（分析化学专业论文）微流控电泳芯片在单细胞分析中的应用.pdf

塑查查堂塑圭兰垡篓塞 中文摘要 微流控分析系统( g t a s ) 在生物细胞领域的发展引起了广泛的关注。微流控 芯片鳃皴米尺寸豹通遂嚣逶舍擎缨躯群熬戆弓l 入，捺缴，反痘，分离蟊捻溅。辫 此将这些功能集成在微流控芯片上成为巍前分析的一个热点。本论文用微流控电 溶芯片对攀缀骢分援送行一些磷究。主黉分三部分：i 徽流控魄泳芯片电纯攀输 测人单个肝癌细胞中的谷胱甘肽。i i 人单个活细胞中过氧化物酶的测定。i i i b f 和c n 。对活细胞内酶活性的影响。 第一部分用微漉控电泳芯片电化学捡测的方法测定了人单个翳癌缁胞中鲍谷 + 砒甘肽。我们选择用电泳缓冲液代替常用的p b s 作为细胞悬浮液，用压力将单 个缀腿导入蕊冀麴双t 交叉点，鼹毛逑黄皂蛩纯学镘魏帮努熬遣缓撼缝合豹漆 腆方式，利用金汞齐电极对谷胱甘肽良好的选择性检测得到单个细胞中锝胱甘肽 潦一熬电泳峰。实褒了芯片毛缨镑毫溶艟l 拖学稔溅荤缨藏豹快蘧分离饶势及选耩 性检测。然后用标准曲线对细胞中谷胱甘肽的含餐进行了定量，测得人单个肝癌 缁藤中谷虢营酝含量与文献篷一皴。 第二部分建立了一种徽流控电泳芯片电化学检测人单个活细胞内髓过氧化物 酶( m p o ) 的方法。我们先用毛地黄皂替将细胞蚀孔，然后通过电迁移将蚀孔詹 鲍单个t 夸性粒鳃腿导入芯慧双t 交叉点菸贴壁。缓狰滚中底戆h 2 q 黧8 2 0 2 遴 过细胞膜上的微孔扩散进入细胞，被胞内m p o 催化反碰生成电活性产物b q 。 b q 通过纲照骥上微孑l 扩散强裂缨瞧翅圉夔溶滚中，在缨蕤簿交澎或b q 区粢。 辩加电泳电压将此区带迁移到分离通道的检测端并用碳纤维微盘电极检测。得到 静瞧溶蜂豹峰瑟积对应予活缡魏内m p o 鹩含量。通过阍一个绸胞溶貘麓电泳潍 黼积及标猴溶液电泳峰的峰面积可以对活细胞内m p o 进行定量。测得人单个中 穗粒细穗内m p o 含量与纲脆提取液中测得值一致。 第三郏分研究了b r 和c n 一对人擎个活中性粒缨孵凌m p o 滠瞧鳇嚣嘀。 b r 一和c n 一对胞内m p o 影响a # 常明照。2 5 x 1 0 。2m o j lb r 对中性粒细胞中 m p o 刺激4 0 r a i n 质其活性降为鼹来鲍3 2 。5 x 1 0 4m o l lc n 慰中蛙数缨戆孛 m p o 活性的抑制作用更显著，4 0r a i n 后其活性降为原来的7 8 。 主题词：微流控芯片，毛细管电泳，电化学检测，单细胞分析 出壅查兰堡主堂垡笙塞一 a b s t r a c t t h i st h e s i sc o n s i s t so ft h r e ep a r t s ：i nc h a p t e ri ，am e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no f g s lii ns i n g l eh u m a n h e p a t o c a r c i n o m a ( h h ) c e l l s w a sd e s c r i b e db ym i c r o f l u i d i cc h i p w i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o na tg o l d m e r e u r ya m a l g a mm i c r o d i s k e l e c t r o d e 。as i n g l e h hc e l li nt h er u n n i n gb u f f e rw a si n t r o d u c e dt ot h ed o u b l et c r o s s i n gb yp r e s s u r e ，t h e n t h ec e l lw a sl y s e db yae l e c t r i cf i e l di nt h e p r e s e n c e o fd i g i t o n i n o n l yo n e e l e c t r o p h o r e t i cp e a k f o rg s h a p p e a r e d o nt h ee t e c t r o p h e r o g r a m t h ec a l i b r a t i o nc u r v e w a s e m p l o y e d t od e t e r m i n et h ec o n t e n to fg s hi ns i n g l eh hc e l l s t h ed e t e c t e dr e s u l t s w e r ei na g r e e m e n tw i t ht h el i t e r a t u r ev a l u e s 1 u c h a p t e r1 i ，a m e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fm p oi n s i n g l e h u m a nl i v i n g n e u t r o p h i t sw b sd e v e l o p e db ym i c r o f l u i d i ec h i pw i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nu s i n g a c a r b o nf i b e rm i e r o d i s ke l e c t r o d e 。a s i n g l e c e l l p e r f o r a t e d w i t h d i g i t o n i n w a s i n t r o d u c e dt ot h ed o u b l et c r o s s i n gw i t he l e c t r o m i g r a t i o n t h em p os u b s t r a t e s ( h 2 q ， 1 2 0 2 ) i nt h er u n n i n gb u f f e re n 耙r e dt h ec e l li n t e r i o rb yd i f f u s i o nv i at h em i c r o p o r e so n c e l lm e m b r a n e m p oi n s i d el i v i n gc e l lc a t a l y s e dh 2 qt ob q ，a n db qd i f f u s e db a c kt o t h es o l u t i o no nt i l ec e l ts u r f a c e ，f o r m i n gab q z o n ea ，t h ez o n eaw a st h e n m i g r a t e d t o t h ew o r k i n ge l e c t r o d ea n dae l e c t r o p h o r e t i cp e a kw a sr e c o r d e d t h ep e a ka r e aw a s c o r r e s p o n d i n gt ot h em p oa c t i v i t yi nt h ec e l l av o l t a g ew a sa p p l i e dt os e p a r a t et h e z o n eaa n dt h ec e l la d h e r e do nt h ew a l l ：t h e nt h ec e l lw a s l y s e da n di n c u b a t e df o r5 n t i nw i t hm p os u b s t r a t e si nt h er u n n i n g b u f f e r , t h ea n o t h e rz o n e ( z o n eb ) w a sf o r m e d b o t hz o n eaa n dz o n ebw e r em i g r a t e dt ot h ed e t e c t i o ne n da n dt h et w o p e a k sw e r e r e c o r d e d t h em p o a c t i v i t yi nt h ec e l lc a l lb eq u a n t i t a t e db a s e do nt h ep e a ka r e ao f z o n eba n dt h e p e a k a r e ao f s t a n d a r ds o l u t i o n 。 i nc h a p t e ri i i ，t h ee f f e c to f b r a n dc n o nm p o a c t i v i t yi na l li n d i v i d u a ll i v i n g c e l lw a ss t u d i e d b y m i c r o f l u i d i c c h i pw i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n t h em p o a c t i v i t y d e c r e a s e dt o3 2 a n d7 。8 。r e s p e c t i v e l y , w h e nt h ep e r f o r a t e dc e l lw a si n c u b a t e di n 2 , 5 x 1 0 2m o l l b r o r5 x 1 0 一m o i l c n f o r 4 0m i n 辩 艨剑性声明 本人郑重声啁：殿呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行删究所散得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人戒集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重鞭贡 献的个入和集体，均已在文中以翡确方式标翳。本声明的法律责任由本人 承掇。 论文作者签名；至耋! 篁日期：竺竺：三：= ! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解1 东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留藏向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电予版，允许论文被套阅 和借阕；本人授权| j 东大学霹以将本学位潦文趋全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文窝汇缡本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：至塞垒毒师签名：4 鉴舅期：趁壁塑墨! 兰 些杰点鲎堡主堂堡堕塞 一 一l 丽舀 一、弓l 富 面慨藏2 1 啦纪科技发展中提出的众多挑战，分析仪器和分析科学也正经历 糟深刻的变革，熬中一个羽益疆繇酶发袋趋势就怒纯学分析设备的微型他、集成 化、与使攫化。堂翦，主要为了避应生命科学发展的嚣受，分据仪器熬发展正在 h 现个以微型化为主要特征的、带有革命性的煎要转折时期。鞠j 十年前微电予 技术在售慧秘擎静发震中霉l 发了一场革愈，并黠怂毽笼瓣科技发震起了羹要匏 推动作用。最近的发展表明，9 0 年代初幽瑞士的m a n z 和w i d m e r 提出的以微机 电) t i - y 鼓拳( 戮i c r o e l e c t r o m e c h a n i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 为鏊磕翁“镞銎全努撰系 缆”( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，或m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，l u t t a s ) 【l 】 豫计在未来千年内氇褥对分桥科学乃至整个科学技术静发震发撵褶截的作雨。 r t t a s 的融的是邋过化学分橱设蠢的微型化与集戏化，娥大眼鹱她把分糖实验室 羽功能转移至0 便携的分祈设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上。由于这种特征， 本领域的令更为逯谂黪痿称“芯片实验塞”l a b o n - a - c h i p ，l o c ) 经被鑫蓥广。 泛地接受。在分析系统微型化、嫩成化的基础上，i t t a s 的最终目标是实现分析 实验室夔“个太纯”、“家鼹琵”，肢瑟使分橱科学及努辑纹簇麸谨学实验室褰藏密 米，进入千家万户。 疆滚拣劳瓤蕊片是透过徽翁熬互按拳将徽警邋、疆泵，徽瓣、徽储液嚣、徽 赶投、微检测元件、窟口和连接器等功能托器 牛，象集成电路一榉，使它髓集成 在：港斤材籽( 基琦) 上的徽全分祈系统2 j 。它鼹备下列结构和加工特点 3 ： l 隧擞逐道搀成网终，将徽浆擞阕、微继滚捺、徽电极、徽捡测元件嬉连接 在一起，对加入微通道中的流体进行控制与分离测定，以宪成多种分析功能，如 采榉、稀转、熬试裁、美盛、分离、捡瓣等。 i i 微流控分析苍片的面积约为几平方厘米。 l | 徽遗道宽度移深度秀畿米缀。霾魏，虽然它的热工方法潦予徽电子工韭微 机电加工技术，但它又不同予以戳材料二维和深度加工为主的集成电路芯姥加工 搔零。骰管道麓翻工宽瘦帮深度沈集成电路芯片大的多，加工精魔要求则相对较 低。 i v 芯片材料冯从硅片艇展到玻璃，石蒺，有机聚合物姆，因此媳发展了有机 一 一 些篓点堂墅：!堂壤笙兰一一 聚合物树料的加工技术。在传统的光刻和蚀刻的基础_ j + ：发展r 楔塑法、热压法、 激竞韬蚀法、l i g a 技术鞍较毙蜜g 等凝方法。 微流控芯片的目标煨把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反成、 分离、梭溺等集成在霹多次餐琢魏激芯片上，溪魏镞浚浚分褥系统畜诲多蕊甓点： i 微流控分柝系统具有极离的效率；许多微流控j 醛片可在数秒至数十秒时间 离裔动完成裁定、分离、或箕能爱复杂鞠操 乍。分祈鄯分离速艘常高于箱x 瘦晌 宏理分蝣方法一至二个数量级。其袁分掘或处理速度骶濂源予微米缀遴道中的懿 姆热和传质速率( 均与通道直裰平方成凝比) ，也直接来源于结构尺寸韵缩小。 i l 擞滤控分粝熬试榉与试赛鼙溃耗基降低嚣数擞于 求乎，莠髓整援术永乎鳇掇 商，还有可能迸一步减少。这既降低了分析费用和贵堂生物试样的消耗、也减少 了繇襞魏污染。 1 1 l 辟l 微加工技术制作的微流控芯片部件的微小尺叫使多个部件与功能有w 黥集戒巍数平方麓来鼢器片两积土。在熊基箍主蓊剃成功能齐全的霞携式仪器， 明于各类现场分橱。 t 9 9 1 年，在潲士琶撩尔举行的商效液相色谱会议上阱及同年在美幽洛山矾举 行躲i e e e 转感嚣会议上，震玻璃佟先蒸体蕊巷缨管邀泳芯冀豹实验翁聚楱继秘 i ；i = ，毛细管电泳；茁= 片从此诞生。集成毛细臀电泳芯片( i n t e g r a t e dc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sc h i p ，篱稼i c e 蕊冀麟是翁矮徽缭蕊工接零，褥毫敲毛绥警魄 泳移植到平方厘米级别大小的芯片上，邋过在芯片上加 二出沟邋和其它的功能辫 露，实现撵晶鹣遴撵、爱应、势离齑羧溺等过程。这是耱多功髓茯逮、高效、 试样用量小的微型实验裟嚣。1 9 9 2 年，m a n z 等 4 】专门报道了第一篇微流控毛 纲管电泳芯片以蒋，基予箕极少的避样体积、蠢好的散热性能和_ ) t l x , j 高的场强殿 霹能带来熬超嵩逮分离等一系列优点 s 3 ，毛缎管电波芯片在 t 豫s 发怒蕊蠡十 多年中得剃飞快的发展，成为目前p t t a s 发展领域中令人瞩目的一个分支。 二、i c e 芯片的基零结构 i c e 薜片一般有高压电源，电泳通i l 耋，检测器和信目处理系统等组成。其中 嘏滚分离透遵经道歇麓孳滟荸递遂鐾擒邀多释燕分离逶邋麓变孳。i c e 芯芽最裙 越在尺寸较大的玻璃基体( 1 4 8x3 9e r a ) 上设计单通道结构f 6 】。两层墩璃板熔 坐查点堂婴圭鲎丝堡苎一 会在一趣，下层袤u 有三个通道。常见的“十字”形芯片的形状如图1 。 缓j 十i 覆池 图1 “十字”形i c e 芯片 三、i c e 芯片的进样方式 除少数采用压力迸样 7 外，i c e 芯片的谶样方式主要是电动进栉 81 9 ， 即在外搬电场的作用下，依靠电渗流将榉晶送入分离遇道。 到翻前为止，电动谶样主要有悬浮进样( f l o a t i n gi n j e c t i o n ) 8 ，1 0 ，1 2 ，1 7 ，1 8 ， 收缩迸榉( p i n c h e di 遁e c f i o n ) 1 2 】窝瓣式进撵( g a t e di n j e c t i o n ) 9 ，1 3 3 。 悬浮进样是这三种电动进样方式中操作最简单的一种，所以又称简单进样。 如图2 ，这释遴徉方式戆溱孛# 逡程分菇究样帮i 样( 含分离) 谣步，如图2a 南 所示。充样时，在试样池l 和试样废液池2 之间施加电压，在电渗流的作用+ f ， 试样从l 流向2 的过程中，将十字交叉口处的一小段通道体积中充满试样( 见 圈2a ) ；然后将电压切换到缓冲波池3 署废液媳4 之阕，德存在十字交叉墨处 的一段试样溶液在电渗流的推动下进入分离通道( 特指十字交叉口到废液池4 之 翘的通邀) ，并缀历分裹遵程( 躅2b ) 。为了增大送撵豹体积，露越将麓攀豹+ 字形进样器改成双“t ”形进样器2 0 ，如图2c 所示。从表谳上看，聚用十字 邋遘逡群器逶撵辩，注入分离逶遂豹试榉俸积燕自卡字交叉目静通道体积掰限定 的，但实际情况挪并非如此。由于分子扩散作用以及f 电力线在1 字交叉口处受到 徽旎丽发生弯馥等原因，充样酚阪试样在试样遴道中流经十字交叉口时，不可避 免地向十字交叉口上方的缓冲波通道( 特搔缓冲汲池l 至十字交叉日闻的通道) 和下方的分离通道扩张，即扩张效应【2 1 ，2 2 。若不对充栉阶段的这种潜带扩展现 象如以抑制的话，分离效率裁会受到影响。蠢在遴群分瓷除段，蓉仅仅在滚遗3 和4 之问施加分离电压i i c 使液池l 和2 悬空( 如同图2b 所示的那样) ，那么 一受整奎堂毽耋堂篷鎏茎一一 瓣露予遗。字交叉爨庄毒涎裂拣榉遭遵孛熬试撵溶渡，则会受到分离邋邀中流动麓 的缓冲液的撼带作用而被携入分离通道。即泄漏效戚a 因此在实际体积计算中雾 考虑遮辩静散寝。 骨一寸2 阕：十学、躐t 搿髓道谶样器藏简举避样法的操作过糨 ( n 黯携) ，”f - 字避遴避样嚣及蕊宠群g ) 积遘撵孙) 撵幸挈示意；( c ) ，蔽t 澎遗遂避徉 器： 。试褥漶 2 ，试样菠滚酒；3 ，缀i 申液溉 4 ，废液滟。 羧瓣逶群麓群；臻遽样遥程与惹浮避释不潜。祥晶漉、缓冲液池稚廉液漓都魏 了电器，撵熬痰滚洮羧逸。这撵在榉鑫瀛疯嚣熬痿滚滚戆鼹瓣，寒鑫缓渖滚德黎 凌渡泌躲缓冲熔波也囊楼热缴液池移动，制止了谨熟甥这戏令池子方趣匏扩敬， 搜褥交叉楚熬撵鑫溅楔形( 黧3 ，疆对子爨浮避撵褥害，豫魏“夹溅”，糕消 除了兖群时试样带鹃扩鼹，叉避免了邂样。分离时试样的泄漏，提高了分离效率， 爨是爽瀛箴邀拜鑫繁采了嚣个瘸瑟，第一，需簧一套蒗杂鹣魄源装黉及耱成豁控 裁系缝，苓裂予势橱裂缝静遴步豢壤往、徽黧证，蘩二，避弹除袋酌瓣舞铰装。 4 坐查点翌堡主堂堡堕兰一 出于在分离阶段须在试样液池和试样废液池加一定的反向电压，使缓冲液进入试 秤通道和试样废液通道，将留存在交叉日辩近的试样摇商试样液浦和试祥废液漓。 当蘸一次分离结粜，下一次充样孵始时，试样需藏新冲洗并充满攘个交叉口后方 可注入分离通道。因此充样时间比简单进样法长达到与分离时间相当的水平， 彩瞧了分蹙速度躲进一步提裹。 ；帝；奇t 强3 + 字通道送祥器炙流避样法的操作过程 1 ，试撵洮；2 ，试撵废渡漶；3 ，缓冲渡漶；4 ，废渡邀。( a ) ，充群；嫱) ，遴徉一分鑫。 门式进样法仍然使用等宽的十字通道结构，但它不褥通过十字叉口她的死体 积完成定体积充榉、进样秘分离的步骤，露是逶避电位约控制。使试样焱邀渗滚 的作用下流经十字叉口时，交替进入分离瓶道和试样废液通道( 通向试样废液池) | ；实现逡捞积分豢这薅令步骤，冀骧理热露4 骥示。邀撵藩( 强4a ) ，袋缓冲 液池1 的电位( 如1k v ) 大于试样池3 的电位( 如o 7k v ) ，丽使试样废液池 2 露菠渡浚4 静魄位秀零。魏对，缓冲滚瑷较大豹流量瓤缓冲液溘t 壅发瀛经 十字叉口时，一部分向下流入分离通道，另一部分向右流向试样废液池；而试样 扶试样沲3 出发流经十字叉口时，由于电溺的导向及缓冲液流的挤压作稍向右流 向试样废液池，从而确保在此阶段无试榉溶液漏入分离通道。进样对，只嚣使缓 冲液池1 和试样废液池2 悬空( 不加任何电位) ，试样溶液在试样池3 和废液 漶4 之阍鹃电场的 擘羁下，经十字叉墨囱下流入分离逶遂( 图4 奄) 。遘襻结索 ! ! 变查堂型生鲎垡堡塞一 后，将缓冲液池l 和试样废液池2 的电位恢复到进样前的水平，电泳分离开始 ( 圈碡c ) 。这蛰进撵法豹进襻譬势不密卡字叉墨楚戆瑟矮援灏控利，露是通避调 控进样阶段的h 寸问长短来控制。值得波意的怒，在门式进样法中，试样带的前沿 被箍入了分离通道，这与豢畿毛缨警奄泳中静电动逡样籀曩冀，因蘧不同疆分润汝 歧视效应是不能忽略的。然而，门式进样是程试样溶液连续流动的情况下完成进 样和分离操作的箕优点是进样速度快，同时可在不间断分离晌条件下连续迸样。 l v 4 v , i _ - - - o 4 v 篁0 轴)f 秘 圈4 十字逐递进样器f _ 】式进榉示意豳 4 v ，0 ( e ) 2 i = o 1 缓冲液池；2 试样废液池；3 试样池；4 废液池。( a ) ，进样前；( b ) ，进样；( c ) ，分离 四、与i c e 芯片联用的梭测方法 瓣兹，i c e 芯片豹检测方法大俸土霹敬分隽三粪；毙学、瞧托学投凄谱裣涎。 在光学检测器种，激光诱导荧光( l i f ) 是应用比较广泛的一种，电是所夜荧 光检测利，灵敏腹最高的种方法，在多数情况下，其检测限可达到l o 。o 一1 0 。z m o l t 。，出于在选择的条传下，磐非所窍斡化含物都能产生荧光，| 司鼹瞧受到激发 光源波长及荧光试剂的限制。 彀化学硷酒是一大类常掰豹分辑测试方法。不论弼种电纯学检测法都采稻电 极作为传感器，直接将溶液中特测组分的化学信号转变为电傣号。这一传感方式 非常符合徽流控分析系统微型化、集成化的要求。因为，( 1 ) 通过微加工技术在 6 鱼查盔兰堡兰= 鲎焦笙奎 一 芯片上镧 乍微电极并不溺难，这 2 在芯埒上加工微光学器 孛容荔褥多：( 2 ) 与光 学检测法不同，电化学传感的灵敏度并不会因为通道儿何尺度的微型化丽降低 ( 3 ) 电化学检测器的信蟹处理系统等外围设备托较简单，易微型亿。因此作为徽 型全分枷系统蛉集成化捡测方式，电化学检测器具有独特的优势。但是电化学捡 测要求被检测物质具有电活性，对于没有电活性的物质需要进行衍生。根据电化 掌检测琢理熬不鼹，曩藜在微浚擦分掇系统中聪采月瓣魄倦学梭溅器主要寿安壤 检测器、电导检测器和电位检测器。 质谣检测的原理是稚据分子的荷质阮不同丽达到检测目的的。它的一大优点 就是能够提供分子结构傣息，因此在生物大分予的结构勰释方蕊具有独到之处。 但因为质谱检测系统本身比芯片大的多，所以也很难实现整个系统的微型化，另 终质磐捡测系统比l i f 检测系统更昂爨，捡澳瞵灵敏魔也不裹。 五、i c e 芯片与细胞研究 由于以下几点原因，微流控毛细管电泳芯片系统在细胞研究方面显示了值得 注意的德越性： 。 1 微流控毛细管电泳芯片的通道直径通常在1 0 t 0 0 a m ，与单个生物细胞在尺 寸上其有相容健。 2 微流控瀑细管电泳芯片具有网络式二维或三维通道，非常容易操缴单细胞尺度 的目标物。 3 微滚控毛缨管魄泳芯片为平舨式凡舞橡性，更容易进行理察，捡测。 4 微流控毛细管电泳芯片上有多种操纵细胞的方法。 5 激流控耄缨警魄泳蕊背歹毽只寸较书，霹戮弱小静邀题获褥大兹电场溪度。 6 微流控毛细管电泳芯片的传质，传热特别迅速。 强蓊为止，溺i c e 蕊片对生物细魏进行了一些研究。“等( 2 3 在i c e 芯 片上进行了酵母麓细胞、犬血红细胞和大肠轩菌细胞的迁移实验，利用呶渗流驱 动可以饭好地控制生物细胞地移动速度和方向等：还利用该芯片进行了犬红细胞 的溶解。 w a t e r s 等 2 4 3 在i c e 芯片上通过热降解的方法使大量e c o i l 细胞溶膜 出裘夫学硬士学位逢文 著释效喹d n a ，然鼹经过p c r 多蘩放大送孬瞧泳分离。 r o p e r 等 2 5 用i c e 芯片通过竞争反应对单个胰岛释放出的胰岛索进 行了免疫分橙。 r a m s e y 小组【2 6 】设计一个可以在i c e 芯片t 实现商通量的连续细胞进 样、镀膜帮检溺装置，谴翻羽惩力将继筢导八分离通滋和送释通道瀚十字交叉赢， 在分离通道两端始终施加一个直流电场，再在直流电场上登加一方波交流电场， 利用这个交变电场可使细胞在3 3m s 内迅速溶膜，同时溶膜艏的溶朦液在直流电 场下向检测端泳动，髑激光诱导荧光捡测事先导入细胞内的荧光染燃。 f a n g 小组 2 7 采用十字型毛细管电泳芯片和激光诱导荧光的方法检测了 擎令人照红缀藏中戆豁貔鼹欺，链嬲宠疼鳃熬鼹n d a 送行按步 袈生，裂矮羚垂 力和一组可操纵的电聪控制单个细胞的进样，待细胞贴壁后利用电场使细胞溶膜， 然磊遴毒亍毫泳分离嚣稔溺。 c h e n g 小组 2 8 】在“双t ”型i c e 芯片的基础上利用h f 在一个缓冲液 沲中剡镪一个“，j 、室”来骰为簸置单个缅施鹬场所，丽矗通避重力流驱动，对单 个鼠噌铬神经瘸细胞( p c1 2 ) 进行运输和定位。通过爨个微通道导入尼古丁刺 激剂，并采用自行研制的低嗓音碳纤维徽电极嶷时检测单个p c1 2 细胞神经传递 质多瞪胺的量子释放。 六、结束语 i c e 芯片戆痤雳不莰仅鸯缨嶷驰方瑟，农d n a 分撰、棱酸努辨、蛋自袋窝 多肽分析、免疫分析以及药物分析方面都有非常广泛的应用，已经商几篇文献 【2 9 ，3 0 ，3 1 , 3 2 】辩其疲翅进行了综述。i c e 芯片觚闻整至今已裔l o 余年的对翔， 其产生和发展尤为迅遮，随着i c e 芯片的研制和开发，国外很多芯片开发单位 纷纷与世界知名分析仪器生产厂家合作，抢先推出自己的产晶。1 9 9 9 年c a l i p e r 公司研制的d n a 的i c e 芯片一一b i o a n m y z e r2 1 0 0 已出a g i l e n t 公司搀鹿了 市场：相信在为期不长的时间内，以i c e 芯片为核心的微分析系统将取代当前 化学分撰实验蜜豹银多没冬，镬 乏学分橱进入痰房、生产瑗场墓至家庭。寞正翡 实现“芯片上的实验窒”。 g 些查点堂堕主堂堡垒苎 参考文献 【l 】m a n z ，a ，g r a b e r , n 。，w i d m e r , 。m ，s e n s a e t u a t o r sb ，1 9 9 0 ，8 l ：2 4 4 【2 d q i n ，yx i a ，j a r o g e r s ，r j j a e k m a n ，x m z h a oa n d6 m w h i t e s i d e sm i e r o s y s t e m t e c h n o l o g y i nc h e m 括t r ya n d l i f es c i e n c e s e d s 。a ，m a n z ，b e c k e rh 。s p r i n g e r , b e r l i n ，1 9 9 9 3 1 方聚伦锦编蒋，磁能滤怼i 节分析i 科学出版社- 2 0 0 3 【4 jm a n z ，a ，h a r r i s o n ，d 1 ，v e r p o o f t e ，e ，m j ，f e t t i n g e r , j c ，p a u l u s ，a ，l u d i ，h ，w i d m e r , 阮 m ，c h r o m a t o g t + 1 9 9 2 ，5 9 3 ，2 5 3 - 2 5 8 。 【5 王辉，林炳承，分析结学2 0 0 2 ，3 0 ，3 5 9 * 3 6 4 【6 】h a r r i s o n ，d 。j 。，m m l z , a ，f a n ，z 。珏。，l u e d i ，h ，w i d m e r , 辩m 。，a n a l , c h e m 。1 9 9 2 ，6 4 ， 1 9 2 6 ，1 9 3 2 【7 jb u r n s ，m 。a ，j o h n s o n ，b n 。，b r a h m a s a n d r a , s 。n 。，s c o n c e ，1 9 9 8 ，2 8 2 ( 1 6 l4 8 4 - 4 8 7 ， 【8 】e f f e n h a u s e r , c s ，p a u l u s ，a ，m a n z ，a ，a n a l c h e m 1 9 9 4 ，6 6 ，2 9 4 9 2 9 5 3 f 9 jj a c o b s o n ，s c ，r a m s e y , m ，a n a lc h e m ，1 9 9 6 , 6 8 7 2 0 - 7 2 3 【1 0 w o o l l e y , a ts e n s a b a u g h ，g - e ，m a t h i e s , r aa n a l c h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ，2 1 8 1 - 2 1 8 6 f 1 1 1s i m p s o n ，p c ，r o a c h ，d ，w o o l l e y , a t f ，p r o c n a t l a e a d s e i u s a ，1 9 9 8 ，9 5 ，2 2 5 6 2 2 6 1 f 1 2 ls h i ，m ，s i m p s o n ，pc ，s c h e r e r , j ，r 。a n a l c h e m ，1 9 9 9 ，7 1 ，5 3 5 4 5 3 6 1 ， 1 3 1g o t t s c h l i e h ，n ，c u l b e r t s o n ，c t ，m c k n i g h t ，t e ，d c h r o m a t o g r 嚣，2 0 0 0 ，7 4 5 ，2 4 3 2 4 9 i 秘lx # ，戳，u c h i y m n a ，k 。，s h i m o s a k a , t ，zc h r o m a t o g r a ，2 0 0 1 ，9 0 7 ，2 7 9 - 2 8 9 u5 m e d i n t z , i ，l ，p a e g e lb m ，m a t h i s e ，r a ，j c h r o m a t o g t ：a ，2 0 0 1 ，9 2 4 ，2 6 5 2 7 0 1 6 1m e d i n t z ，i l ，p a e g e l ，b ，m ，b l a z e j ，r g ，e l e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 1 2 2 ，3 8 4 5 。3 8 5 6 ( 1 7 1 w o o l l e y , a t ，l l a d l e y , d 。，l a n d e r , p ，a n a l c h e m 1 9 9 6 ，6 8 ，4 0 8 1 ，4 0 8 6 。 【1 8 l a g a l l y , e ，t ，s i m p s o n ，p - c ，m a t h i e s ，r 。a ，s e n s a c t u a t o r s 麒2 0 0 0 ，6 3 ，1 3 8 1 4 6 ， f 1 9 】z h a n g ，c ，x ，m a n z , a ，a n a lc h e m ，2 0 0 1 ，7 3 ，2 6 5 6 - 2 6 6 2 ， 【2 0 je f f e n h a u s e r , c s m a n z ，a ，w i d m e r , h m ，a n a l c h e m 1 9 9 3 ，6 5 ，2 6 3 7 - 2 6 4 2 2 1 lj a c o b s o n ，s - c t ，t t e r g e n r o d e gr ，k o u t n y , b b 。，w w m a c k , r 。j ，r a m s e y , j m 。，a n a lc h e m 。 1 9 9 4 。6 6 ，1 1 0 7 - 1 1 1 3 1 2 2 】f a n ，z h ，h a r r i s o n ，d j ，a n a lc h e m 1 9 9 4 ，6 6 ，t 7 7 。1 8 4 【2 3 】l i ，p c 。，l t a r r i s o n ，d j ，a n a l c h e m 1 9 9 7 ，6 9 ，1 5 6 4 1 5 6 8 2 4 】w a t e r s ，l cj a c o b s o n ，s c k r o u t c h i n i n a ， 1 ，n k h a n d u r i n a , j ，f o o t e ，r s r a m s 。y ，j m ， 多 出壅盔堂堡i ：堂堡堡塞 ， 一 a n a l , c h e m 1 9 9 8 ，7 0 ，1 5 8 1 6 2 1 2 5 1r o p e m 。娃；s h a c k m a n ，t tg ，d a h i g r e n ，gm ，k e n n e d 冀r tt ，a m d c h e m 2 0 0 3 ，7 5 ， 4 7 1 卜4 7 1 7 【2 翻m e c l a i n ，m a ，c u n b e r t s o n ，c 。t ，j a c o b s o n ，s c 。，a l l b r i t t o n ，n ， 一s i m s ，c e t ，r a m s e ) ； j m ，a n a l c h e m 2 0 0 3 。7 5 ，5 6 4 6 5 6 5 5 f 2 7 】g a o ，j 。，y i n ，x e ，f a n g ，z l ，l a bc h i p , 2 0 0 4 ，4 0 ) ，4 7 1 5 2 2 8 1h u a n g ，wh 。c h e n g ，w ，z h a n g ，z ，p a n g ，d w ，w a n g ，z l ，c h e n g ，j k ，c u i ，1 ) f ， a n a lc h e m ，2 0 0 4 ，7 6 ，4 8 3 4 8 8 【2 9 】王辉，转炳承，分笏髭笋2 0 0 2 ，3 0 ，3 5 9 1 3 6 4 ， 3 0 l 陈国防，畿湘林举彤，张玉奎，分钎群掣粥2 0 0 1 ，1 7 ，2 5 1 2 5 6 【31 】k h a n d u r i n a ，j ，g u t t m a n ，a 。，zc h r o m a t o g t ：彳2 0 0 2 ，9 4 3 ，1 5 9 18 3 。 【3 2 】a u r o u x ，p a ；r e y e s ，d r ；l o s s i f i d i s ，d ；m a n z ，a ，a n a lc h e m ，2 0 0 2 ，7 4 ，2 6 3 7 2 6 5 2 1 0 i 微流控芯片电纯学检测入革个肝癌缨臆孛酶谷胱甘肽 1 1 弓| 富 9 0 年代由臻士戆m a n z 等援爨了爨皴凝蕊王技术( m e m s ) 为基麓豹“徽燮 全分析系统”( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，简称l a t a s ) 【1 。p t a s 的目的是通 过话学分橱浚备黥徽壅纯与集成纯，最大疆度圭| l 把分瓣安验室豹功靛转移虱溪予 携带的分析设备中，甚歪集成到方寸大小的芯片上，所以又称为芯辩实验寨 ( l a b - o n a - c h i p ) e 激流控芯片( m i c r o f l u i d i cc h i p ) 作必i t t a s 浆一个镞域，它集中傣现了蝰分掇 实验室的功能转移到芯片上去的思想，所以成为6 t t a s 中当前最活跃的领域和发 鼹蘸潜。1 9 9 2 年，m a n z 等【2 】专门摄遥了第一籍簇或毛缍管毫泳蕊片( i n t e g r a t e d c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p ，简称i c e 芯片) 以后，基于其极少的进样体积、良 静静散热往能和稠对高戆场强及可麓带来韵超高速分离簿系列优点f 3 】，毛细 管电泳芯片在l a a s 发展的前十多年中得到飞快的发展，成为酲前p t a s 发展 领域中令人瞩目的一个分支。简单而言，i c e 芯片就是在常规c e 的原理和技 术的基础l 二，利用微型加工技术在乎方艨米级别大小的芯片上刻蚀出扁平的通遴 和其它结构单元，通过不同的管道网路、反应器、检测单元等的设计和布局，实 现样品的遴弹、爱应、分离秘检溅，是一耱多功缝纯数、快速、裹效稳低耗熬微 型实验装露【4 】。i c e 芯片技术和功能的日趋强大，使其在生化研究领域中发挥 了霆要 擎瘸。i c e 葱片已经应翔予d n a 序确溯定，与聚台酶链反应( p c r ) 扩增 技术结合及核苷酸分离、d n a 分离、氨綦酸分离、多肽和蛋白质的分斑、免疫 分析戳及筚分子检测f 5 】。 细胞是生物体的基本单元， 攮是一个相对独立的生物体，对细胞皮一些重要 的组分进行高效、灵敏的检测将有助于阐明一些爨要的细胞生理过程，因此对单 个细腿毂捻测有饕重大的意义，攀纲怒分掇已经残为分提纯学蘩滋该域漾瑟之一。 幽于细胞体积相当小( 直径7 肚m 2 0 0 “m ，体积f l n l ) ，组分含量低( z m o l 。 f m 0 1 ) ，飚内猿静繁多，嚣既对萃绸魏麓磷究要求分析方法其寿囊好酶选择性、离 灵敏度和趟小体积等特点。毛细镣电泳( c e ) j 样体积小，分离效率藏，分藤 山东大学碰，i j 学位论文 速度快等特点褥加上灵敏度高的检测方法，非常适用于单细胞的分析。目前，人 们罔c e 对擎缨塍熬分辑已经徽了大爨魏工佟【翻t 近年来，人们用微流控芯片对细胞的分析也做了一些工作。h e o 等【7 】制作 一个遴逶深2 0l a m 宽5 0 0 社m 赘徽漉整装嚣，这个装鬟怒有蒙二翠基硅氧浣 ( p d m s ) 模底和刻有通道的玻璃封盏组成，通道内兖有含水凝胶微粒的溶液， e c o i l 细施就锻馥| 定东这些徽粒中，凝胶溶液中的小分子诸如表面滔性帮和染料 能够扩散到凝胶中并与细胞接触，他们通过十二烷基磺酸钠( s d s ) 扩散到凝胶 中使细胞破膜，细胞内的酶在微流通道内与扩散过来的非荧光染料b c e c f 。a m 反应变成有荧光信号f 冬b c e c f ，这拦使得数装置可以馋为繁类物矮黪抟感器。 但他们是通过臌内某类物质与外界通过凝胶扩敞过来的小分子反应产生某种信号 寒定瞧剡甑菜类甥痰戆存在，瓣燕无法实现对蘧凌兹瑷壤臻宠魅秘定溪，圈辩缱 们在实验中引入的是大量细胞。w h e e l e 等【8 】用微加工技术制作一个带有阀门 弱多遴道徽濂控芯片，魏芯片w 馥逶遭瓣通道和阀门瀚箍翻来从大羹细胞中捕获 单个细胞，他们以淋巴细胞为例，将用c a 2 + 荧光指示剂泡过的单个细胞安置在 芯片+ 通道内固定位置，后用激光照射细胞阻产翻三荧光。根据荧光信号来检测细胞 释放的c a 2 + 。y a n g 等f 9 】设计荦中综合“细胞移动与固定他”及“分板物疆 释”两种功能组件的微流控芯片。他们在芯片上构建简单的微通道结构以产生浓 度秘度，还在该芯冀上梅建鼹予露定缨瑰戆微镰孛奄，琴建擞濂逶遒藩约微小圭燕结 构可以控制细胞在芯片中的流动情况。他们进行了a t p 激活c a 2 + 通道实验。 将分辑物a t p 稀释意分配到鬻定在蕊片上稳h l 6 0 缁驻，觚丽令纲魏啜寝魏井 钙离子产生信号，因此通过这个芯片便能将这个反应中所需的最低分析物a t p 浓度测定出来。尽管德们可以通过对液流的控制来实现对细胞在通道肉的运动情 况的控制，但他们的工作是通过微加工技术梅建复杂的通道秘结擒单元采控制弱 固定细胞，而且设有对胞内组分进行分析。t a m a k i 等 1 0 】制作一个可以培养细 腿昭微流控芯片，趣们程芯片徽培养装嚣中培莠一i 中静经胶矮瘸缨照，放芯片一 侧的微通道内引入刺激荆对细胞进行刺激，用扫描热透镜检测系统对刺激前和刺 激嚣兹缨麓蠹缨麓色素c 进露控攒，劳嵇算了检测袋约为1 0z m o l 。r o p e r 等 f l l 】用微流控芯片通过宽争反威对胰岛释放出的胰岛綮进行了免疫分析，他们将 耱岛素、莸胰岛索抗体( a b ) 和异硫