实验四、 P C R产物的 T载体克隆和转化ppt课件.ppt

医用分子生物学实验技术 青海大学医学硕士研究生课程 重组DNA技术操作步骤 基本原理 主要步骤 制备目的基因和选择相关载体 目的基因和有关载体进行连接 重组的DNA导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增 表达和其他研究 以质粒为载体的DNA克隆过程 三 PCR扩增特定基因 四 人工合成 一 目的基因的获得 分 一 从基因组文库中获得 二 从cDNA文库中获得 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 从cDNA文库获取目的基因 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 几种常用克隆载体的比较 注 表示可用 表示不可用 比较内容质粒 噬菌体黏性质粒M13噬菌体克隆容量 10kb 22kb40 50kb 1kb基因组DNA文库 cDNA文库 亚克隆 序列分析 E coli表达 二 载体的选择与准备 选 三 DNA分子的体外连接 接 一 黏性末端 二 人工接头的使用 三 加入同聚体尾 四 平端连接 一 黏性末端 二 人工接头 三 加入同聚体尾 待克隆DNA片段 重组质粒 混合 退火 空白质粒 四 平端连接 载体DNA 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5 3 T T nT T T nT3 5 3 A A nA A A nA 核酸外切酶 核酸外切酶 末端转移酶 dATP 末端转移酶 dTTP 5 3 5 四 外源DNA导入宿主细胞 转 受体菌条件 安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态 competent 导入方式 转化 transformation 转染 transfection 感染 infection 外源基因导入宿主细胞后 筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增 所用的方法主要有遗传学方法 免疫学方法 核酸杂交法 PCR等 五 目的基因的筛选和鉴定 筛 1 借助载体上的遗传标志进行筛选 1 利用抗生素抗性标志筛选 2 利用基因的插入失活 插入表达特性筛选 3 利用标志补救筛选 4 利用噬菌体的包装特性进行筛选 2 序列特异性筛选 1 RE酶切法 2 PCR法 3 核酸杂交法 4 DNA测序法 2019 12 19 21 可编辑 一 遗传学方法 1 插入灭活法 插入失活筛选带有重组载体的克隆 2 蓝 白筛选 互补 许多载体 如M13系列 pUC系列 pGEM系列 都含有 半乳糖苷酶基因 lacZ 的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列 这个编码区中插入了一个多克隆位点 这种载体适用于可编码 半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞 宿主和载体编码的片段各自均无酶活性 但它们可以互补形成具有活性的 半乳糖苷酶 使人工底物X gal转化成蓝色的代谢产物 出现蓝色的菌落 如果在多克隆位点上插入外源DNA片段 将使lacZ基因灭活 不能生成有活性的 半乳糖苷酶 结果菌落呈现白色 互补筛选 蓝 白筛选 PCR产物的T载体克隆和转化 实验目的 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法 实验要求 掌握利用T载体克隆PCR产物的方法 复习连接实验流程 技术应