 人参液泡膜水孔蛋白基因p g t i p l 的克隆和功能研究文献综述 1 9 9 3 ) ，且其在拟南芥和玉米中的膜定位至今未知。c h a u m o n t 等( 2 0 0 1 ) 研究玉米m i p 的结构与分类时发现了一类新的a q p ，即s i p ，它的多肽长度短 于p i p ，与t i p 相当，s i p 的n 端尤其短，且等电点较高，具有更多的碱性氨 基酸，人们推测s i p 可能表现与其它a q p 不同的通道选择性( m u r a t a 等，2 0 0 0 ； f u 等，2 0 0 0 ) 。 对植物a q p 的种类研究得比较详尽的是拟南芥、玉米和水稻。在拟南芥 中发现了3 8 个同源基因，其中有3 个是假基因，在另外的3 5 个基因中分 别有1 3 、1 0 、9 和3 个p i p 、t i p 、n i p 和s i p ( w e i g 等，1 9 9 7 ：q u i g l e y 等，2 0 0 1 ) 。通过对玉米的3 1 个水孔蛋白的a d n a 序列进行分析，发现其中 有1 3 个为p i p ，有1 1 个为t i p ，有4 个为n i p ，还有3 个为s i p ( c h a u m o n t 等，2 0 0 1 ) 。最近，s a k u r a i ( 2 0 0 5 ) 等通过检索水稻基因组测序数据库发 现在水稻中存在3 3 个a q p ，其中1 1 个p i p ，1 0 个t i p ，i 0 个n i p ，和2 个 s i p 。此外，在萝h 中也发现了8 个m i p ，其中有3 个p i p l ，3 个p i p 2 和2 个t i p ( s u g a 等，2 0 0 1 ；s u g a 等，2 0 0 2 ) 。目前人们在哺乳动物中仅发现 1 1 种水孔蛋白( m a t s u z a k i 等，2 0 0 2 ) ，而植物存在如此种类繁多的水孔 蛋白家族成员意义何在是一个值得思考的问题。 许多水孔蛋白在爪蟾卵母细胞表达的实验结果表明t i p 、p i p 2 具有较 强的通透水的能力，而p i p l 往往只有很低的水孔蛋白活性，甚至根本没有 透水能力( d a n i e l s 等，1 9 9 4 ；k a m m e r l o h e r 等，1 9 9 4 ；y a m a d a 等，1 9 9 5 ； w e i g 等，1 9 9 7 ；b i e l a 等，1 9 9 9 ；d i x i t 等，2 0 0 1 ；m o s h e l i o n 等，2 0 0 2 ) 。 后来又有研究发现，玉米水孔蛋白z m p i p l ：2 和z m p i p 2 的m r n a 共同注射于 卵母细胞中，水分渗透系数远远大于z m p i p i ：2 或z m p i p 2 单独注射，且水 分渗透系数的增加依赖于z m p i p i ：2 的m r n a 的注射量。进一步的研究发现， z m p l p 2 能增加z m p i p i ：2 - g f p ( 绿色荧光蛋白) 在爪蟾卵母细胞膜上的荧光 强度，反之，z m p i p i ：2 却不能促进z m p i p 2 一g f p 在爪蟾卵母细胞膜上的荧光 强度( f e t t e r 等，2 0 0 4 ) 。因此，z m p i p 2 可能具有稳定或促进z m p i p i ：2 透水能力的功能，体内p i p l 和p i p 2 可能是以一种非常精密的方式协同作 用的。 根据对通透物质的选择性，水孔蛋白可分为“正统”水孔蛋白( o r t h o d o x a q u a p o r i n s ，b o r g n i a 等，1 9 9 9 ) 和多功能水孔蛋白。“正统”水孔蛋白指 仅能单纯通过水分子而不能通过其他小分子的水孔蛋白，上述讨论的很多 水孔蛋白都属于这一类，例如拟南芥的一t i p ( m a u r e l 等，1 9 9 5 ) 和y t i p ( m a u r e l 等，1 9 9 3 ) 。另有一些水孔蛋白不仅能通过水分子，还能通过甘 油、氨、尿素、c o 。、硼酸或过氧化氢等小分子( t y e r m a n 等，2 0 0 2 ) 。最早 发现的这一类蛋白是大肠杆菌的g i p f ( m a u r e l 等，1 9 9 4 ) ，当时认为g l p f 仅能通过甘油，称之为水甘油通道蛋白( a q u a 9 1 y c e r o p o r i n ) ，后来发现 g i p f 也能通过水分子( b o r g n i a 和a g r e ，2 0 0 1 ) 。大豆的n o d 2 6 也属于这一 类多功能水孔蛋白，除了水分子外，它还能通过甘油和甲酰胺( r i v e r s 等， 6 人参液泡膜水孔蛋白基因t g t i p l 的克隆和功能研究 文献综述 1 9 9 7 ) 。 水孔蛋白广泛地分布于各种植物中( s c h a f f n e r ，1 9 9 8 ) 。在器官水平 上，一些a q p 可在多个器官中表达；另有一些a q p 则具有表达的特异性， 例如t i p ( j o h n s o n 等，1 9 8 9 ；t a k a h a s h i ，2 0 0 4 ) 、t o b r b 7 ( y a m a m o t o 等， 1 9 9 1 ) 和l i m p 2 ( g u e n t h e r 和r o b e r t s ，2 0 0 0 ) 分别是在拟南芥种子、烟草 根和百脉根根瘤中特异性表达的。在组织水平上，有一系列的报道认为水 孔蛋白在根或叶的维管组织及其附近区域有表达( s c h a f f n e r ，1 9 9 8 ) ，这 可能有利于水分通过维管束。在细胞水平上，植物水孔蛋白主要分布在质 膜和液泡膜上。另外，豆科植物根瘤中的一些水孔蛋白分布在类菌体周膜 ( p e r i b a c t e r o i dm e m b r a n e ) 上，这些水孔蛋白与大豆的n o d 2 6 ( r i v e r s 等，1 9 9 7 ) 有高度同源性，被称为n i p ，不过现在也有不少n o d 2 6 的同源物 在非豆科植物( 如拟南芥) 中被发现( b a i g e s 等，2 0 0 2 ) 。 水孔蛋白在植物中的含量也是相当高的。例如，萝h 的t i p 占总液泡膜 蛋白的4 0 ( h i g u c h i 等，1 9 9 8 ) ；菠菜的s o 一6t i p 占总液泡膜蛋白的1 0 1 5 ( k a r l s s o n 等，2 0 0 0 ) ；萝h 的p i p 也占总质膜蛋白的1 0 ( m a e s h i m a ，2 0 0 1 ) ； 拟南芥的五种p i p l 至少占总质膜蛋白的1 ( r o b i n s o n 等，1 9 9 6 ) ；拟南芥 p i p 2 贝u 占总质膜蛋白的1 5 ( j o h a n s s o n 等，1 9 9 6 ) 。水孔蛋白在植物中有 如此高的含量和广泛的分布暗示着它们在植物生命活动中具有极其重要的 作用。 2 水孔蛋白的活性调控 水孔蛋白在生物膜上的存在，不仅使水分跨膜运输成为可能，而其更 大的生物学意义在于它能使植物快速灵敏地调节细胞内与细胞间的水分流 动，有些水孔蛋白是组成型表达的，而多数水孔蛋白是受环境因子，如干 旱、盐、激素、光等诱导表达的，这些就涉及到水孔蛋白的表达调控。调 控机制大致可以分为三类：转录水平的调控、翻译水平的调控和翻译后修 饰。在转录水平上主要通过控制水孔蛋白的合成速度实现，而最近几年的 研究热点集中在翻译后修饰，包括“门控”和亚细胞区域化( 转运与膜定 位) 。 2 1 转录水平的调控 2 1 1 发育阶段调控 植物体的许多水孔蛋白的表达是受发育阶段严格调控的。例如拟南芥 a - - t i p ，存在于种子贮存液泡膜上，它在种子成熟后期积累，在种子萌发 后逐渐消失，而y - - t i p 是在a - - t i p 消失的过程中出现的液胞膜内在蛋白， 主要存在于幼嫩组织的伸长区或分化的细胞中。油菜b n p i p i 则在种子萌发 人参液泡膜水孔蛋白基因尸g t i p i 的克隆和功能研究 文献综述 时期表达。水孔蛋白的这种时空特异性表达主要是由其启动子调控元件决 定的，包括c a m p 反应元件( c r e 元件) 以及c c a a t b o x ( h o z a w a 等，1 9 9 6 ： m a t s u m u r a 等，1 9 9 7 ) 。 2 1 2 环境因子的诱导表达 ( 1 ) 对干旱的响应 已有大量文献报道了a q p 对于干旱在转录水平上的响应，既包括干旱 诱导a q p 的表达，也包括干旱抑制a q p 的表达。例如，水稻的r t i p l ( l i u 等，1 9 9 4 ) 、烟草的n e m i p 2 和n e m i p 3 ( y a m a d a 等，1 9 9 7 ) 都在干旱胁迫后增 加表达，而拟南芥的，一p 、d t i p 和r d 2 8 却在甘露醇胁迫下表达量下 降( w e i g 等，1 9 9 7 ) 。拟南芥中1 3 个p i p 都对干旱产生响应( j a n g 等，2 0 0 4 ) ， 有的表达强烈上调，有的表达则强烈下调。a b a 是干旱的信号传递分子，某 些对干旱响应的a q p 同时也对a b a 响应，如水稻的用h a 、弧p ，船日( m a l z 和s a u t e r ，1 9 9 9 ) 和，俨( l i u 等，1 9 9 4 ) 、冰叶日中花的 - p i p a 2 ( m a r i a u x 等，1 9 9 8 ) 等，而也有一些对干旱响应的a q p 并不对a b a 响应，例如冰叶 日中花的。一p ，忍跃m