（环境科学专业论文）微生物—纳米铁复合材料的制备及其用于地下水体污染修复的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t t h eh y d r o g e np r o d u c e db yt h ec o r r o s i o no fn a n os c a l ez e r o v a l e n ti r o n ( n z v i ) c a nb eu s e da se l e c t r o nd o n o rf o ra u t o t r o p ht od e g r a d ep o l l u t a n ti nw a t e re n v i r o n m e n t ， w h i l eh y d r o g e nw o n ts t i m u l a t em i c r o o r g a n i s mr e p r o d u c e dt h e m s e l v e se x c e s s i v e l y , s ot h i sm e t h o di sv e r ys u i t a b l ef o rt h ei n s i t um i c r o o r g a n i s mr e m e d i a t i o no fg r o u n d w a t e rc o n t a m i n t i o n t h ep u r p o s eo ft h i sa r t i c l ew a st oe x p l o r et h ep r a c t i c a lm e a r l sf o r i n - s i t ur e m e d i a t i o no fg r o u n dw a t e rc o n t a m i n a t i o nb yt h eu n i o nb e t w e e nn z v ia n d m i c r o o r g a n i s m ，a n dt h i sa r t i c l es t u d i e dt h ep r e p a r a t i o no fm i c r o o r g a n i s m n z v i c o m p o s i t ea st h em a i nc o n t e n t i nt h i se x p e r i m e n t ，t w ow a y sf o rp r e p a r a t i o no ft h e m i c r o o r g a n i s m - n z v i c o m p o s i t e w e r e s t u d i e d ， i n c l u d i n g b i o f i l m m i c r o o r g a n i s m - n z v ic o m p o s i t ea n dm i c r o o r g a n i s m n z v ic o m p o s i t eb a s e do n t r a d i t i o n a lc u l t u r ec o l l e c t i o ni nd e s s i c a t i o n i nt h i s e x p e r i m e n t ，t h er e m e d i a t i o np r o p e r t yo fn i t r a t ea n dp e r c h l o r a t e c o n t a m i n a t i o ni ng r o u n dw a t e rb yt h et w od i f f e r e n tc o m p o s i t ew e r es t u d i e d t h e r e s u l ts h o w e dt h a t ，n 0 3 - no f5 0 m g lc a nb er e m o v e dc o m p l e t e l yf r o mt h es y s t e m b yt h eb i o f i l mm i c r o o r g a n i s m - n z v ic o m p o s i t ep r e p a r e dw i t hg l u c o s ep r o v i d i n g n u t r i t i o nw i t h i n5d a y s ，7 2 o ft h ed e n i t r i f y i n gp r o d u c tw a s g a s e o u ss t a t en i nt h e c i r c u m s t a n c eo fa d d i n gn z v ia n dm i c r o o r g a n i s ms e p a r a t e l y ，n 0 3 - ni nt h es y s t e m c a nb er e m o v e dc o m p l e t e l yw i t h i n10d a y s ，a n dt h e r ew e r eo n l y6 3 o f d e n i t r i y i n g p r o d u c tw a sg a s e o u ss t a t en b yc o m p a r i s o n ，t h ec o m p o s i t ei sm o r ea c t i v ei nt h e d e n i t r i f l c a t i o no fg r o u n dw a t e r p e r c h l o r a t eo f5 0 m gp e rl i t e rc a nb ed e g r a d e dt ot h e e x t e n tt h a tb e n e a t ht h ed e t e c t i o nl i m i tb ym i c r o o r g a n i s m n z v ic o m p o s i t eb a s e do n t r a d i t i o n a lc u l t u r ec o l l e c t i o ni nd e s s i c a t i o nw i t h i n18d a y s ，a n da d d i n gt r e h a l o s ec a n i m p r o v et h ed e g r a d a t i o np r o p e r t yo ft h ec o m p o s i t e ，p e r f o r m e dt h a tt h eb i o l o g i c r e a c t i o nk i n e t i ci n f l e c t i o na p p e a rf r o m12d a y sw i t hn o ta d d i n gt r e h a l o s et o9d a y s w i t ha d d i n gt r e h a l o s e i na d d i t i o n ，c o m p a r et h ed e g r a d a t i o nr e a c t i o no fp e r c h l o r a t e b yt h ec o m p o s i t eb e i n ga c t i v a t e da n dp r e s e r v i n g3 0d a y so r7d a y s ，a n dn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ew a sf o u n dw h i c hm e a n sb o t ho ft h ec o m p o s i t e sc a nr e m o v e dc 1 0 4 一o f 5 0 m g lt ot h ee x t e n tt h a tb e n e a t ht h ed e t e c t i o nl i m i tw i t h i n18d a y s t h i ss u g g e s t t h e c o m p o s i t ec a n b ep r e s e r v e df o ral o n gt e r mw i t h o u tl o s s i n gb i o l o g i ca c t i v i t y , a n di t i s v e r yi m p o r t a n t f o rt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n a n d p r a c t i c a la p p l i c a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m - n z v ic o m p o s i t e t h i sa n i c l eu s eb i o f i l mt op r e p a r et h em i c r o o r g a n i s m n z v ic o m p o s i t ei n i t i a l l y t h ea u t h o rs u b m i t t e da ni d e at h a td e v e l o p p i n gd r y - s t y l eo fm i c r o o r g a n i s m 。n z v i c o m p o s i t e a n d e x p l o r e am e t h o d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f d r y - s t y l e m i c r o o r g a n i s m n z v ic o m p o s i t et h a t w i t ha g a ra sc o a t i n gm a t e r i a lf o rn z v ia n d c a r d e rf o rm i c r o o r g a n i s m k e yw o r d s ：n z v i ；m i c r o o r g a n i s m ；c o m p o s i t e ；p e r c h l o r a t e ；n i t r a t e ；g r o u n d w a t e r ；c o n t a m i n a t i o nr e m e d i a t i o n 第一章绪论 第一章绪论 第一节地下水中硝酸盐氮和高氯酸盐污染现状及危害 1 1 1 地下水中硝酸盐氮污染现状及危害 通常来说，地下水中硝酸盐氮的来源可以分为天然的与人为的两类。氮气 作为大气中含量最丰富的气体，很容易通过光化学反应、雷电、生物化学等途 径转化为n 2 0 ，n o ，n 0 2 ，n h 3 等化合物，这些气态化合物可以溶解进雨水并产生 硝酸盐和铵根离子等，随降雨过程迁移到地表，其中一部分会通过渗透作用进 入地下水，这一过程构成了地下水中硝酸盐天然来源的主要部分。虽然天然来 源在地下水硝酸盐中占有重要位置，但是人为来源才是经常导致地下水中硝酸 盐含量达到危险水平的原因【1 5 1 。目前，农业活动是造成地下水硝酸盐污染的重 要因素，这是由于农业生产中广泛使用富含氮元素的化肥，如尿素、氯化铵、 硝酸铵等，通过土壤微生物的作用，这些富含氮素的化肥容易转化成硝酸盐。 同时，这些施用的化肥中的一部分会随降雨渗透到地下水中，很容易引起局部 地下水中的硝酸盐浓度超标【】。有研究显示，在周围土地有超过2 5 被用于种 植玉米和大豆的地下水井中，发现地下水体中硝酸盐的含量经常超过标准值达 3 0 。同时发现，在经常灌溉的农田附近的地下水中，硝酸盐的含量也远超过没 有灌溉的农田地下水。另外，农田表层土壤至地下含水层这部分的地质结构也 对经农田土壤迁移至地下水中的硝酸盐量产生显著影响，当这部分地质结构主 要为沙砾构造时将会显著促进硝酸盐向地下水中的迁移过程，这同沙砾对硝酸 盐的吸附作用比较弱有关。当前，中国在农业生产中每公顷的氮肥使用量按氮 元素计算已超过2 0 0 k g ，关于氮肥引起污染的报道越来越多【l 叫引。 对饮用水中硝酸盐污染的担心，是由于已有研究表明过量摄入硝酸盐可能 会影响婴儿血液中氧的浓度并诱致高铁血红蛋白症或蓝婴综合征( b l u e - b a b y s y n d r o m e ) 。自从1 9 4 5 年以来，在欧洲和北美地区已有超过2 0 0 0 例婴儿高铁血 红蛋白症的报道，其中有大约7 一8 的病例最终导致了婴儿死亡。同时，过量 摄入硝酸盐也会对人体健康带来潜在风险，导致胃癌、肠癌发病率的上升，这 是因为摄入人体中的硝酸盐可能会在人体内的还原性环境中转化成亚硝酸盐， 第一章绪论 而亚硝酸盐是一种致癌物质 1 5 - 1 8 】。除了对人体健康的影响外，硝酸盐污染也经 常会引起水体自然环境的恶化，因为硝酸盐是引起水体富营养化的主要污染物 之一，可以促进水体中藻类的大量繁殖，影响了自然景观的美观及水质 1 9 - 2 1 l 。 目前，许多国家对饮用水中硝酸盐含量有明确的限制性要求，硝酸盐是美 国环境保护局饮用水常规检测项目中的一个，1 9 8 7 年规定饮用水中硝酸盐( 以氮 计) 的最高含量不能超过1 0m g l ( p p m ) 。英国在自己的饮用水指南中所确定的 硝酸盐( 以氮计) 最高容许浓度是1 1 。3m g l 。中华人民共和国国家标准生活饮用水 卫生标准( g b 5 7 4 9 8 5 ) 中规定，我国居民生活饮用水中硝酸盐( 以氮计) 的含量 不得超过2 0m g l 比啪j 。 1 1 2 地下水中高氯酸盐污染现状及危害 高氯酸根是一种由1 个氯原子为中心，被4 个氧原子包围并带有1 个负电 荷的阴离子。高氯酸根具有高度的对称性，这样的原子结构使其具有高度稳定 的化学性质。高氯酸盐固体的化学反应活性较高，常被用来作为火箭助推器里 的氧化物质。但是，高氯酸盐溶液非常稳定，难以被有机物所吸附，同时，在 中性p h 下同大多数金属的反应活性都很低。因此，地下水环境中的高氯酸盐具 有极高的化学稳定性。除了作为火箭助推器燃料的第一大用途外，高氯酸盐还 被用于炸药、烟火、道路闪光板、电镀、橡胶制造、润滑油、颜料及汽车安全 气囊系统等多种产品中【2 7 1 。 高氯酸盐既有自然来源也有人为来源，其中，自然来源主要产生自闪电过 程，人为来源则主要来自对高氯酸盐的使用及不当处置。另外，尤其引人瞩目 的是当前在饮用水中大量使用次氯酸盐作为杀菌剂，而次氯酸盐在环境中有被 氧化为高氯酸盐的潜在风险，因此此举有可能造成高氯酸盐污染的广泛传播。 自从1 9 9 7 年对高氯酸根的检测限达到4 l ag l 以来，高氯酸盐在环境中的分布及 其对环境的污染行为越来越受到重视。已有多起在饮用水中检测到高氯酸盐的 报道，如2 0 0 2 年美国对4 4 个有高氯酸盐应用工业的州进行了饮用水质调查， 结果检测到有2 2 个州的饮用水中含有高氯酸盐，占到了被调查州的半数。至2 0 0 5 年，在美国有超过一千一百万人1 5 1 生活在高氯酸盐含量超过4u l 的公共供水 系统中2 8 3 0 1 。 高氯酸盐对人体健康的危害主要表现在它一旦进入人体血液循环中，就可 2 第一章绪论 以通过竞争作用减少甲状腺对碘化物的吸收，进而影响甲状腺的正常生理功能， 如使甲状腺荷尔蒙的分泌不正常，导致身体发育减缓、神经系统发育不健全及 新陈代谢问题等。2 0 0 5 年，美国环境保护局( e p a ) 对高氯酸盐污染的毒性进 行了评估，并制订了人体0 0 0 0 0 7m g d k g 的接触标准，根据这一标准换算出来 的饮用水中高氯酸根的最高容许含量为大约2 4 5 1 2g l ( 3 1 3 3 】。 第二节硝酸盐氮和高氯酸盐的修复技术 1 2 1 硝酸盐氮污染的修复技术 1 2 1 1 硝酸盐氮污染的非生物修复技术 在硝酸盐氮污染的非生物修复技术中，离子交换技术是一种应用较早的处 理水体中硝酸盐的方式。采用离子交换技术去除水体中的硝酸盐，首先需要选 用合适的阴离子交换树脂。有报道认为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂7 1 7 和 螯合树脂d 4 0 7 对n o r 具有较好的吸附解吸性能，是理想的离子交换树脂材料， 但目前的树脂材料对硝酸盐都没有完全的选择性，在去除水体中硝酸盐的同时 也会去除掉水体中其他种类的阴离子，这将会造成离子交换树脂的浪费。在目 前的实际应用中，当离子交换树脂因交换离子量达到饱和而不能再继续使用时， 需要对树脂进行再生处理，而再生处理会产生富含高浓度硝酸盐的再生废液， 再生废液的排放不当将会造成水体的二次污染。由于离子交换技术对硝酸盐污 染的修复并不是对硝酸盐的彻底除去，只是对污染物的转移和浓缩，再加上离 子交换树脂高昂的后期处理成本，当前这一技术的使用正受到多重限制。同离 子交换法类似，膜分离法也是一种只对水体中的硝酸盐污染进行转移而不能将 其彻底降解的技术。这项技术主要包括电渗析法和反向渗透法两种，其中，电 渗析法采用一个直流电场为水体中硝酸盐离子的迁移提供动力，使其透过膜孔 离开水体；反向渗透法采用外加压力迫使待修复水体透过一个半透膜，从而将 水体中的硝酸根离子去除。这两种技术都存在着处理成本高昂且后续处理繁琐、 成本高的问题，因此目前只适用于小型处理设备，尚未大规模推广p 引。 化学还原法可以将硝酸盐氮还原为n h 3 、n h 4 + 、n 2 等还原态产物，是目前 3 第一章绪论 研究较多的一种处理硝酸盐污染的方法。这种方法的重点是还原剂的选择和催 化条件的选择，目前常用的还原剂有零价铁、零价铝、氢气等，但在应用非金 属还原剂处理硝酸盐污染时通常需要添加催化剂。早在1 9 6 4 年就有使用零价铁 粉处理水体中硝酸盐污染的报道，而使用这一方法处理硝酸盐污染在近年来受 到了更多的重视，研究成果也很多。已有的报道显示，采用普通零价铁粉( 2 0 0 目) 处理硝酸盐的效率同反应体系的p h 值有显著的关系，p h 值越低则反应速 率越快，而在p h 值高于4 的情况下，反应体系中的硝酸盐几乎不能被铁粉还原。 零价铁粉与硝酸盐的反应产物主要是氨氮。另外，使用零价铝粉用于硝酸盐污 染修复也受到水体中p h 值的强烈影响，并且会受到水体中硫酸盐的干扰。有报 道显示，在p h 值小于8 的体系中，零价铝粉不能还原硝酸盐，而在p h 值大于1 1 5 的体系中，硝酸盐和硫酸盐会同时被零价铝粉还原。研究发现，反应体系最佳 的p h 值范围是9 1 0 5 ，在这一p h 值体系中，硝酸盐会被零价铝粉优先还原， 而还原产物同样以氨氮为主，大约占到反应产物的6 0 9 5 。使用纳米零价铁 修复水体中的硝酸盐污染可以减小p h 值对反应的限制，研究发现纳米零价铁在 不调节p h 值的情况下即可将反应体系中的硝酸盐氮完全去除，而且相比于普通 零价铁粉其反应速率更快，反应产物主要为氨氮。 除金属材料外，目前有研究的用于硝酸盐还原的还原剂还有氢气等。有研 究显示，以负载型的金属p d 为氢活化催化剂还原水体中的硝酸盐，可以将硝酸 盐完全去除，同时发现，反应体系的p h 值对催化剂的活性和产物选择性都有影 响。相关的反应机理研究发现，氢气还原硝酸盐时首先将其还原为亚硝酸盐， 然后再将其还原为氮气或者氨氮，目前这一方法的产物选择性是研究的重点 【3 叫3 1 1 2 1 2 硝酸盐氮污染的生物修复技术 在自然环境中，能够以硝酸盐为电子受体进行无氧呼吸作用的微生物种类 很多，在细菌、真菌、古生菌中均有分布，并广泛存在于水体、土壤等多种介 质中。几乎所有的生物反硝化过程都需要在低氧或无氧环境中进行，通常认为 这一过程是微生物以硝酸盐为氧分子的替代物用作电子受体。在微生物体内， 硝酸盐经过一系列相关的酶催化还原，逐步转化为n 2 。和有氧呼吸作用相同， 微生物的硝酸盐呼吸反应链也是分布在细胞周质空间及细胞质膜上的，通过硝 4 第一章绪论 酸盐呼吸链上的电子传递过程，微生物在细胞膜内外形成质子浓度的梯度变化， 从而获得合成a t p 所需的质子动力。 根据还原硝酸盐所需的电子供体的不同，可以将微生物的反硝化活动分为 异养反硝化过程和自养反硝化过程。微生物在异养反硝化过程利用有机物作为 碳源与提供电子的能源物质，已有的异养反硝化工艺使用过的有机碳源包括甲 醇、乙醇、葡萄糖、乙酸等传统有机碳源。近年来，以锯末、纸张、秸秆为代 表的新型固体有机碳源成了生物异养反硝化研究的热点，这些新型固体有机碳 源在实际应用中更易于控制，克服了传统有机碳源容易引起微生物过量繁殖且 影响出水水质的问题。同时，这些新型固体有机碳源大都是生产生活中的副产 品或废弃物，不但成本低，而且有利于资源的再利用。进一步的研究发现，使 用不同种类的固体有机碳源会对微生物的反硝化速率及反硝化产物产生影响。 以常见的几种固体有机碳源为例，使用纸张为有机碳源可以让废水处理系统在 长时间运行的情况下保持较高的处理效率，而使用秸秆为有机碳源则只能在初 期表现出较高的处理效率，但出水水质的长期稳定性较差。 自养反硝化过程是指微生物利用碳酸盐等无机物作为碳源，并以h 2 、s 等 无机物为电子供体还原降解硝酸盐的过程。自然环境中的自养反硝化微生物分 布广泛，容易获得。在无机电子供体的选择上，氢气是研究最多的一种电子供 体。使用氢气为自养反硝化过程提供电子供体相比于使用有机碳源作为电子供 体，虽然降解速率较低，但可以产生更少的有毒发酵产物，并且不会刺激水体 中微生物的过量繁殖，因此该处理工艺更加清洁。使用氢气为电子供体进行的 生物反硝化产物几乎全部为气态，不会在水体中产生亚硝酸盐的积累，是一种 良好的反硝化技术。但是氢气在水体中的溶解度非常低，在处理过程中因氢气 的浪费而产生的额外处理成本较高。 生物法可以用于地下水的原位修复，零价铁在地下水中腐蚀产氢为微生物 的反硝化活动提供电子已有许多报道【5 】。普通铁粉曾被用于为地下水中微生物提 供电子，但是普通铁粉的还原活性太低，用于地下水中硝酸盐的生物处理时需 要很大的投加量，限制了其应用。纳米铁具有比普通铁粉大得多的比表面积， 因此具有更强的反应活性。利用纳米铁在地下水中的腐蚀产氢为微生物的反硝 化活动提供电子的研究已取得了一些成果【4 圳。 1 2 2 高氯酸盐的修复技术 5 第一章绪论 1 2 2 1 非生物修复技术 目前，在利用阴离子交换树脂对受高氯酸盐污染的水体进行处理方面已取 得了一些成功。但离子交换树脂法处理高氯酸盐污染也面临着许多难题，其中， 一个突出的困难是使用阴离子交换树脂吸附高氯酸根的过程中会同时引起水体 中其他种类的阴离子通过离子交换被离子交换树脂吸附。这一情况的发生会引 起离子交换树脂的浪费，特别是考虑到要将水体中的高氯酸盐浓度降低到环境 能容许的极低水平时，离子交换树脂的浪费量将是十分巨大的，使得这一技术 面临经济成本等方面的严重制约【5 。 除离子交换树脂技术外，反向渗透法( r o ) 和化学沉淀法也被应用于去除 水体中高氯酸盐的研究。在一些情况下，反向渗透法对水体中高氯酸盐的处理 具有很高的效率，然而，这一新兴技术在实际应用中也面临着成本过高的障碍。 利用化学沉淀法除去水体中的高氯酸盐要使用到一些人工合成的有机阳离子 盐，例如尼特隆( c 2 0 h 1 6 n 4 ) 、四苯基氯化砷等。这些有机阳离子盐类不但合成 成本高昂，而且具有相当的毒性，因此化学沉淀法在目前还不适用于水体中高 氯酸盐污染修复的实际应用。 从热动力学方面来看，高氯酸根具有得电子的强烈趋势，是强氧化剂，氧 化还原电位为+ 1 2 8 7 v 。但是受到高度对称的分子结构的影响，还原高氯酸根需 要相当大的活化能，在不使用催化剂的非生物化学反应中，当溶液中的氧化还 原电位低至一2 0 0 m v 时仍然不能引起高氯酸盐的还原反应。所以，当前对高氯酸 根的化学还原法去除都需要向反应体系中添加催化剂。已有使用氢气作为还原 剂，金属钯作为氢活化催化剂去除水体中高氯酸根的报道，也有使用零价铁作 为还原剂，并以紫外线做光催化还原高氯酸根的报道。这些非生物化学反应通 常需要在较低的p h 值环境中才会较显著的降解效果，而在地下水中维持较低的 p h 值是不现实的，这就限制了非生物化学反应在地下水高氯酸盐污染原位修复 中的应用【5 1 1 。 1 2 2 2 生物修复技术 应用生物法降解水体中的高氯酸盐的研究已有较长的历史，早在1 9 6 5 年， 利用微生物降解水体中高氯酸盐的报道就已出现。微生物降解高氯酸盐是依据 微生物自身的新陈代谢反应，在自然界中，已有超过5 0 种可以在厌氧环境中还 6 第一章绪论 原高氯酸盐的微生物获得了纯化培养，这些被分离纯化的微生物广泛地分布在 土壤、河流沉积物、地表水、地下水等环境中，并表现出多样的新陈代谢性质。 微生物可以将高氯酸盐作为自身电子传递链条的末端电子受体，微生物在获得 电子传递过程中产生的能量用于a t p 的合成的同时，将高氯酸盐还原成c 1 0 3 。、 c 1 0 2 - 直至c 1 。 早期，曾认为高氯酸盐的生物还原是被硝酸盐还原酶所催化的，因为高氯 酸盐的生物还原和硝酸盐的生物还原具有相似的途径。然而，后来的研究表明 许多可以还原硝酸盐的微生物并不能还原高氯酸盐。目前，人们对高氯酸盐的 生物还原途径已经有了相当清楚的认识。高氯酸盐还原酶位于微生物的细胞周 质空间，为一个高氯酸盐降解的酶系统。这个酶系统中有两种酶在还原高氯酸 盐的生化途径中是至关重要的，一个是高氯酸盐还原酶，这种酶的作用是催化 高氯酸根得到电子经氯酸根转化为亚氯酸根；另一种酶是亚氯酸根歧化酶，这 种酶的作用是催化两个亚氯酸根之间的歧化反应，使其转化为氯离子并放出氧 分子，但释放出来的氧分子会在微生物的呼吸作用中被消耗掉，并不会释放的 细胞外环境中【5 2 53 | 。 高氯酸盐还原微生物大都对生长环境的p h 要求较为严格，一般需要生长在 p h 为6 0 到8 5 的环境中，同时对温度的要求一般比较宽松，生长温度的上限可 达4 0 。 目前，还没有专门只使用高氯酸根作为唯一电子受体的微生物的报道。已 知的高氯酸盐还原微生物都可以利用除高氯酸根以外的替代性电子受体，如0 2 、 c 1 0 ，。、n 0 3 - 等，并且当高氯酸盐同这些替代性电子受体同时存在时，微生物通 常更倾向于利用这些替代性电子受体。已有的研究显示，在微生物还原降解高 氯酸盐的过程中需要保持无氧环境。这是因为高氯酸盐还原酶对氧分子及其敏 感，氧气的参与会同高氯酸根竞争电子，从而使电子最终流向氧分子而不是高 氯酸根。 在高氯酸盐的生物化学还原过程中，根据微生物还原高氯酸盐所用电子供 体的不同，可以将高氯酸盐还原过程分为自养还原与异养还原两类。自养高氯 酸盐还原过程是指微生物利用碳酸盐等无机物做为生长所需碳源，并利用h 2 、 h 2 s 等无机物做为电子供体还原高氯酸盐。异养高氯酸盐还原过程是指微生物利 用有机物，如多种糖类、醇类等作为生长所需的碳源及还原高氯酸盐的电子供 体还原降解高氯酸盐。 7 第一章绪论 作为电子供体，有机物通常要比无机物更有效率，能为微生物提供更多的 能量促进其降解高氯酸盐。但对于地下水中高氯酸盐污染的原位修复来讲，采 用微生物异养还原的方法需要向地下水中投加额外的有机物作为电子供体，这 些有机物在地下水的无氧环境中会被微生物发酵产生多种有毒物质，引起地下 水环境的二次污染。同时，过多的有机物投加会引起地下水中包括病原菌在内 的微生物的大量繁殖，导致饮用者的身体健康受到威胁。因此，在进行地下水 高氯酸盐污染原位修复的过程中，必须采用无机自养还原的方式。目前，氢气 作为一种容易被自养微生物利用的电子供体己被用于地下水污染的原位修复 中。有报道显示，一种脱高氯酸盐单胞菌属可以以h 2 浓度为5 的混合气体作 为电子供体及无机碳源，降解掉溶液中3 0 3 9 的高氯酸盐。使用氢气作为电 子供体可以克服地下水中微生物的过度繁殖及二次污染等问题，且经济成本也 比使用甲醇、乙醇等有机电子供体要低。但同时也面临着一些实际应用上的难 题，如氢气在水中的溶解度很低，这会造成大量的氢气在地下水原位修复中会 被浪费掉，同时，氢气在空气中极易爆炸，给使用带来了很大的安全隐患。 近年来，使用零价铁为微生物提供电子降解水体中的高氯酸盐有了一些研 究，零价铁在水体中腐蚀产生的氢气可以被微生物用作还原高氯酸盐的电子供 体。有研究显示，使用零价铁作为厌氧高氯酸盐还原微生物的电子供体，在静 水停留时间为2 d 、l d 、1 2 h 时均可以将生化反应器中1 0 0 0l ag l 的高氯酸盐完全 去除。而单独使用零价铁粉，在常温非生物反应下几乎观察不到对高氯酸根的 降级或吸附，只有在较高温度时才表现出还原高氯酸盐的明显效果【5 8 1 。 第三节微生物固定化技术及保藏技术 1 3 1 微生物固定化技术概述 在水体污染的生物修复过程中，通常都会面临水体中微生物的生物量不足、 密度不高及易流失等问题，这些问题严重影响了水体污染修复的效率。为有效 解决这一难题，在水体污染的生物修复中普遍采用了微生物固定化技术，也叫 细胞固定化技术。目前，常用的微生物固定化技术有吸附法、交联法、包埋法、 生物膜法及微生物干燥固定法等。 其中，包埋法是目前应用最广泛的一种微生物固定化方法，是一种使用凝 8 第一章绪论 胶类物质将微生物包埋在其内部的方法。这种方法使用方便，可较大程度的保 持微生物的活性。所使用的凝胶主要有海藻酸钙、明胶、聚丙烯酞胺等天然高 分子有机化合物，这些凝胶类物质一方面可以固定住内部的微生物，另一方面 可以起到类似半透膜的作用，使水体中的污染物扩散进凝胶内部而被微生物降 解。已有采用海藻酸钙固定微生物对水体进行反硝化处理的报道，研究显示该 方法可将浓度为2 0m g l 的硝酸盐完全去除，并且在连续两个月的反应中一直保 持较高的处理效率。此外，也有利用包埋法处理水体中的重金属离子、农田废 水、印染废水的报道，均表明这种方法对水体污染具有较好的处理效果。采用 交联法固定微生物比包埋法更稳固，这是因为交联法采用的是将交联剂同微生 物细胞膜表面的某些位点进行反应共价键合，常用的交联剂包括甲苯二异氰酸 酯、戊二醛等。由于交联法会改变微生物细胞膜的形态，因此易造成微生物细 胞破裂而死亡，尤其对某些细胞膜结构特殊的微生物的活性影响更大。使用交 联法固定微生物的关键是选择合适的交联剂类型及浓度，及交联反应发生条件 的优化，使其尽可能降低对微生物活性的影响【5 蛐3 1 。 1 3 1 1 基于生物膜的微生物固定化技术 生物膜( 图1 ) 是微生物群体通过分泌糖类、脂类、蛋白质等有机物将自身 包裹在一起并覆盖在固体材料表面的膜状共生体，细胞膜主要由活细胞、死亡 细胞、微生物胞外分泌物及某些无机物构成。有研究称，自然界水体环境中的 大多数微生物都存在于生物膜中，而生物活性的9 0 估计是发生在生物膜中的。 生物膜可以为微生物提供一个相对稳定且适宜的生长环境，对抵抗环境变化对 微生物造成的危害很有帮助。 通常，微生物群体在水体中形成生物膜需要几个阶段。第一个阶段中，微 生物通过自身运动、随水流漂动等传输方式同固体表面接触附着，在这个过程 中微生物同材料之间主要依靠分子范德华力、静电力等较弱的吸引力相结合， 因此结合力不强，很容易被水体的剪切力冲离固体表面。到了第二个阶段，微 生物大量分泌胞外分泌物，这些胞外分泌物可以粘附在固体材料表面，并包裹 住微生物或通过某些化学基团同微生物细胞膜进行共价键合。通过胞外分泌物 的粘附作用，微生物细胞被牢牢的固定在固体表面，一般不易再被水流冲走。 到了第三个阶段，生物膜进一步发育成熟，表现为生物膜内的生物量及膜的厚 9 第一章绪论 度增加，生物膜结构的复杂程度进一步增加，形成多重膜，膜内不同类型的小 生态环境开始出现，包括厌氧区、好氧区等。这个阶段的生物膜是整个生物膜 发育阶段中活性最大的阶段。到了第四个阶段，由于生物膜的不断增厚，水体 中的营养物质在生物膜中的传质过程越来越缓慢，最底层粘附在固体表面的那 部分区域由于难以从水体中获得足够的营养物质而逐渐失去生物活力，生物膜 同固体表面的结合力也逐渐降低，当这种衰减达到一定程度时生物膜就会被水 流的剪切力冲离固体表面。 利用微生物可在固体材料表面自发形成生物膜的特性，人们在废水处理领 域设计了一些微生物固定化技术。目前，生物膜固定化技术广泛的应用于多种 水体污染物的修复中，使用的污水处理装置有生物塔滤池、生物接触氧化法、 厌氧滤器、厌氧流化床等m 嘲j 。 a t t a c h m e n t ( a d h e s i o no fa f e wc e l l st oa s u i t a b l es o l i d s u d a c e ) c o l o n i z a t i o n ( i n t e r c e l l u l a r c o m m u n i c a t i o n ， g r o w t ha n d p o i y s a c c h a “d e f o r m a t i o n ) d e v e l o p m e n t ( m o r eg r o w t ha n d p o l y s a c c h a r i d e ) 纛戮鬻鬻鬻鬻 攀雾篱鬻纛菱雾蘩i 缀i 麓麟溪鬻 纛飘 鬻瀵慧萋鬻鎏黍攀攀囊鬓爹 鬻蕤鋈鞭l 鬻戮鬻蕊鬻戮辇薹，黎 鬻：鬟鼋；鬻i i 1 | 鬻藜鬻 i ：i 戈毒z ；o & 。，：? 参矗：飞i 墨j i 鬻 s u r f a c e ( a ) 1 0 第一章绪论 ( b ) 图1 生物膜。( a ) 细菌生物膜的形成。生物膜起始于少数细胞的附着，然后生长并发生细 胞通讯联络，当生物膜生长时多糖形成并变得更广泛；( b ) 被d a p i 染色的不锈钢管上形成 的生物膜显微照片。 1 3 2 微生物传统保藏技术概述 不同于动物，微生物可以在缺乏营养物质的环境中以新陈代谢几乎停滞的 状态存活很长时间。人们利用这一特点发展了微生物保藏技术，主要目的是在 防止菌株发生突变的情况下长时间保存筛选出的微生物菌株。在微生物的保藏 过程中，采用技术手段降低微生物的新陈代谢活动是关键，根据微生物的生理 特点，常采用人为设定低温、干燥、隔绝空气等环境来实现对微生物新陈代谢 的抑制。 目前，已开发成型的微生物保藏技术有很多种，主要包括斜面低温保藏法、 液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、冷冻干燥保藏法等。 斜面低温保藏法和液体石蜡保藏法都是首先在斜面试管内于合适的培养基 上对欲保藏的微生物进行培育，使其在培养基上大量生长繁殖。在采用斜面低 温保藏法时，直接用无菌橡皮塞将长满微生物的斜面试管塞住并用蜡烛封口， 然后放置在0 4 。c 的环境下保存即可，为维持保藏效果，通常需要每2 4 个月对 保藏的微生物进行移植转管。这种方法方便易行、成本低，是目前最常用的菌 种保藏方法之一，但由于需要经常传代移植，所以保藏时间不能太长，通常可 第一章绪论 为3 代以内的菌种进行保藏。在采用液体石蜡保藏法时则是先将石蜡油在压力 为1 5 k g c m 2 的高压灭菌锅中灭菌3 0 m i n ，然后放置在4 0 。c 的恒温箱内，待石蜡 油中的水分蒸发完毕而呈完全透明态后使用。使用时采用无菌吸管吸取适量石 蜡油滴进长满微生物的斜面试管中，石蜡油的用量要高出斜面上端1c m ，以使 试管中的微生物同空气完全隔开。之后使用无菌棉塞塞住试管口并用牛皮纸包 裹好，放置于o 4 的环境中低温保藏。沙土管保藏法和冷冻干燥保藏法不是对 生长在培养基上的微生物进行保存，而是将培育好的微生物菌体悬液滴加在灭 菌沙土或安瓿瓶上。在沙土管保藏法中，先将4 0 目的粗砂洗净、烘干，同时另 取不含腐殖质的土壤在清水中浸泡至中性，而后烘干、过筛( 1 0 0 目) 。将处理 好的粗沙砾和土壤以大约2 ：l 至4 ：l 的比例混合均匀，以每管1 9 左右的重量将 沙土分装进试管，加塞灭菌。经无菌检验合格后将待保藏的菌种悬液0 5 m l 滴 加在沙土上，然后在放有干燥剂的真空干燥器内抽真空干燥。这种方法多用来 保存能产生孢子的微生物，可保存的时间较长。在冷冻干燥保藏法中，先将安 瓿瓶于2 的盐酸溶液中浸泡1 0 1 2 h ，用蒸馏水冲洗至p h 值呈中性后干燥灭菌。 然后在微生物菌体悬液中加入血清、脱脂牛乳、海藻糖等合适的保护剂制成待 保存的菌液，滴加进安瓿瓶里并置于低温冰箱内冷冻。将冷冻好的安瓿瓶放进 冷冻干燥箱内，抽真空8 - 2 0 h 进行干燥后于真空状态下熔封安瓿瓶，最后置于2 0 的环境中保存。冷冻干燥保藏法是目前菌种保藏法中保藏时间最长的方法， 尤其适合保藏一些难以保存的微生物，一般可保存十余年1 6 乩7 1j 。 1 3 2 1 微生物干燥保藏技术 微生物干燥保藏技术是传统微生物保藏技术的一种，以将微生物置于干燥 环境中的方式降低微生物的新陈代谢速率，达到长期保藏微生物的目的。目前， 微生物干燥保藏技术被广泛的用于食品工业、药品工业等多个领域，在食品工 业中具有代表性的例子是活性干酵母，它是酵母菌与淀粉等造粒物质经挤压成 型和干燥制成的，其中的酵母菌具有生物活性。微生物的干燥过程分为冷冻干 燥和常温干燥，通常的干燥保藏过程如图2 所示。 微生物干燥保存技术的关键是尽可能提高微生物在干燥环境中的存活率， 这通常需要选择合适的干燥保护剂。微生物在干燥环境中受到的最大威胁之一 是细胞膜上蛋白质结构的改变。在水环境中，水分子和细胞膜上的蛋白质分子 1 2 第一章绪论 之间形成许多氢键，这些氢键是蛋白质保持合适结构的关键，而蛋白质只有保 持合适的构型才能发挥正常的生理作用，因此微生物在干燥的环境中很容易因 为细胞膜上蛋白质构型的改变而失去生物活性。研究发现，果糖、蔗糖、海藻 糖等糖类对微生物在干燥环境中的生存具有一定保护作用，这是因为在干燥的 环境中糖类可以部分代替水分子的作用，同微生物细胞膜上的蛋白质之间产生 氢键，帮助其保持合适的结构以维持生物活性。目前，海藻糖被认为对微生物 的干燥保存具有较好的保护作用。有研究显示，一种名为l a c t o b a c i l l u ss a l i v a r i u s s u b s p s a l i v a r i u s 的乳酸菌，若在没有加入保护剂的情况下进行冷冻干燥会有超 过9 9 的菌量在干燥后死亡，而在加入海藻糖和脱脂牛乳做保护剂的情况下， 冷冻干燥后有8 3 8 5 的菌量可以存活。单独使用海藻糖时也有超过3 0 的存活 率，远超过单独使用蔗糖时的约1 5 的存活率及单独使用脱脂牛乳时约2 0 的 存活率。 经长时间干燥保存的微生物在使用前需要进行复壮，通常选择营养丰富的 有机培养基对菌体进行复壮，常用的有1 0 脱脂牛奶、1 0 葡萄糖溶液、蛋白胨 牛肉膏培养基等。微生物菌体复壮时要选择合适的温度，有研究发现在1 5 2 5 f 微生物的可复壮菌体数最多，在3 5 4 5 。c 下可复壮的菌体数较少但细胞的生 长速度更快【7 2 74 1 。 第一章绪论 微生物培养 茵液同干燥保护剂混合 ( 在冷冻干燥时需要预冷冻) o 干燥过程 0 保藏 0 复壮 0 应用 图2 微生物干燥保藏过程 第四节研究目的和内容 目前，利用零价铁在水体中的腐蚀产氢为自养微生物修复水体中的某些氧 化性污染物提供电子的思路，已经得到了广泛的研究和认同。研究表明，零价 铁产氢供给微生物的污染修复方式不会向水体中引入在生物修复领域通常需要 投加的有机物，因此不会刺激水体中微生物的过量繁殖，避免了水体修复过程 中水质的二次污染问题。特别是零价纳米铁所具有的超高化学反应活性及在地 下水体中较高的迁移性，使得零价纳米铁成为为地下水体修复中的微生物提供 电子供体的理想材料。但是，目前已有的研究都是将零价铁与微生物分开使用 1 4 第一章绪论 的，即向水体中分别投加零价铁与微生物，或者只投加零价铁而依靠环境本底 中的微生物。在地下水污染的原位修复中，以上这种将零价铁与微生物分别投 加的做法面临许多不足和问题。一方面，在地下水流动的环境中，微生物同纳 米铁的迁移速度不同，如果使二者分开投加则会引起微生物同纳米铁的逐渐分 离，从而因微生物无法利用纳米铁腐蚀产生的氢气而失去降解污染物的效果； 另一方面，地下水环境中的微生物含量极少，如果只投加零价铁而不投加微生 物则会因水体中微生物量过少而影响污染物的修复效率【7 5 i 。 为解决以上问题，本研究设计了一种将零价纳米铁同微生物结合在一起， 做成微生物纳米铁复合材料的实验思路。通过选取适合降解目标污染物的微生 物，可以进一步强化微生物纳米铁复合材料在修复水体中特定污染物中的效果。 通过参考大量同微生物固定化技术相关的文献，结合纳米铁及地下水环境的特 点，确立了两种微生物纳米铁复合材料的制备方案，并通过实验研究了这两种 复合材料在模拟地下水体环境中修复污染物的特性。 首先，生物膜法是一种在污水处理中常用的微生物固定化技术。基于此， 本文尝试了用生物膜法制备了微生物纳米铁复合材料，并研究了其处理地下水 中的硝酸盐污染的特性，为制备适合实际应用的纳米铁一微生物固定化复合材料 提供了一种思路。 其次，传统的微生物固定化技术利用天然或人工凝胶类物质将微生物胶连 在一起，然后直接投入到水体中用于污染修复。然而，这种固定化技术并不适 合将微生物同纳米铁固定在一起 7 ”8 1 。这种充满水的固定化凝胶对纳米铁的保 存很不利，因为纳米铁在有水的环境中遇氧极易被氧化，而且纳米铁本身在水 中也会由于发生电化学反应而被腐蚀，无法长期保存，也就难以实现大规模的 工业化生产。传统的微生物干燥保存技术可以实现微生物在干燥环境下的长期 保存，将这种技术用于纳米铁与微生物的固定化复合材料的制备，能够使复合 材料中的零价纳米铁处于干燥环境中。在干燥环境中的零价纳米铁不易被氧化 及腐蚀，可以实现将整个复合材料在空气中长期保存，使工业化生产纳米铁- 微 生物固定化复合材料具有了可能性【7 9 培1 1 。本文对利用琼脂做纳米铁微生物固定 化干燥复合材料的媒介物质进行了研究。琼脂是一种聚糖